分析方法在特征参数在水中细菌的多波长传输光谱

文摘

一种分析方法与米氏散射理论和比尔-朗伯定律提出了细菌细胞的特征参数确定(大肠杆菌10389)从多波长传输光谱测量。我们计算的结构参数大肠杆菌细胞,与显微镜相比,细胞体积的相对误差是7.90%,细胞数与平板计数法所得结果相比,相对误差是l。02%,单一的核酸含量和蛋白质含量大肠杆菌细胞报告的数据是一致的。该方法可以获得细菌的特征参数作为一个优秀的候选人在水中细菌的快速探测和识别。

1。介绍

不同种类的细菌有不同的水体污染程度;因此,确定细菌的特性和浓度在水里扮演着一个重要的角色在保证饮用水的安全。大肠杆菌是一种原核生物在人类和其他动物引起腹泻,这是一个重要指标细菌在环境水质监测和食品安全1- - - - - -4]。

目前,现有的浓度检测方法和物理结构和成分特征的细菌,如隔离和文化(5- - - - - -7,免疫学8,9],核酸杂交[10),聚合酶链反应(11,12),和蛋白质芯片的技术(13),提供精确的结果,但仍存在一些局限性等现有的复杂操作,分析时间长。为了实现快速检测细菌,等光谱技术,荧光(14- - - - - -16)、红外(17- - - - - -19),和拉曼20.- - - - - -23),也被用于细菌的特征参数的确定。相关的缺点与光谱学技术包括仪表的高性能要求,无法提供详细信息的结构和成分特点的细菌细胞。

多波长传输光谱是一种新开发的技术特征的悬浮粒子,它测量捕获光衰减测量粒子的散射和吸收,并提供信息的物理和化学特性的粒子。多波长传输光谱法有许多优点,如操作简单,没有反应试剂,nondamage,快速测量,特别是和可以获得的多个参数测量细胞。这种技术已经被证明是敏感的人类血液细胞的特征(24,25],藻类细胞[26,27),原生动物细胞(28),和细菌细胞(29日]。

几种常见细菌的鉴定方法的光谱分析报告,然而,大多数方法需要报道,瑞利散射被认为先天的或multiangle-scattering频谱被探测到的(30.,31日]。

在本文中,我们提出了一种新的光谱特征的方法大肠杆菌多波长透射光谱。这是表明,细胞大小,定量信息,核苷酸和蛋白质含量大肠杆菌可以估计。这些特征参数可以有效地用于快速识别和检测大肠杆菌在水供应。

2。方法

2.1。米氏理论

根据米氏理论,原核生物的浊度范围是定义了一个假设的单分散球形细胞群 在哪里细胞的数量,路径长度,波长在中,D对应于细胞的平均直径, 是消光效率,它是一个函数的细胞大小、波长和细胞的折射率比介质。

如果细胞吸收的介质可以忽略不计,消光效率等于散射效率

假设生物细胞是近似均匀的球形粒子,散射系数从严格的米氏理论计算给出的(32]: 一个无量纲的粒子大小在哪里一个等于 和米细胞的折射率比吗介质的折射率 ,在哪里是水的折射率33]。米氏系数和复杂的函数吗一个和米(32]。 在哪里semi-integer阶贝塞尔函数和吗是第二种汉高函数。

2.2。比尔-朗伯定律

如果散射测量细胞的影响可忽略,造成的光强度下降只是吸收细胞的化学成分。根据比尔-朗伯定律,吸光度是写成的 在哪里一个测量吸光度,对应于一个wavelength-dependent吸收系数,c化学成分的浓度,是样本路径长度。显然,如果吸收系数和路径长度是已知的,(4)可用于估计化学成分的浓度。

3所示。实验和材料

3.1。菌株和样品制备

大肠杆菌(中金公司10389号)从中国获得工业文化中心集合(中金公司)。细菌悬液是由激活细菌,培养在37°C在牛肉膏蛋白胨培养基(pH值7.0)包含0.3%牛肉膏、蛋白胨1%,0.5%氯化钠和2%的琼脂,扩大文化传播的解决方案,使离心的离心机(h - 1650,江东的乐器),并在消毒去离子水洗涤。

3.2。光谱测量

多波长的透射光谱大肠杆菌记录由紫外/可见分光光度计(UV 2550日本岛津公司,日本京都)在该地区从230年到820海里。仪器记录的光谱代表3复制测量与1海里的平均采样间隔。消除悬浮介质的不均匀性的影响,消毒去离子水作为参考的解决方案。所有尺寸都是使用一个腔长1厘米在室温下石英比色皿。

3.3。平皿计数法

细胞悬浊液(1毫升)与9毫升消毒去离子水稀释获得连续稀释(10⁻¹−10⁻⁹从细菌悬浮液。每个稀释溶液(1毫升)的吸管和营养琼脂培养基在45°C注入无菌盘。这些盘子是孵化在37°C / 24 h和CFU计数(13]。

3.4。细胞的大小

被革兰氏染色观察细胞大小和石油显微镜(奥林巴斯,CX41),大肠杆菌细胞被视为椭圆体。使用下列公式计算细胞体积(V从宽度),(w)和长度(l)的细胞: 。细菌的长度和宽度计算通过20个细胞的平均长度和宽度测量,测量。

4所示。结果与讨论

4.1。实验结果

多波长的透射光谱大肠杆菌在该地区从230年到820海里文化16小时后如图所示1;横坐标代表波长和纵坐标代表光密度。400年和820年之间的光谱波长地区纳米轻轻变化没有明显的吸收峰,这主要是表明细胞及其内部结构的散射,并反映差异数量,大小和细胞的内部结构。光谱在该地区从230年到400海里似乎显然比前者更强烈,这不仅包括细菌的散射信息,但也吸收信息。注意到的光谱大肠杆菌肩峰在260纳米左右,这是由于吸收引起的化学成分大肠杆菌。

4.2。光谱分析:散射组件

折射率的变化与线粒体和质体的存在大肠杆菌。因此,细胞分为两个结构组:胞体和内部结构34]。

细胞的折射率的身体大肠杆菌是由(35]

和内部结构(31日),

在该地区230至820海里,大小分布的方差光密度(几乎没有影响25];因此,如果吸收可以忽略不计,散射光谱的光密度(1)可以改写: 在哪里细菌浓度,是散射路径长度,和散射系数的宏观结构和内部结构的细菌,分别。和等效直径的宏观结构和内部结构的细菌,分别。

在光谱测量细菌浓度不易控制;为了准确计算的宏观结构和内部结构的直径细菌,测量光谱归一化的总光密度在230到820纳米之间。

在该地区从400年到820海里,没有发生吸收,这些光谱主要来自于细胞悬液的散射。因此,从理论上说,这个地区的实测光谱(400 - 820 nm)大肠杆菌可以计算(7),这是一个选择的结构参数的函数大肠杆菌。通过一个非线性最小二乘优化算法,归一化光谱测量在400 - 820纳米波长范围由计算拟合光谱(7),计算出的光谱迭代直到相对变化的平方和小于10⁻⁸。拟合结果如图所示2,显然表明良好的测量和计算谱之间的协议。平均相对误差为0.70%,最大相对误差为2.79%。很明显,计算光谱可以表示测量光谱的散射特性。

从散射光谱的分析,表1显示的结构参数大肠杆菌包括细胞体积、平均直径、直径、内部结构和内部结构的贡献,数据从显微镜方法也被包括在内。可以看出,平均直径大肠杆菌是1.4777μ米,为了与显微镜分析。假设一个细菌细胞球形,计算细胞的平均体积是1.6899μ米³,这是在良好的协议与显微镜的结果分析(相对误差是7.90%)。

显然,当入射波长是固定的,实测光谱与单个细菌细胞光谱线性关系。因此,测量光密度的情节,作为单个细菌光密度的函数结构参数的计算表1,如图3,测量光密度是安装使用线性方程: 在哪里一个和b拟合参数,结果是什么一个= 35066882.23,b=−0.0001714441807,相关系数= 0.9998,表明这些数据拟合方程。细菌浓度计算使用公式 ,在那里 。与细菌浓度从板计数,获得相对偏差计算 是1.02%,板计数的观测,给出表吗2。

4.3。光谱分析:吸收组件

知道的结构参数和细菌浓度大肠杆菌的散射光谱计算(7);组件吸收光谱在230 - 820纳米波长范围计算,减去散射光谱测量的透射光谱图4。也,注意吸收组件有很强的峰值在该地区230至300海里,这是由于吸收化学成分造成的大肠杆菌。因此,吸收的光谱特征分量在该地区230至300海里可以用于测定化学成分参数的目的。

大肠杆菌是一个典型的革兰氏阴性、nonspore杆状细菌,其主要化学成分是蛋白质和核酸(大约80%的细胞干重),它的次要成分,碳水化合物(8.4%)、脂质(9.1%),和辅酶(2.5%)36,37]。微生物的化学成分,如蛋白质,核酸,吡啶二羧酸,在紫外线的吸收中起着重要作用[38]。图5显示了一个比较核酸的吸收系数,发色团的氨基酸,和吡啶二羧酸加权的典型浓度和波长。

为了准确计算细菌的化学成分含量,核酸和蛋白质的比例判断。图4显示了组件吸收光谱的光密度。知道OD_280年= 0.1065,OD_260年= 0.1338,OD_280年/ OD_260年= 0.7960,这一比例在0.5和1.8之间显然表明,核酸和蛋白质的化学成分存在于细菌中。

有20种氨基酸组成的蛋白质在生物体,其中大多数没有吸收230 - 310 nm波长范围;只有芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)吸收250 - 300 nm地区和其最大吸收波长在280 nm (20.]。核酸核糖和磷酸没有吸收紫外线的地区;然而,嘌呤和嘧啶基地与共轭双键系统有很强的吸收250 - 280 nm波长范围39]。因此,光谱波长地区在250年和300纳米之间,这是最强的核酸和蛋白质的吸收带,可以分析测定核酸和蛋白质的浓度。

根据比尔-朗伯定律,在固定波长的光密度正比于细菌的化学成分的吸收系数。的组件大肠杆菌是复杂的,除了核酸和蛋白质吸收的光,其他组件有一些影响光密度。吸光度组件的光密度大肠杆菌可以表示为 在哪里和核酸和蛋白质的吸收系数,分别。和分别是核酸和蛋白质的浓度。是一个常数,它的光学密度生成的其他组件。

吸收光谱在250 - 300纳米波长范围计算,后(9)。显然,多元线性回归分析方法用于核酸和蛋白质含量的测定。如图6,吸光度组件光学密度可以写成 在核酸含量 和蛋白质含量 ,相关系数为0.98786,表明这些数据是由(10)。

的蛋白质和核酸含量计算了单个细菌核酸的内容 ,蛋白质含量 ,和细胞数量 ,下表2。

显示在表2核酸的量估计为7.1335×10⁻¹⁴g /细胞,这几乎是一样的在文献中报道的价值(7.0×10⁻¹⁴,(40])。此外,蛋白质含量估计肯定是值的范围内发表在文献[41),得到完全不同的方法。这意味着大量的核酸和蛋白质大肠杆菌可以用获得的解释光谱吸收组件。

为了验证该方法的重复性,同样的大肠杆菌细胞悬液,三个测量光密度谱(230 - 820 nm)收集(图7);根据分析,提出几个参数计算表3,他们的相对标准偏差(RSD)小于5%。低相对标准偏差值提供证据表明,方法具有较好的精度。

5。结论

我们提出一个新的方法来获取平均尺寸,数量,和化学成分大肠杆菌细胞多波长透射光谱。根据分析散射光谱的波长范围从400到820纳米,结构参数大肠杆菌可以获得;与显微镜相比,细胞体积的相对误差为7.90%。通过线性拟合获得的细胞数量;板计数相比,细胞数量是l.02%的相对误差。的吸光度成分光谱的波长范围从250到300海里进一步分析基于比尔-朗伯定律;组成核酸和蛋白质的信息内容,同意文献报道值大肠杆菌。很明显,多波长传输光谱有可能获得准确信息的数量和细菌细胞的结构和成分特点,它提供了一种简单、快速而准确的方法检测和预警的细菌在水里。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了安徽省自然科学基金(1508085 jgd02和1508085 qf137号),安徽省科技重点项目(没有。15 czz04125),中国国家自然科学基金(没有。61378041也没有。61705237)。

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