文摘

峰分裂由于剩余偶极耦合(RDC)代表一个潜在的适用的光谱参数诊断的目的。几个骨骼肌代谢产物以前报道显示RDC分裂在活的有机体内光谱先生。我们构造了一个在体外模型组成的机械拉伸明胶缸浸泡与肌肉代谢产物肌肽。我们描述一个高档的制备过程50毫升拉伸与肌肽凝胶样品可以用作建立和测试一个幽灵的光谱测量RDC磁共振扫描器。我们还RDC分裂的分析报告¹H和¹³肌肽C高分辨率光谱先生。

1。介绍

峰分裂由于剩余偶极耦合(RDC)是一种磁共振(MR)光谱参数可能是适用于诊断的目的。直接偶极耦合在软物质或组织通常是平均为零的分子取向的快速变化。少量剩余的一部分,这种交互是恢复如果环境是各向异性。诱导峰分裂是常见的附加耦合。这样的RDC剥片观察尤其是¹H光谱从骨骼肌和峰值显示将被分配到肌酸、牛磺酸、肌肽(1,2]。RDC的主要应用源于观察到分裂的事实结合张量有关,量化各向异性组织的能力来增强某些观察分子的取向对外部磁场的方向。一些肌肉组织的结构或结构属性rdc的可以显示测量结果。

rdc成为一个重要工具测定生物大分子的三维结构,最近,小的刚性有机分子。评论,请参见[3- - - - - -5)和引用引用。感兴趣的物种被放置到下各向异性介质在体外条件。有两个主要的方法调用示例中的各向异性。第一个是基于使用液体结晶介质(如bicelles),成为面向的磁场核磁共振(NMR)谱仪。第二种方法依赖于机械应变诱导到聚合物凝胶浸泡的解决方案感兴趣的物种。

在本文中,我们报告一个幻影有用的准备建立和测试测量RDC磁共振扫描器。它是基于明胶凝胶浸泡与肌肽(图1),是一种肌肉代谢产物,RDC的观察在活的有机体内光谱先生以前报道(6,7]。作为第一步,我们准备了一个小样本的高分辨率核磁共振谱仪使用一个变量凝胶拉伸器被Kummerlowe et al。8]。我们发现了可衡量的两,三批公债¹H -¹H RDC分裂,特别是一个键¹H -¹³C RDC分裂。第二步,我们准备了一个高档样本的大小允许测量层析x射线摄影机先生。我们还观察到分裂的描述分析的三个样品机械拉伸明胶。

2。材料和方法

2.1。样品制备

样本准备使用明胶类型从Sigma-Aldrich,肌肽(β-alanyl-L-histidine)记述有机物和氧化氘Armar化学物质。微量的叠氮化钠Sigma-Aldrich添加到样品抗菌保护。

特殊核磁共振管为变量设置拉伸的凝胶组成的5毫米外径(OD)玻璃NMR管开放两端和硅管4毫米OD配件到玻璃管被用于高分辨率核磁共振测量(8]。nonstretched样本体积约0.15毫升(20 - 25毫米长,直径3毫米)。

高分辨率核磁共振,三个样品凝胶浓度为20%,30%,40%的人准备原料明胶和0.5摩尔dm的混合物⁻³解肌肽在氘H₂d O(90%)。最初的混合物加热到70°C到同质液体。然后在水浴冷却混合物。刚性凝胶凝胶转移到硅的玻璃漏斗管连接。明胶又融化了使用热风机和左陷入硅管,而任何泡沫形成的凝胶融化是分离的。硅管由聚四氟乙烯塞封闭的底部和顶部封口膜,再插入一个水浴温度50°C为了摆脱任何剩余的泡沫。避免泡沫样品大大提高核磁共振测量的磁场均匀性。样品在水浴冷却到室温。样品的各向异性是调用硅管内部的NMR管延伸至120%,140%,和130%的原始长度的20%,30%,和40%的明胶凝胶样品,分别。少量肌肽的解决方案是添加在凝胶以最小化由于水蒸发的长期变化。

制备技术进一步发展,以产生更大的幽灵可能用于层析x射线摄影机先生。大约55毫米长圆柱体与30.5毫米内径30%明胶浸泡0.2摩尔dm⁻³肌肽溶液制备的方式类似于制备高分辨率核磁共振的样本。同质凝胶缸转移到50毫升塑料离心管27毫米内径,导致最后130%的原始大小的长度。为了方便转移,明胶放入一层薄薄的橡胶软管。定制的塑料漏斗润滑与明胶甘油被用来转移到离心管中。启用了乳胶软管的一定程度的伸展,明胶在插入过程中为了防止其破坏。迫切的需要在胶缸可以最小化。

2.2。测量

高分辨率核磁共振光谱测量的力量皇冠光谱仪操作在11.7 T (500 MHz¹H, 125 MHz¹³C, 77 MHz²H)使用5毫米创伤性脑损伤的探测头。我们获得各向异性明胶样品的光谱和光谱的一个免费的解决方案作为参考。普通生产率光谱的测定获得两个债券和三批公债核¹H -¹H rdc和²H剩余四极耦合(RQC)氘水。二维¹H -¹³C体育HSQC脉冲序列(9)被用来测量单键¹H -¹³C rdc。90度脉冲长度是7.5μ120年代,μ年代,和14.5μ年代¹H,²H,¹³C,分别。极化转移时期体育HSQC将对应的总耦合140赫兹,1024数据点在间接收购(¹³C)维度,和8192数据点直接收购(¹H)维度。测量自由感应衰减(fid)处理在1.3上旋。自动基线校正和手动进行傅里叶变换后的信号被应用。rdc测量不同的分裂在各向同性(耦合)和各向异性(总耦合)样品的条件。峰的分裂被评估为距离最大值的多重态组件。所有的核磁共振测量都运行在298 K的温度。

本地化和nonlocalized光谱MRI伪是力量Biospec 4.7/20操作在200 MHz¹H和50 MHz¹³c . 90度脉冲长度为100μ年代和50μ年代¹H和¹³C,分别。FID信号处理在Paravision 4.0。¹由按[H局部光谱测量10,11)脉冲序列使用以下参数:回波时间6.12 ms(1日回波时间3.78女士和第二回波时间2.34 ms)和重复的时间2500毫秒,16日平均水平。前定位序列外部卷抑制(ov)使用蒸汽和水的抑制方案12)运行总时间650毫秒。¹³C nonlocalized光谱在4096年收购了扫描。时域数据被删除修改第一个50分为了抑制一个广泛的背景信号测量探针头和样品材料的容器。谱线增宽系数¹³C信号被设置为25 Hz。

3所示。结果与讨论

3.1。各向异性样品制备

明胶被选为我们的样品的基本凝胶介质特别是由于其相当简单准备、操作和良好的机械性能,用于创建甚至大样本。最重要的财产,我们的目的是可逆加热后融化,这极大地简化了制备的样品所需的大小和形状。也足够硬从而使凝胶柱插入到容器直径的限制。测量的线性依赖rdc的拉伸率已经报道了明胶(13]。相反,其他高分子水凝胶,如聚丙烯酰胺,必须不可逆转地聚合的形式最终需要无限制的形状和随后压管的直径限制。当一个不同级别的压缩是必需的,一个全新的样品已做好准备。

明胶的空间分子结构由氢保税三重螺旋原胶原蛋白,生物聚合物的单体单元胶原蛋白。明胶是多肽和蛋白质的混合物产生的部分水解胶原蛋白提取的皮肤,骨骼和结缔组织。凝胶已被用作制备组织模仿媒介幻影成像和光谱[先生先生14),最近据报道作为小分子的合适的媒介定位在高分辨率核磁共振光谱学13,15,16]。

二肽肌肽(β-alanyl-L-histidine)被选为我们的模型样品的其他代谢产物因为几个因素。假设扩展的形状应该是导致更高程度的优先定位在各向异性介质。等分子包括刚性部分咪唑环肽键,使更好的观察RDC的前景。小肌肉中肌肽也是最大的分子代谢物,它允许检测最多的RDC的值。

3.2。高分辨率核磁共振RDC测量

在第一阶段,三个样本准备使用一个特殊的管组(5毫米OD)弹性硅管(8)适合高分辨率核磁共振谱仪(图2(一个))。为了优化这些小样本利用凝胶制备过程和使一个相对简单的检测各向异性是否对齐。

¹H高分辨率核磁共振光谱伸肌肽的明胶(图3)解决,他们包含所有肌肽峰值一致的光谱肌肽在各向同性条件下水溶液。有一种强烈的背景峰围绕0 ppm归功于硅管能够重叠之间的溶质约−0.5和0.75 ppm。其他背景峰(水除外)相比显著降低强度的肌肽的山峰。的光谱¹H自旋系统的肌肽在程序模拟gNMR v5.0.6.0 [17]。化学变化和耦合常数测定的光谱肌肽的免费的解决方案。这些值的模拟插入肌肽在各向异性条件下的光谱。通过这种方式,两个债券和三批公债¹H -¹H rdc可以确定。由于添加剂的性质和,我们发现两个理论选择值为每个三批公债耦合- hα和- hα提供相同的光谱模式(表4给出替代品的总数1)。真正的解决方案被发现通过应用一个假设的迹象值应该是相同的两双,因为他们的核间向量有类似的方向。选择的解决方案(方案1)相形见绌进一步测试的分析(见下页),这样包容各自的两个值的分析带来最小的变化获得校准张量如果比较相同的分析采用只有6集RDC值(即建立了良好声誉。(不包括的值- hα和- hα)。

我们还发现七个单键¹H -¹³C杂环的rdc(表1通过二维体育HSQC [9)实验。RDC常数()¹H -¹³C是计算的,在那里和测量得到的各向同性和各向异性(拉伸)样本,分别。

表中的数据2文档,类似大小的RDC常数相同的自旋对所有的三种不同的样品。拉伸比的主导因素影响rdc的大小。凝胶的凝胶浓度增加刚度,但对rdc的大小只有轻微影响。补充材料包含¹H和¹³C化学变化S1和S2 ppm(表在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/4596542(表),测量总耦合S3),和完整的1 d和2 d光谱(增刊。数字)各向同性和拉伸明胶样品。没有相关的系统差异¹H或¹³C不同样品的光谱之间的化学变化。测量的误差从体育的耦合HSQC光谱±1 Hz 20%明胶和±1.5 Hz 30%和40%明胶由于定向介质引起的信号展宽和拉伸。1 d¹H光谱误差±0.5赫兹是由于信号由各向异性介质背景和扩大。

²H光谱包含一个峰值的氘水溶剂分为双重由于RQC 130 Hz, 285 Hz, 189 Hz, 20%, 30%,和40%的明胶,分别。窄线宽的偶极子组件(16赫兹,34赫兹,和25 Hz 20%, 30%,和40%的明胶,resp)。确保水对齐在整个活动的体积相同的样本。²H光谱从而凝胶均匀性提供了一个简单的评估,这是完全免费的,没有任何虚假的背景。

3.3。幻影夫人准备和测量

幻影夫人描绘在图2 (b)准备按30%的汽缸明胶与肌肽溶液浸泡到50毫升聚丙烯离心管的内径27毫米。最佳凝胶凝胶浓度等参数和拉伸/未拉伸凝胶直径的比值从较小的高分辨率核磁共振样品。样本的大小而言,它允许局部测量在1厘米³盒子。

磁共振扫描器由于技术的限制,我们只能够执行1 d¹H和¹³C(图4夫人)测量。此外,高场的一部分¹H频谱遭受一个大背景信号所引起的表面线圈的利用率。低场没有任何分裂由于咪唑信号¹H -¹H RDC(数据没有显示)。后一个好经验的测量一根键杂环的rdc,我们收购了¹³C谱(¹H nondecoupled),我们可以确定两个值的杂环的RDC明确(见表2)。C的值α- hα和C5-H5是在良好的协议与数据获得30%明胶高分辨率样本。总耦合的测量误差¹³C谱估计6赫兹由于较低的信噪比。

3.4。分析了肌肽rdc

我们试图检查RDC的内部一致性值从高分辨率测量获得。为此我们试图计算出RDC值基于肌肽分子结构通过项目相形见绌(方法bestFit) [18]。的方法返回对齐张量,计算rdc从观察到的最小偏差对于一个给定的固定的分子结构。表示参数从而获得一个好的衡量真正的分子结构之间的协议解决方案和一个假定的理论之一。偕的质子的化学位移β丙氨酰CH₂组发现几乎相同。此外,我们只有一个共同的决定¹H -¹³C RDC值为每个CH₂组。这些证据使我们得出的结论是,线性的β丙氨酰残经历了一个快速的内部动力,平均观察RDC值。因此,我们限制我们的分析获得的数据都要相形见绌组氨酸的一部分,和总数量的5一个键¹H -¹³C, 1两个债券¹H -¹H, 2三批公债¹H -¹H rdc受到健康。可能从PubChem采用肌肽几何图形数据库,CID 9369年提供156种不同的稳定肌肽旋转异构体由于最小化使用MMFF94s力场[19]。完整的分析结果表S4支持信息是可用的。根据RMSD值进行计算结果之间的实验和计算RDC的价值观。表示获得的最佳值是1.5,3.4,2.1,20%,30%,和40%的明胶,分别。然而,不可能任何严格的界限来区分结构“接受”和“拒绝。“结果必须因此被认为是半定量的水平。采用的实验值可能是能够描述的两个灵活的组氨酸moiety-C5-C4-C扭转角度β- cα和C4-Cβ- cα- n。十佳从每个样本拟合结构中,有一个高人口总计(8)的结构与−的二面角角度147度(C5-C4-Cβ- cα)和−78度(C4-Cβ- cα- n)。这个结构很好地对应一个实验的结果基于肌肽的核磁共振研究联轴器(20.]。作者发现最密集的旋转异构体的G−构象二面角C4-Cβ- cα- n(−−30 90度)。我们的研究结果也支持这样的结论,肌肽在溶液中是相当灵活和动态平均测量rdc大大受到影响。

有兴趣重燃的量化的肌肉的肌肽在活的有机体内¹H先生光谱(21)相关的当前可用性的层析x射线摄影机高磁场能够提供一个很好的灵敏度。此外,山峰的咪唑高的质子H2和H5 8 ppm和7 ppm的化学变化,分别发生在无人居住的地区范围,因为大多数共振的常见小代谢物中发现该地区0 - 4.7 ppm。H2报道更适合峰值比H5集成。“Orientation-dependent效应”,也就是说,由于RDC扩大或分裂,提出了作为一个可能的原因(6]。我们没有观察到任何RDC分裂的H2或H5在我们高分辨率核磁共振谱的拉伸明胶样品。因此,在协议(21)它可以表明有其他相关原因更短的弛豫时间对H2等组织分隔,pH值的依赖和络合。

当考虑到肌肉组织,肌肉的拉伸明胶凝胶浸泡代谢物可以看作是过度简化的力学模型。对齐的明胶是通过相互作用引起的肌肽与部分导向的原胶原纤维。人们可以推测是否对齐特征代谢物的骨骼肌组织类似于这样的模型。RDC的潜力描述组织的微观性质将有可能利用一次¹H -¹³C杂环的原生组织可用常规实验(22- - - - - -25]。¹³C浓缩的代谢物或利用¹³C磁化超极化技术(26,27)将是最有可能必要的为了提高信噪比。

4所示。结论

伸展肌肉的胶缸和溶液浸泡代谢物肌肽导致的分裂¹H和¹³C先生光谱由于剩余偶极耦合。我们描述了制备高档的50毫升拉伸与肌肽凝胶样品可以用作建立和测试一个幽灵RDC的光谱测量磁共振扫描器。我们确定的集合5两,三批公债价值¹H -¹H rdc和7的一个键值¹H -¹³从肌肽C rdc使用高分辨率核磁共振的方法。这些值符合肌肽分子结构经历很大程度的内部灵活性虽然有些旋转异构体的组氨酸sidechain发现更青睐,即C4-C的偏转构象β- cα- n二面角。没有RDC分裂H2和H5峰值可观测的¹H拉伸明胶样品的光谱。这表明,扩大或分裂这些山峰的报道光谱先生从肌肉6RDC)可能不是相关方向的依赖关系。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作已经由捷克科学基金会(项目号13 - 23392)和卫生部,捷克、概念发展研究组织“临床和实验医学研究所,IKEM 00023001”。NMR谱仪在项目中购买CZ.2.16/3.1.00/21566 Prague-Competitiveness由运营项目。作者感谢Jiři博士瓦拉几人有用的建议关于定向制备的媒体,帕维尔博士Srb对脉冲序列实现,Burkhard Luy教授慷慨地为他们提供这种凝胶拉伸装置。

补充材料