染色体HMGB1蛋白和DNA之间的相互作用研究DNA-Melting分析

文摘

HMGB1非组蛋白的染色体蛋白质与DNA相互作用的研究利用圆二色性光谱和热变性的DNA。融化的DNA被证实是一个复杂的两相的过程。游离DNA和DNA的融化温度特征必将HMGB1在0.25毫米EDTA的解决方案被发现°C和°C,分别。结果表明,HMGB1的绑定分子影响的DNA区域大约30 b.p融化。长。

1。介绍

hmg盒子(HMGB)蛋白质最丰富的非组蛋白的染色体的蛋白质。他们属于HMG蛋白质总科(高机动组)(1- - - - - -3]。最著名的成员之一的HMGB家庭是HMGB1蛋白。蛋白质的氨基酸序列是由三个区域形成两个dna结合域(HMGB-domains A和B)和一个无序的监管c端域(2,4,5]。HMGB-domains保守的l型结构(4),dna结合活动是由c端域由29 Asp / Glu氨基酸残基,通常被称为“酸性尾”(5- - - - - -8]。虽然个人HMGB-domains主要由α螺旋区域(4,9,10),其结构在整个蛋白质取决于与酸性尾巴的交互和可能改变明显(6,11]。

HMGB-domains结合DNA小沟,展示特异性prebent DNA结构而不是特定的序列(2,3,5]。此外,HMGB-proteins本身能够产生弯曲的双螺旋结构绑定。最初,染色质的结构组织的DNA被认为是HMGB-proteins的主要功能12- - - - - -15]。但是,它最近被证明,这些蛋白质在细胞核中执行许多监管职能(5,16- - - - - -18在细胞质中,19,20.),甚至在细胞外(21- - - - - -24]。

尽管大量的实验数据的交互HMGB-domains DNA片段较短(5,25- - - - - -27)的确切机制完整HMGB1和DNA之间的相互作用还不清楚。但是,这些机制,确定功能由HMGB1的多样性。这是证明HMGB1-DNA交互的模式取决于蛋白质DNA比值(7,8,28- - - - - -30.]。大超分子复合物观察HMGB1 / DNA比率高,出现由于蛋白质-蛋白质之间的关系(增加的贡献7,8,29日,30.]。早期的实验数据表明,结合DNA可能引起不同的HMGB1本身的结构性变化,这取决于特定物种的DNA;HMGB1与[31日,32]。在目前的研究中我们调查基于DNA-melting HMGB1与DNA相互作用分析。

2。实验

2.1。dna蛋白质复合物

非组蛋白的染色体HMGB1蛋白(26500 MW)提取细胞核的小牛胸腺如前所述[29日,33]。蛋白质的纯度测试与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。蛋白质的浓度是由紫外吸光度使用消光系数米⁻¹厘米⁻¹(34]。小牛胸腺DNA (II型)从Sigma-Aldrich购买和使用前未经纯化。DNA的浓度决定通过测量吸光度差在290和270海里(HClO)水解后6%₄(35]。DNA的质量检查通过测量其吸光度的增加在260 nm变性(增色效应)。

Protein-DNA复合物是由相同数量的DNA和蛋白质的直接混合解决方案适当的浓度,获得所需的输入蛋白质DNA比值(w / w)复杂。HMGB1 / DNA比值变化从0到0.5。最后的解决方案中的DNA浓度是30μ克/毫升。所有的解决方案包含氯化钠EDTA 0.25毫米和0.2毫米。

2.2。光谱学

吸光度光谱记录与Specord 40 M分光光度计(德国卡尔蔡司)温度控制石英细胞1厘米的光学路径长度。

CD谱记录与马克V dichrograph (Jobin-Yvon、法国)温度控制石英细胞1厘米的光学路径长度。每个样本的光谱被记录在该地区在200年和320年之间在1 nm步模式。1000个读数的平均信号1毫秒间隔在每个波长。提出了光谱的平均三个连续运行。用圆二色性吸光度值,区别左、右圆偏振光的样本。CD仪器校准使用D-10-camphorsulfonic酸。

2.3。DNA-Melting分析

融化的DNA和蛋白质是通过逐渐加热样品从20到95°C。DNA-melting曲线是通过测量获得的光学密度在260海里或在275 nm圆二色性。蛋白质的熔化曲线测量获得的样本在222 nm圆二色性。规范化融化曲线获得了DNA样本使用下面的公式: 在哪里和最小和最大的光密度值在260 nm,对应于本机和熔化状态的DNA样本。融化的一阶导数曲线使用高斯deconvoluted概要文件。

dna蛋白质复合物的融化使用熔化温度为特征,这是确定的位置最大融化曲线的一阶导数。的增色效应根据方程量化吗

3所示。结果与讨论

DNA(脱氧核糖核酸)的分子是在生理条件下聚阴离子。降低溶液的离子强度导致双螺旋结构的不稳定导致降低DNA的熔化温度。减少离子强度的影响,实现更好的融化导数曲线的峰分离我们研究DNA复合物的融化HMGB1 EDTA在解决方案包含0.25毫米和0.2毫米氯化钠(36]。DNA的浓度在所有样本是30μ克/毫升。融化的DNA在所有复合物演示了相同级别的增色现象在260 nm纯DNA(图1)。

纯DNA-melting曲线的一阶导数在游离状态有单峰特征剖面(图1)。这个峰值是由于DNA和融化的最大峰值的位置提供DNA-melting温度的值。0.25毫米EDTA的DNA的解决方案/ 0.2毫米氯化钠融化温度被发现°C(图1)。当蛋白质添加到系统的一阶导数融化曲线展示了不同的配置文件有两个独立的山峰(图2)揭示两相的过程。其中一个峰值仍有最大值约44°C (),因此可以归因于的融化的DNA。另一个是转向更高的温度,表明一部分DNA的存在与熔化温度的~ 62°C ()。因为它早些时候显示(36- - - - - -40]第二个峰值可以归因于DNA区域绑定到蛋白质的融化。因此,交互与HMGB1的DNA双螺旋结构稳定的结果HMGB1附近的结合位点。

配合物的热稳定性也研究了利用圆二色性光谱(图3)。CD光谱适用于监控构象变化在DNA和蛋白质在helix-to-coil过渡。分析DNA的变化CD在融化了熔化温度等于用吸收光谱数据,协议。纯HMGB1的熔化曲线(图4)的蛋白质熔化温度~ 42°C。类似的依赖对dna蛋白质复杂融化温度稍高约47°C,这可能反映出复杂的蛋白质熔化温度的增加或/和叠加DNA-melting过渡(图4)。有趣的是,蛋白质的构象变化本质上是完成60°C。融化曲线的一阶导数的复合物(图2)表明,第二个峰值上升融化的温度高于60°C。因为这些第二峰值对应的融化DNA结合蛋白,我们可以得出这样的结论:绑定的融化DNA蛋白质的构象转变,进而很可能诱发的DNA结合特性HMGB1的变化。

假设下的面积图的熔化曲线的一阶导数成正比的DNA样本的浓度(36- - - - - -40),我们可以得出结论,每个两座山峰下的面积成正比的释放量和绑定系统中的DNA,分别。个人山峰下的区域变化的蛋白质绑定显示增加DNA比游离DNA的复杂导致数量减少和增加的DNA区域绑定到蛋白质(图2)。基于区域的比较这两个峰我们估计的分数DNA碱基对参与根据输入绑定HMGB1蛋白DNA比率(图5)。DNA碱基对的分数更高的熔点作为输入的函数蛋白质DNA比值显示与增加线性增加。这种线性关系表明,在整个范围的研究蛋白质的DNA比率绑定一个HMGB1分子稳定大约相同数量的DNA碱基对(b.p)。估计这个区域的大小我们可以估计的数量的比率安塞绑定到蛋白质系统中的蛋白质分子的数量: 在哪里结合DNA的一部分,是样本DNA安塞的总数,的摩尔质量是DNA b.p。(660 Da)或HMGB1 (26.5 kDa),分别是DNA的蛋白质比(w / w),然后呢的斜率吗图,等于~ 0.8(图5)。

因此,简单的计算给出了估计的大小等于大约30 b.p稳定DNA区域。,这是两倍大于HMGB1结合位点(早些时候决定7,28- - - - - -30.,41,42]。

因此我们可以得出结论:尽管双螺旋HMGB1的相当大的变形稳定DNA的碱基配对结合位点的附近,由20°C的熔化温度的增加。绑定的HMGB1稳定大约30 b.p。,which is about twice bigger than the binding site of a single HMGB-domain.

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢俄罗斯基础研究基金会是一个金融支持格兰特(12-08-01134)和圣彼得堡的政府。

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