文摘
利福平的抑制作用母鸡蛋清溶菌酶淀粉样蛋白形成的评估Thioflavin T(阻)荧光分析和傅里叶变换红外光谱(FTIR)差异。我们发现这荧光化验出利福平干扰引起假阳性结果,而红外光谱不同光谱提供了一个可靠的评估。通过红外光谱,我们表明,利福平只有轻微的抑制作用。然后我们建议红外光谱不同光谱可以方便在淀粉样蛋白抑制剂筛选方法的研究。
1。介绍
淀粉样蛋白聚集与特征交叉-不溶性蛋白质聚合β结构和纤维形态(1]。体内,淀粉样蛋白沉积是一个病态的40多个神经退行性的特点,使得非系统性、疾病(2]。这些人类疾病称为淀粉样疾病,包括一些知名的疾病,如阿尔茨海默氏症,帕金森氏症和II型糖尿病。这些疾病与淀粉样纤维性颤动的一个独特类型的蛋白质或肽(2]。淀粉样蛋白形成和淀粉样疾病之间的明显联系使设计和开发分子干预淀粉样蛋白形成一个有吸引力的策略来预防和治疗淀粉样疾病(3]。
淀粉样蛋白的形成是一个相当复杂的蛋白质聚集的过程。聚合动力学曲线通常是一个典型的s型函数具有滞后阶段,发展阶段和平衡阶段(4]。此外,可以有低聚物的中间体在不同大小和形态。这些中间低聚物在许多方面已经称为无定形聚合物,原纤丝,prefibrillar骨料,globulomers,环形原纤丝(5]。成熟的原纤维和nonfibrillar寡聚物被猜测是可能的致病原淀粉样疾病(3]。
如淀粉样原纤维被假设在淀粉样疾病的致病原(3),搜索分子,可以抑制淀粉样纤维性颤动的一个主要研究领域的淀粉样蛋白的研究。利福平是一种抗生素被发现能够抑制淀粉样蛋白形成众多如淀粉样蛋白的蛋白质β,胰岛淀粉样多肽(IAPP) -核蛋白,母鸡蛋清溶菌酶(HEWL) [6- - - - - -9]。然而,一般的利福平对淀粉样蛋白形成的抑制作用近年来受到了挑战。孟等人报道,利福平实际上没有抑制作用IAPP的淀粉样蛋白的形成,与先前的观察(10]。他们证明了明显抑制作用只是由于Thioflavin T的假阳性结果(阻)荧光测定利福平造成的干扰。发现通过孟等人清楚地表明,利福平对淀粉样蛋白形成的影响是一个相当复杂的问题,没有通用的答案对利福平的实际作用在淀粉样蛋白的形成。在这项研究中,我们要重新审视利福平的抑制作用的淀粉样纤维性颤动HEWL利用HEWL amyloidogenic系统作为一个模型。HEWL不是蛋白质与淀粉样疾病直接相关,但它是一种广泛使用的模型蛋白淀粉样蛋白研究中由于其低成本。我们进行这项研究的目的是三倍。(1)利福平真的能抑制淀粉样蛋白形成HEWL吗?(2)利福平HEWL系统中的干扰阻试验?(3)如果这化验抑制剂筛选是有问题的,我们可以找到另一个方便的方法来准确评估利福平的影响?
2。材料和方法
2.1。材料
母鸡蛋清溶菌酶(HEWL)的纯度≥90%(目录L6876)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,美国)。氧化氘(D2O)得到纯度> 99.8%从J&K化学(中国,北京)。氯化钠Sigma-Aldrich得到纯度> 99%。氯化氘(DCl)(35%重量的D2从Sigma-Aldrich O)获得。叠氮化钠(南3)的纯度为99%是购自天津化工厂(天津)。利福平是来自原液(上海,中国)。所有材料使用前未经纯化。
2.2。样本的准备工作
在D HEWL解决方案2O (pD = 2)包含140毫米氯化钠和200 ppm NaN3用于纤维性颤动的研究。溶液pH值调整使用DCl解决方案在D2O达成酸度计1.6 (pD = pH值+ 0.4)。HEWL解决方案是首先通过一个0.22μ过滤前孵化。利福平第一次被溶解成D2O (pD = 2)集中解决7毫米。这个解决方案是被用来制造HEWL-rifampicin混合解决方案。在这项研究中,HEWL 5毫克/毫升的浓度和利福平的浓度是400年μM . HEWL的浓度是由重量决定的浓度与紫外可见分光光度法测定利福平的消光系数报道28000米−1·厘米−1在334纳米11]。HEWL和HEWL-rifampicin解决方案在封闭的玻璃瓶后孵化在62°C thermoshaker没有风潮。需要时能整除将取出培养瓶的阻氢荧光,傅里叶变换红外(FTIR)和原子力显微镜(AFM)特征。一直小心避免曝光孵化瓶。
2.3。这荧光分析
荧光测定是执行与日立f - 7000荧光分光光度计。激发波长450 nm的狭缝宽度5 nm和发射波长486 nm的狭缝宽度10纳米。光电倍增管的电压是700 V。浓度的解决方案是10μm .缓冲在pH = 7.4 20毫米磷酸盐缓冲剂。执行非原位试验。测量颤动力学、整除HEWL孵化的解决方案没有与利福平或被从孵化瓶在不同跨度为立即受到试验。对于每个度量,40岁μL孵化解决方案添加到960年μL的解决方案在一个1.0厘米石英试管。电池的解决方案之前,首先动摇了运行每个收购。利福平干涉实验中,40μL孵化解决方案添加到960年μL的解决方案在一个1.0厘米石英试管首先获得一个初始荧光阅读486海里。然后1.5μL 7毫米的利福平的解决方案是注入上述解决方案和随时间变化的荧光阅读486海里被记录。
2.4。AFM测量
上所有的AFM图像被干样品在空气中与NT-MDT解决P47扫描探针显微镜(Zelenograd、俄罗斯)的开发模式。一个90μm×90μ使用m扫描仪整个AFM实验。硅悬臂梁从NT-MDT购买。悬臂共振频率为100千赫的名义力常数3 N / m。AFM测量的样品是准备使用以下方法:10μL孵化的解决方案是用去离子水稀释100倍(美国Billerica微孔),然后100年μL的稀释溶液放到新鲜裂解云母。10分钟等待时间后,蛋白质溶液和去离子水冲洗掉。云母表面然后离开干燥环境条件下。
2.5。红外光谱测量
红外光谱在室温下得到力量顶点70红外光谱谱仪(力量、德国)配有DLaTGS探测器。样品室一直从自制的净化与干燥的空气净化系统水汽干扰降到最低。一个可拆卸的液体细胞CaF的一对2windows和50μ米间隔使用。光谱采集的光谱分辨率4厘米−1和128扫描。红外光谱数据处理与作品进行软件(力量、德国)。之前hydrogen-deuterium (H / D)交换HEWL不是孵化之前执行,以减少结构摄动的蛋白质。当HEWL D2在62°C O的解决方案是孵化,肽骨干成为完全氘在滞后阶段就是明证酰胺的消失我乐队在1540厘米−15 h后孵化(12]。剩余H2O在绝大D2O形式木制容器,并对光谱分析在酰胺我微不足道的影响。
3所示。结果与讨论
我们第一次使用这荧光分析探讨利福平HEWL的淀粉样蛋白形成的抑制作用。阻氢测定的标准方法来量化在形成淀粉样纤维总量的增长(13,14]。年中,作为一个外在的荧光探针分子,一旦与淀粉样原纤维结合,给出了一个特征荧光发射~ 480 nm ~ 440 nm激发。的荧光强度假设是与淀粉样原纤维的数量成正比。我们这里进行比较研究HEWL颤没有与利福平的存在和孵化解决pD = 2和62°C的测定。高温和酸性条件是诱发原纤维形成的标准条件HEWL [15]。在选定的跨度为整除的孵化解决方案被孵化瓶的荧光测量。这分析结果的比较研究在图所示1。HEWL的颤动力学曲线的影响没有利福平显示了一个典型的s形形状,具有滞后阶段,发展阶段和平衡阶段。然而,颤HEWL动力学曲线的影响下利福平基本上是在基线水平。一个简单的比较两者之间的动力学曲线清晰地表明,利福平完全抑制HEWL在当前的实验条件的颤动。
正如上面已经提到的,孟等人表明,利福平可能会干扰测定。事实上,哈德逊等人还指出,这分析可以通过外源性化合物(有偏见16]。因此,为了证实利福平的抑制作用在上面的阻氢荧光观察调查,我们没有和利福平HEWL孵化解决方案特征使用AFM是否有纤维聚合。图2给出了AFM结果HEWL孵化方案有无利福平。令人惊讶的是,在两个样本,广泛存在纤维聚合在AFM观察。这意味着AFM结果不支持这样的结论:我们把基于试验。
(一)
(b)
探索从这上面的冲突证据的原因分析和AFM研究中,我们进行了以下实验与荧光光谱。我们第一次添加阻到解决方案包含HEWL纤维和获得初始荧光阅读。然后,我们添加了利福平到上述混合物,开始监控这荧光衰变。如图3利福平的,有一个即时年中荧光强度下降。显然,利福平的存在干扰测定。这无疑这强度下降的确切原因值得进一步调查,但它应该是由于淬火效应或利福平结合位点竞争对阻可用。因为利福平、干扰的分析不能作为一个可靠的方法来评估实际的利福平对HEWL颤动的影响。
作为阻试验可以给误导假阳性结果,它有利于寻找替代方便抑制剂筛选方法。我们想探索红外光谱不同光谱的可行性替代抑制剂筛选方法。红外光谱是一种构象敏感技术由于每个蛋白质二级结构都有其独特的红外吸收1700 - 1600厘米−1酰胺我地区(17]。这意味着跨的增长β结构在形成淀粉样蛋白很容易监测和量化光谱与红外光谱不同。此外,红外光谱是自由法和直接检测到一个标签β表结构,它基本上是受外源化合物的干扰,如利福平。
我们进行了两组红外光谱测量在相同的条件下探索的利福平HEWL的淀粉样蛋白形成的影响。图4(一)给HEWL孵化解决方案的原始光谱没有利福平在滞后阶段,出现在孵化的结束。两者之间的差光谱原始光谱也是插图所示。它是通过减去孵化解决方案的红外光谱谱带在滞后阶段(即。5 h时间点)从孵化结束时(即。在90 h时间点)。1618厘米的存在−1峰值的差光谱直接指标存在的淀粉样原纤维(12]。这个峰值强度成正比HEWL原纤维的数量。图4 (b)给HEWL孵化解决方案的原始光谱与利福平在滞后阶段,出现在孵化的结束。两者之间的差光谱原始光谱也是插图所示。1618厘米的存在−1峰值显示有淀粉样原纤维的存在即使在利福平的影响。这个观察是一致的观察在AFM研究但相反从阻试验假阳性结果。此外,我们发现1618厘米的强度−1原纤维峰值谱图的差异4 (b)只是略低于控制如图4(一)。这支持这样的观点:利福平略微抑制HEWL的淀粉样蛋白的形成。
(一)
(b)
显然,图4给出了一个概念验证的例子来支持这个提议,红外光谱光谱差异可以作为替代抑制剂筛选方法。当然这里使用的红外光谱测定仍然需要在将来的研究中进一步优化。例如,当前的传输方式可以取代与衰减全反射红外光谱(ATR)模式红外光谱。这可以使样品处理和谱减法更具用户友好性。此外,高吞吐量的红外光谱附件需要开发大规模筛选可行。
4所示。结论
总之,我们评价利福平的抑制作用的淀粉样蛋白形成母鸡蛋清溶菌酶(HEWL)年中荧光测定和红外光谱光谱的差异。我们的结果表明,阻试验不是一个可靠的评估方法等利福平干扰测定。与阻试验、红外光谱的不同光谱直接监控的发展β表结构在形成淀粉样蛋白;因此,可以准确的方法对利福平的效果进行评估。光谱与红外光谱差异,我们表明,利福平只有轻微的抑制作用。然后我们提出,红外光谱差异光谱可以被用作一种方便的方法对淀粉样蛋白抑制剂筛选研究。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者欣然承认金融支持中国国家自然科学基金(没有。21075027),河北省自然科学基金(没有。B2011201082),中国教育部(没有的关键项目。211014),高等教育专业博士学科点科研基金项目(20121301110003)。