文摘

的guanidine-thiocyanate-induced denaturation-renaturation sfGFP进行了研究。结果表明:sfGFP本机结构的破坏发生在硫氰酸胍浓度的范围从0.5到2.5米。这个过程同时伴随着所有记录参数的变化。发现小硫氰酸胍浓度(小于0.1 - -0.2米)引发当地结构性干扰蛋白质导致显著下降的发色团和色氨酸荧光强度,改变蛋白质的可见吸收光谱。

1。介绍

多种荧光蛋白(FPs)及其工程目前类似物作为荧光标记不同颜色的bioimaging [1- - - - - -5]。FPs的应用促进了基因活化的常规监测和单个蛋白质的选择性标记,细胞细胞器,或整个细胞(6,7]。功能点的生物传感器设计感觉细胞环境的属性如pH、离子通量,氧化还原电位(8- - - - - -12]。基因编码FP-containing生物传感器基于荧光共振能量转移(FRET)已经广泛采用了蛋白质-蛋白质之间的关系和其他生物的调查相关事件发生在活细胞(1,13]。FPs与light-modulated光谱特性,集体称为photoactivatable荧光蛋白(PAFPs),允许打破衍射极限和获得超限分辨成像在固定细胞和活细胞(3]。最近开发的FPs发射远红外的地区和FPs拥有大型斯托克斯变化使细胞过程的可视化在活体动物(14,15]。

所有FPs的关键特性吸引了一个巨大的利益是self-generate内在发色团的能力从三个氨基酸位置65 - 67不参与任何代数余子式或酶组件(16]。发色团被封装在刚性 -barrel-like外壳蛋白矩阵的功能是保护环境和限制其灵活性的发色团从而防止无辐射失活。此外,正确的蛋白质折叠的结果的正确取向chromophore-forming附近的催化氨基酸三肽和诱发发色团成熟。因此,研究FP的折叠和结构动力学的高利息。

FPs容易聚集导致的不可逆性变性和阻碍FPs folding-unfolding的调查。Superfolder或sfGFP是唯一FP自由这个缺点的17]。在这个工作我们研究了denaturant-induced sfGFP利用光谱技术的结构变化(吸光度、荧光、圆二色性)和凝胶排阻层析法。

2。材料和方法

的质粒pET-28a (+) -sfGFP编码superfolder GFP (17]polyhistidine标记被构造成前面描述的18),变成了一个大肠杆菌BL21 (DE3)主机(表达载体)。sfGFP表达式被一个孵化诱导的细胞与0.5毫米IPTG(丙烯酰胺、瑞士)在24小时25°C,和蛋白质纯化Ni-NTA琼脂糖(通用电气医疗集团,瑞典)。重组蛋白的纯度不小于95%,表明通过sds - page。硫氰酸胍(丙烯酰胺、瑞士)使用前未经纯化。测量在50 mM TrisCl缓冲区,pH值8.0。蛋白质浓度为0.15 mg / mL。

吸收光谱记录使用EPS-3T(日立、日本)分光光度计。微蜂窝技术的实验101.016 qs 5毫米×5毫米(Hellma、德国)在室温下。

荧光实验进行了使用卡里Eclipse荧光光谱仪(瓦里安、澳大利亚)和自制的荧光光谱仪对荧光偏振(登记19]。蛋白质固有荧光很兴奋在长波吸收光谱(297海里),酪氨酸残基的贡献在大部分蛋白质荧光可以忽略不计。具体的绿色荧光sfGFP很兴奋在365和470海里,并在510海里排放检测。的位置和形式荧光光谱特征的参数 = 3 2 0 / 3 6 5 ,在那里 3 2 0 和 3 6 5 荧光强度在 e 米 = 3 2 0 和365海里(20.]。参数的值 和荧光光谱的仪器灵敏度的修正。色氨酸荧光各向异性的计算 = ( − ) / ( + 2 ) ,在那里 和 荧光强度的垂直和水平的组件是由垂直偏振光和兴奋 垂直和水平的关系组件的荧光强度兴奋水平偏振光吗 ( = / ) , e 米 = 3 6 5 纳米(19]。所有动力学实验进行微蜂窝技术FLR 10毫米×10毫米(瓦里安、澳大利亚)。展开的蛋白质是由手工混合解决方案(50 mkl)缓冲区包含所需的GTC浓度(450 mkl)。死亡时间是确定从控制实验是4 s (20.]。不同的荧光特征的依赖性sfGFP GTC浓度蛋白孵化后被记录在适当浓度的解决方案在23日在2°C, 24岁,45岁,69和95 h。荧光光谱仪配备恒温器,举行了一个恒定的温度23°C。

GTC sfGFP展开的凝胶过滤实验进行Superdex75 PC 3.2/30列(通用电气医疗集团,瑞典)使用一个AKTApurifier系统(通用电气医疗集团,瑞典)。解sfGFP preincubated在23°C 24 h的GTC所需的浓度。然后10μ这个解决方案的L加载在一个列平衡GTC相同的浓度。水动力的变化维度sfGFP被评为sfGFP洗脱体积的变化。在过渡区平均sfGFP洗脱体积的计算 = + ,在那里 和 是紧凑和变性分子的洗脱峰,然后呢 和 是紧凑和变性分子的部分估计相应的峰面积。

3所示。结果与讨论

图1显示变性曲线不同参数的色氨酸荧光(荧光强度参数 荧光各向异性;励磁297海里)和sfGFP发色团在两个波长荧光强度兴奋(365和470海里;登记在510海里)作为最后的GTC浓度的函数记录1 - 94 h后的平衡所需的蛋白质的变性剂浓度。结果表明:GTC-induced展开sfGFP达到quasiequilibrium 24小时后几天的情况相比GdnHCl-induced变性(21,22]。进一步孵化sfGFP GTC的至少4天,不会导致可衡量的变化记录的特点。显然,蛋白质结构发生演变的GTC浓度的范围从0.5到2.5米。这个过程同时伴随着所有记录参数的变化。子界的小GTC浓度(小于0.1 - -0.2米)我们没有观察到明显的变化的蛋白质三级结构的荧光各向异性和参数一个(数据1(c)和1(d))。然而凝胶过滤实验显示略有增加的水动力维度sfGFP(图1(j))。同时,少量的发色团的GTC诱发显著下降(数字1(e)和1(f))和色氨酸荧光强度(数字1(一)和1(b))和改变蛋白质的可见吸收光谱(图1(我))。可见吸收光谱吸收带sfGFP证明明显下降的对应的阴离子形式发色团与相伴的吸收带对应于中性的发色团。这些数据表明,小的GTC变化之间的平衡sfGFP轴承中性分子和阴离子生色团。变性曲线发色团的荧光强度是纠正考虑吸收的阴离子和中性的发色团的变化GTC(数据的存在1(g)和1(h))。的反应从而纠正两个波长的荧光发色团兴奋是完全不同的。激励在365 nm导致显著的荧光下降(13%的原生蛋白质信号),在激发470海里导致荧光对本机sfGFP增长20%。下的荧光量子产率明显降低励磁的吸收带质子化了的发色团可以关心抑制质子转移,因此发色团电离辐射的存在小GTC浓度。我们假设所有观察到的变化引起pre-denaturing GTC浓度当地sfGFP结构扰动的结果而不是全球重组蛋白质的结构。


图1
GTC-induced folding-unfolding sfGFP记录的荧光强度的变化在365 nm 320海里(a)和(b),参数一个(c)、荧光各向异性在365海里(d),和发色团荧光强度兴奋在365 nm (e)和470海里(f)。展开和折叠了圆形和方形,分别。测量后进行1 h(封闭的圆圈)和24 h(开放的圆形和方形),45 h(三角形),69 h(颠倒三角形),和94 h(灰色十字架)孵化的本地或变性蛋白的存在相应的变性剂浓度。数据提出了(e)和(f)纠正考虑波长的光密度的变化激发(g和h)。sfGFP进一步的构象变化特点是吸光度的变化在390(广场、我)和490海里(圆,我)。插入面板(i): sfGFP的可见荧光光谱的存在增加GTC浓度(箭头所示)。sfGFP水动力维度的变化在GTC-induced变性研究了凝胶过滤法(j)。紧凑,变性分子的洗脱峰的位置(灰色圆形和方形)和平均洗脱体积的变化sfGFP(黑色三角形)所示。

稀释复性的sfGFP诱导的predenatured在决赛2.2 GTC各种蛋白质变性剂浓度(图1)。重折叠蛋白质孵化24小时后达到平衡。结果表明,强重折叠的条件下(GTC最终浓度为0.22米)的恢复所有的记录特征sfGFP发生说明蛋白质的可逆性展开。展开和折叠曲线过渡区域不一致显示明显的滞后。滞后sfGFP折叠期间所观察到的行为应该是与桶内的发色团的存在已被锁定在正确的活性形式的核心蛋白最新的折叠步骤(23]。确实绿色FP的变异突变体不能形成发色团没有展开和折叠的磁滞曲线(23]。

重折叠曲线的参数 和荧光各向异性sfGFP展览的高原GTC浓度范围从0.5到0.8米(数字1(c)和1(d)),而荧光强度sfGFP发色团在变性和复性实验测量在这个范围的GTC浓度(数据一致1(e)和1(f))。在最近通过分子动力学模拟结果表明,初始sfGFP的快速形成β桶是紧随其后的是一个缓慢的搜索发色团异构化和结构波动向锁定活跃的本地褶皱(24]。在第二次折叠步骤,最后股融入桶和结构重排在桶的盖子发生(24,25]。应该指出,Trp 57靠近那些β的斯特拉瓦迪。可能sfGFP重折叠伴随着积累的中间状态的核心围绕发色团是组织而结构Trp 57并不成立。

确认

这部分工作由教育部和科学(合同02.740.11.5141),程序MCB RAS,和SPb政府(O.V. Steparenko)。