文摘

本文总结了过去15年所取得的进展在应用振动(拉曼和红外)光谱医学诊断和细胞生物学的问题。在这段时间里,许多研究小组证实振动光谱的巨大的信息内容;事实上,基因组,蛋白质组,代谢组可以推导出信息解码观察到的振动光谱。这个解码过程的可用性是辅助极其大功率计算机工作站和先进的数据分析算法。此外,商业工具的快速收集拉曼和红外显微光谱数据呈现实际图像完全基于光谱数据的集合。该领域的进展体现了稳定增长的数量和质量出版物提交的建立和振动生物和生物医学领域的新研究小组。

1。介绍

使用振动光谱的概念方法辅助医疗诊断工具可以追溯到半个多世纪的时候红外光谱本身就是在起步阶段1,2];然而即便如此,前瞻性的光谱学家想到的可能性使用生化光谱方法获得的信息,而不是常用的古典细胞病理学和组织病理学形态信息,用于医疗诊断。然而,它真的直到21世纪的第一个十年的承诺光谱细胞病理学(SCP,光谱诊断细胞)和光谱组织病理学(轴马力,光谱诊断组织)成为实际。尽管一系列评论文章的十年前宣布光谱诊断的成功,经过十几年来的努力理解甚至基本的细胞和组织的影响,使红外光谱(3,4),开发计算方法检测通常分光谱的变化与疾病的细胞和组织5),开发医学上可接受的方法比较光谱和古典的诊断结果。光谱的努力是巨大的进步得益于伴随改善测量技术在2000年代早期可用的计算能力和爆炸性增长光谱学家。有趣的是,在作者的眼中,提高计算能力,随着发展的一些基本的理论基础,是最重要的发展推动SCP和轴马力向商业领域。

最后这句话的有些清醒的后果是疾病状态之间的光谱变化,或其他细胞生物学事件,肉眼可见最可能不是因为预期的效果,但是由于上述混淆不同光谱特性主要是基于形态变化在组织或细胞进行了研究。因此,一个普遍适用的和高度重要的细胞和组织的光谱研究结果的实现红外光谱(微)高度依赖于样本形态:如果样品不是均匀的薄膜,但由离散的粒子,如果粒子的大小大约是一样的红外光的波长,散射效应会使观察到的红外光谱。这种散射等物理现象(见下页)可能会导致混合在红外光谱吸收和色散线形状,这是第一次有记录的研究人员在生物医学领域的应用红外光谱(4,6- - - - - -8]。

cell-morphology-dependent效应的一个典型例子,从作者的自己的实验室,是我们的第一次尝试区分正常和癌宫颈细胞。为此,正常人类宫颈脱落细胞被培养相比,宫颈癌细胞(海拉)。然而,这些细胞的形态的巨大变化使这微不足道的或不可能的任务(9]:培养细胞大,相对厚核使良好的红外吸收光谱和中表现出很强的蛋白质、DNA和RNA的功能。他们的细胞质,另一方面,是薄和广泛的明显伪足特性共同培养细胞。这种细胞的细胞质给非常缺乏光谱主要由蛋白质特性和强带扭曲的边缘(见下文)的细胞。

在宫颈脱落细胞,另一方面,细胞质的光谱更强,常常表现出明显的糖原功能。他们的核固缩的展览几乎没有DNA / RNA功能(10]。因此,光谱区别“癌”颈海拉细胞从正常宫颈细胞微不足道但医学上完全无关紧要。当我们试图改善这种情况通过移除trypsination培养细胞的基质,并把它们脱落细胞,我们明白了(艰难)trypsination虽然常用的过程在细胞生物学、细胞形态学改变(也可能是细胞的生化成分)显著;这些变化使胰蛋白酶化时恢复细胞随后山肩在培养瓶和允许成长。trypsination,细胞通常从一个广泛的形态、细胞可以达到25μ(或更大)的大小大约10 near-spherical形状μ米大小;相应的光散射特性的变化可以混淆他们的红外光谱和在某些光谱波段产生大的变化。由此产生的光谱变化又如此强烈,比较清新(正常),使胰蛋白酶化培养(癌症)细胞完全是微不足道的9]。

此外,光谱细胞甚至邻近组织像素做展示自然的变化,由于许多因素(代谢活动,在细胞周期阶段,组织架构,等等)。因此,光谱特性的任何变化应基于大量的光谱(光谱“数据集”)收购了显微镜下细胞或组织的像素。此外,可见细胞或组织的图像像素必须允许相关的光谱变化可用来混淆形态学原因,污染,或细胞所需的实际变化事件(疾病)。最后,多元数据分析方法应进行数据集来帮助区分与变化相关的不相关的变化(噪音)所需的(或疑似)变化的原因。

因此,本文在科学哲学不同于通常看到的“生物分子光谱学”(ECSBM会议的主题系列),细胞和组织的光谱像素更复杂的组件(它们叠加光谱不明的丰富),他们不再是静态的,但主题变化通常忽略光谱学(形态、代谢活动、疾病)。因此,光谱学家那些习惯于光谱重现性和恒常性是警告因此,下面的讨论的其余部分将挑战这些概念,但将演示振动光谱学等生物系统的细胞和组织可以解释,和有价值的诊断信息可以从光谱推断出结果。

本文将主要集中在最近SCP的结果从作者的实验室,实验室光谱诊断(LSpD)在波士顿东北大学。本文关注SCP的原因是LSpD导致这一领域比其他领域的光谱诊断。同时,数据集的大小的病人数量(口头和宫颈细胞学> 250)超过其他数据集调查其他团体。

光谱正在积极组织病理学LSpD,大型独立训练集和测试集可用日期的恶性肿瘤。这些数据不包括摘要,因为许可协议下的工作正在进行,还不能泄露。相反,从方法论的角度介绍了轴马力的一般过程和缺陷进行了讨论。拉曼成像方面被短暂的末尾。

2。方法

2.1。仪器方面

所有的红外光谱结果提出了显微镜下获得的通过三种成像红外显微分光计(光谱/焦点400,优秀的公司,谢尔顿,CT) LSpD,从今以后称为PE400的。红外光谱的细胞或组织收集transflection (reflection-absorption)模式从样品安装在“低辐射”(也称为MirrIR)幻灯片(Kevley技术、Chesterland哦,美国)在4厘米的光谱分辨率⁻¹。本文所有红外数据表示(SCP和轴马力)收集在成像模式下为6.25μm像素大小。的空间分辨率PE400使用军事目标和决议成立两倍衍射极限的1600厘米⁻¹,ca。12μ米。为简单起见,我们假设体素的大小由仪器审问ca。10×10×5μ米³(在,,方向,不仅resp。)中,方向是由衍射极限,但样品的最大厚度探测器非线性之前观察到。在这些研究中允许使用的像素大小检测光谱差异小的物品作为细胞的细胞核。目标以来SCP和轴马力都是单个肿瘤细胞的检测和诊断,这是有利于操作光谱仪的像素的分辨率大小的细胞的细胞核。在过去,4和8干涉图之间coadded每个像素;然而,在实施noise-adjusted主成分分析(见下文),只有一个或两个干涉图coadded。在这种情况下,收购一个完整(ca。700 - 4000厘米⁻¹为一个像素)红外光谱谱使用PE400需要5至10 ms。光谱采集4厘米⁻¹光谱分辨率和被存储为800点强度向量2厘米⁻¹数据间隔从800到4000厘米⁻¹(400年本地体育成像格式。fsm文件)。

所有拉曼数据是使用共焦拉曼显微镜(WITec CRM模型2000年,Inc .)、乌尔姆,德国)。在使用mid-visible激光拉曼显微镜(ca。励磁500海里),衍射极限体素的大小约为0.3×0.3×1μ米³(11),按比例较大的长波长激发。激光功率的样本通常大约10兆瓦;在这些条件下,一个拉曼光谱(300到3300厘米⁻¹)可以在250到300毫秒。原始的拉曼数据存储与非线性波数1024强度点数据点之间的间距。间隔取决于使用的激动人心的激光波长和光栅和波数范围进行了研究。1024点的波数矢量值对应于每个强度数据点与拉曼光谱数据集输出。多变量分析拉曼数据之前,所有光谱线性波数空间插值和宇宙射线的纠正。

2.2。细胞培养

大多数细胞生长在作者的实验室写明ATCC买来,马纳萨斯,弗吉尼亚州和培养75厘米³培养瓶(美国康宁,洛厄尔,MA)使用最低必要的鹰的介质(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)补充了10%,按体积,胎牛血清(的边后卫,写明ATCC)。培养烧瓶孵化在37°C和5%公司的氛围₂。细胞培养,直到支流,从烧瓶中除去trypsin-EDTA(写明ATCC)。细胞被受移植者的窗户上的选择,“低辐射”幻灯片为红外测量或CaF(见下文)₂磁盘用于拉曼光谱,沉浸在新鲜培养基补充10%的边后卫,并放置回孵化大约12个小时。细胞被固定和缓冲4%,提示解决方案中对拉曼测量水福尔马林,红外数据采集前(见下文)。

2.3。脱落细胞

口腔脱落细胞LSpD人员作为口腔癌筛查项目的一部分东北大学(在当地IRB),以及细胞收集的临床病人波士顿塔夫茨医学中心(TMC)是完全相同的方式对待。这些细胞被剥落了通过cytobrushes沉浸到表皮脱落后立即提示有固定剂。这个固定的媒介包括24%的乙醇水溶液和1%甲醇和异丙醇。我们已经表明,这种固定剂改变了细胞的光谱最低限度,即使长期暴露的细胞固定剂(1个月),和光谱变化由于疾病远比由固定协议和接触固定液(见下文)12]。提示有固定协议在LSpD改编自选择的方法在TMC,所有临床样本中。福尔马林的比较——和Surepath-fixed细胞显示最小差异(12]。

经过反复清洗和离心周期,细胞spin-deposited通过cytocentrifugation到“低辐射”幻灯片(见上图)。统一样本细胞稀疏,坚持衬底很强烈,可能这种方式生产的。

2.4。组织部分

组织部分被削减,使用切片机,厚度5μ从formalin-fixed m,石蜡包埋组织块从病理学系主任TMC的档案。部分是安装在低辐射玻璃幻灯片和deparaffinized使用标准协议(13]。一些光谱也从组织获得像素同时嵌入石蜡。红外数据采集后,组织部分被沾hematoxylin-eosin()),允许相关的视觉和红外光谱图像。

2.5。计算方法

所有的数据操作和分析,使用MATLAB使用软件开发的房子(美国马MathWorks,纳蒂克)平台。分析从原材料开始(拉曼和红外)用仪器测量数据文件。大部分的数据分析程序软件包中包含被称为“ViChe”(振动化学计量学),包括所有的预处理和多元成像重建算法,例如,主成分和层次聚类分析(HCA)成像。(后者最近被详细讨论14]。预处理的例程,noise-adjusted主成分分析(羧基酸)从文献[15,16),而乐队形状畸变校正程序,在下一节中,讨论了内部(17- - - - - -19]。单个细胞成像的算法构建光谱数据集已经报道(20.),提交知识产权保护。以下参数(早些时候5,21),所有的数据分析进行了二阶导数光谱。

3所示。结果与讨论

本文作者表示在ECSBM14在主题以及秩序。因此,第一个主题将讨论方法校正色散带形状的扭曲中经常遇到的人类细胞和组织的红外光谱。这个特殊的问题,样品morphology-dependent光谱失真,一直困扰这研究领域自成立以来60多年前,和transflection并不局限于微观数据采集模式。(在很早就在红外光谱的组织工作,块状石英和梅勒斯1)建议把一滴油组织部分匹配样品的折射率和环境)。困难产生的色散带形状是如此严重,有广泛悲观的未来红外显微镜作为一个可能的医学诊断工具。SPEC2010会议后在曼彻斯特,英国在许多研究小组提出了自己的观点和方法来克服这个问题,做了大幅情绪波动。在写这篇文章的时候,有三个方法纠正色散带形状的文学或提交的专利保护。

3.1。修正的色散带形状

在两个开创性论文,研究小组在曼彻斯特大学的彼得·加德纳,英国,描述4,7)反射过程和米氏散射如何调解色散和吸收带形状的混合。然而,类似的混合现象是众所周知的发生,例如,在镜面反射(22从金属表面)和吸收测量23,24以及在ATR光谱。在所有这些形式的红外光谱、吸收光谱不直接测量,但是通过依赖于复杂的折射率的方法,这是由 在(3.1),折射率的实部,吸收率,摩尔消光系数,光的波长。每当或有一个最大的(即。,whenever one observes a peak in the absorption spectrum),经历了反常色散,如图1。折射率的实部和虚部Kramers-Kronig变换是相互关联的: 在这一频率的谱峰,折射率在无限长波长没有转变发生。因此,折射率的色散可以从吸收率和计算反之亦然。比较一个吸收光谱和相应的色散曲线如图1。这些现象是众所周知的在chiroptical古典光学和光谱学:圆二色性和光学旋转色散Kramers-Kronig两个效应相关的典型例子的变换。不过,在经典光学和光谱学,通常回避情况这两个效应,吸收和色散,互动:大多数教科书的光学治疗折射率与波长数量变化非常温和,因为大多数光学材料的选择,他们没有吸收光谱范围的利益;也就是说,他们在可见光谱无色(清晰)。在吸收光谱中,另一方面,一个假定的反射损失样品,由折射率引起的,很小,不会扭曲明显吸收光谱。

然而,在某些条件下分解这个简单的情况,和一个观察大量混合反射和吸收带概要文件。这是第一个制定米氏散射的情况下由Bassan et al。4),可以可视化如下。米氏散射不是分子而是宏观效应的球形或near-spherical金属电介质粒子散射入射辐射产生广泛,起伏的背景模式。这种效应主导如果粒子大小和波长的光,通常5到12之间μm不仅对中测量,大约相等。因此,小的人类细胞,细胞核的细胞,也可以表现出强烈的米氏散射。米氏散射的经典物理方程非常复杂(25];然而,米氏散射截面可以近似相对准确26,27)为一个透明的球体 与散射系数给出的 在哪里是散射球体的半径,光的波长折射率的比值散射领域和环境。然而,如果散射材料展览吸收,因此wavelength-dependent折射率,需要被色散曲线如图所取代1。由此产生的米氏散射,称为共振米氏(RMie)由加德纳的群4),如图2对一个地区的古典米氏散射轻轻将展示一个非常不同的概要文件。

类似的混合反射和吸收带概要文件可能会观察到,有时,在纯粹的反射光谱,也出现在研究表面增强红外吸收(SEIRA)调查。在这些研究中,凝固(合并)金或银的表面是由气相沉积的金属和用作整洁液体基质。“吸收”光谱观测到的这些液体显示纯反射带概要文件。这可以理解为连续折射率的金属粒子经历米氏散射,接触的液体,其折射率发生反常色散(23,24]。

如前所述,扭曲的红外光谱中观察到球形细胞(如淋巴细胞)是如此严重,对光谱的解释是不可能的。同时,使用多元数据分析方法,如主成分分析(PCA),严重混淆了扭曲和频率变化引起的反射强度和RMie散射的贡献。因此,Bassan et al。17)提出了一个方法来纠正扭曲的光谱拟合折射率(干扰)光谱通过的Kramers-Kronig变换吸收光谱失真降到最低。类似的方法,需要更少的计算时间,但不止一个“干扰”,出版之后不久LSpD集团(18,28]。

然而,这些方法都需要“无污染”作为他们Kramers-Kronig参考光谱和光谱色散干涉光谱变换,并使用这两种方法的结果要么减少(17]或[放大18真正的方差谱。因此,我们引入19)根据证据确凿的另一种方法“相位校正”(PC)方法中普遍存在的标准红外光谱。相位校正方法是基于复杂的傅里叶变换的概念分离谱的实部和虚部或干涉图通过改变它们之间的相位角。在经典的红外光谱,收集到的干涉图通常是不对称的零路径差异(ZPD)峰值;这种“啾啾”干涉图,在FFT,一个包含反射和吸收谱带形状(29日]。几乎所有的商业红外光谱仪器使用默茨相位校正方法(30.)仪器相位角的实验和用于正确的光谱来决定。

一个基于pc的方法尝试了我们6]但工作只是间歇性地早些时候由于一些计算和理论问题。最近,修正后的相位校正算法实现快速,可靠和优雅的校正反射带的贡献。简而言之,扭曲的光谱,扩展到所需的频率范围和运用羧基酸(见上图),是逆傅里叶转换回干涉图的空间。结果真正的(重新)和虚(Im) zero-filled干涉图,根据和相转移试验阶段 相位修正光谱是由复杂的前锋FFT计算。“最好”的阶段被认为是产生强度最高的纠正,由于添加反射组件总是减少峰值强度(29日]。原则上,wavenumber-dependent相角也可以计算,如默茨算法,从低分辨率的干涉图通过删除FFT获得较少的数据点。

3.2。光谱细胞病理学

3.2.1之上。总论

研究者参与SCP早期的目标之一是发展的方法来帮助诊断宫颈细胞涂片(31日- - - - - -34)用于宫颈癌筛查(所谓的巴氏试验(简称“巴氏”测试)35,36]。选择这个主题的原因是证据确凿的高速率的假阳性和假阴性细胞学者和cyto-technicians阅读这些样品。有趣的是,人们不应把这些低敏感性和特异性的巴氏试验失败的方法;完全相反,没有一个测试降低了发病率,并从一个给定的癌症发病率的巴氏试验。(本文中使用的术语敏感性和特异性的临床意义,在真正的诊断敏感性是指比除以总数量的true-plus假阴性诊断,诊断和特异性是指真阴性的比率,除以真阴性plus-false-positive诊断。)一个阅读经典的“诽谤”,总体精度敏感性和特异性的(平均)不到70%。改进是通过生产更好的样本:显微镜幻灯片上而不是涂脱落细胞染色,液态方法设计(37)产生稀疏层的细胞,染色后,提供一个更清晰的单个细胞。一小部分的彩色样本如图3。

这个图显示了大约50宫颈鳞状细胞的一小部分液态样品染色淡蓝色或淡粉色;此外,这个示例包含细菌多形核白细胞(中性粒细胞)细胞碎片,如裸核,一个“不正常”细胞表示,扩大核。困难的古典(视觉)细胞病理学是只有几个百分点的检测样本的异常细胞可能包含1000到10000个细胞。此外,核肿大本身(一个大核/细胞质(N / C)比值)也观察到从低层次的宫颈上皮细胞;从而进一步标准,如核膜的形态,需要调用一个可靠的正常与异常细胞的歧视。异常的水平也需要分级;宫颈细胞学的成绩(为了增加严重性)包括反应、低度发育不良(低度鳞状上皮内病变(LSIL),高档发育不良(高档鳞状上皮内病变,HSIL),在网站(CIS)癌,浸润性癌症。

鉴于问题的复杂性,这是不足为奇的宫颈癌筛查被选为目标光谱诊断早期。当第一次在这个目标是在1990年代初,红外显微镜没有发展到一定程度,允许收购单个细胞的光谱在合理时间;因此,细胞颗粒的未知成分的细胞类型中包含颗粒作为样本,和测量进行了宏观上。结果从这些早期的努力以PCA得分图(33,38)如图4。在这个图中,每个符号代表一个光谱收集宏观上从一个细胞颗粒;确认诊断是古典病理学。回想起来,令人意外的是,这些早期的细胞颗粒的结果给了令人鼓舞的结果,和相当长一段时间才理解为什么这些原油测量显示,任何形式的歧视。

允许直接评估单个细胞和说服细胞学者谱方法的价值,作者的实验室在2002年转向single-cell-based光谱细胞病理学。虽然比pellet-based方法更耗时,光谱的单细胞方法允许直接比较结果与目视检查的细胞,因此细胞学者更高的内在价值。为此,样品染色和cover-slipped红外数据采集后,和细胞可以被重新安置在衬底的存储位置。早期结果显示承诺:鳞状细胞之间的区别从远端尿道移行细胞(膀胱)细胞通过光谱方法被证明是简单的(39,40],肤浅和中间从宫颈上皮细胞的分类和影响荷尔蒙的影响可以很容易建立的40]。荷尔蒙影响最初试图帮助绝经前和绝经期妇女的样本进行分类,但需要扩大到包括月经状态因为激素水平影响宫颈细胞的成熟。这是第一个建立犬颈细胞(41),但被发现持有人类宫颈细胞。为了方便的检测和诊断宫颈疾病是下面讨论,只有女性使用口服避孕药的使用,因为它们保持荷尔蒙水平不变,从而消去一个变量建立SCP的过程中作为一个可能的诊断方法。宫颈的工作成果将在本节。

并发与宫颈细胞,努力发展口腔癌筛查LSpD发起。口腔黏膜,如宫颈粘膜,由复层鳞状上皮,但由于唾液中的消化酶,并不表现出大光谱贡献由于糖原,而掩盖了大部分的低频光谱(1000 - 1200厘米⁻¹)。口腔黏膜的原始结果是非常有趣的和主要形式的基础上我们目前对光谱细胞学的理解。这些结果,之前的一个简短的介绍复层鳞状组织将,紧随其后的是指针对细胞的典型振动光谱的解读。

复层扁平上皮组织是一个经常发现上皮细胞在人体(鼻咽和口腔龋齿、食道、尿道、阴道、宫颈,和其他人)。这是一个多层结构(见图5)组成的一层积极划分基底细胞固定在基底膜,下面哪一个发现结缔组织(基质)。创建的子细胞的基底细胞形成parabasal层和成熟和迁移到表层。在这个过程中,他们的形态和化学成分变化显著。而基底细胞约立方形的形状,约15μm紧张,很少大核和细胞质,成熟的分层(平)细胞可能达到60μ米在边缘和展览非常小,致密的细胞核。他们也积累为能量储存糖原(除了口腔粘膜细胞,见上图);因为他们完全分化,减少化学成分反映了某些化合物在细胞质中。使用高空间分辨率同步辐射红外光谱成像和酶消化的研究中,我们已经表明,RNA签名,例如,几乎没有成熟鳞状细胞的细胞质(42,43]。此外,我们表明,致密的细胞(核DNA几乎难以察觉的3),但有助于观察光谱的快速分裂的细胞,例如,癌症细胞和淋巴细胞。

最后,一个非常粗略的解释的典型光谱细胞将像素(或组织)。1500 - 1700厘米⁻¹地区的一个细胞或组织的像素的光谱是由蛋白质酰胺我和二酰胺乐队,橄榄和灰色阴影图2;这两个乐队分成部分波段二阶导数光谱和已知主要是由于exciton-like耦合状态的C = O, O =碳氮伸展运动坐标,分别为(44]。特定的蛋白质,尤其是蛋白质的结缔组织(胶原蛋白),有完全不同的红外光谱,允许用肉眼检测它们的光谱特征。

高频波段,约为1740厘米⁻¹,是由于酯连接磷脂(5,43]。反对称和对称的磷酸二酯伸展振动的DNA, RNA,并观察到磷脂ca。1235和1090厘米⁻¹。这些乐队的强度变化巨大的疾病。non-hydrogen-bonded核苷酸的C = O拉伸乐队是观察到的主要是高频肩膀的酰胺峰。酰胺III振动发生叠加在反对称磷酸二酯弹性振动。碳水化合物显示出强劲的山峰由于C-O-H变形和切断拉伸坐标1000至1200厘米⁻¹。最丰富的细胞碳水化合物的糖原,它显示了三个强大的乐队在1151年,1078年,1028厘米⁻¹。碳水化合物乐队也观察到的糖蛋白,尤其是粘液。

3.2.2。光谱的口腔黏膜细胞病理学

我们开始讨论SCP通过提供一个临床试验的结果目前正在东北大学的校园,与病理学系合作在波士顿塔夫茨医学中心(TMC)。口服细胞学被选为首次大规模放松的目的,因为样本收集、病毒性疾病的患病率在口腔(人类乳头状瘤病毒,单纯疱疹、巴尔)和口腔和鼻咽癌症的患病率在远东人口,代表很大一部分口腔癌症发病率在TMC看到。

细胞学样本收获如上所述,立即插入瓶充满提示有固定剂。经常批评,裁判和格兰特评论者,作者的努力使用SCP作为诊断工具已经固定在细胞和组织的影响。我们满怀希望和forever-answered这些问题在最近发表的一篇论文表明,甚至长时间暴露于固定剂固定,不同的方法(干燥、福尔马林和提示有固定)导致光谱特征变化明显低于那些由疾病引起的。这是显示通过PCA情节描绘在图6。在过去,巨大的光谱变化的细胞和组织固定的报道(45),我们认为主要是由于在固定形态的变化。在组织,经福尔马林固定、石蜡包埋的变革更大,但他们不干扰振动光谱诊断如果所有组织部分比较以同样的方式对待。这是证明很好地通过背靠背的论文发表在老鼠大脑神经胶质瘤(2006年46,47),要么是flash冷冻或formalin-fixed和石蜡包埋,随后deparaffinized(见下文)。

在图7,我们现在先工作结果对口腔黏膜细胞(48]最初有些出乎意料,但之后发现之前报道了宫颈细胞(33,34]。这个早期研究的结果暗示形态正常细胞异常样本表现出异常光谱,代表一个进程从正常到癌细胞。然而,报告的样本集然后太小到达任何详细的结论。所有细胞的光谱图所示7细胞克隆是舌头,因为我们之前已经证明存在小,但可再生的细胞的光谱变化从不同的口腔解剖区域的收获。在图的分数阴谋7,正常细胞(从6个志愿者)显示为蓝色符号形成一个紧密的集群。直接从癌症病变细胞收获的舌头,显示为红色,形成不均匀集群与正常细胞分离。最有趣的是散射集群绿色所代表的符号。这些光谱来自细胞表现出正常的形态,但从癌症患者从相当偏远地区收集癌变组织和病人诊断为癌前疾病。这个观察,即大部分脱落细胞仍然表现出正常形态,但表现出异常光谱,可以用这一事实来解释大部分的癌症病灶周围已经影响生化改变或突变,病理学家称为“恶意诱导变化”或“癌化。“虽然这些术语的定义有点模糊,众所周知,尤其在治疗后的复发口腔癌症元凶的第一个癌症发病率是20倍高于健康的病人。这意味着有细胞的癌前病变并没有表现形态。完全类似的结果在活的有机体内拉曼光谱测量由范德比尔特研究小组(49ectocervix]。另一个解释这些结果将会在SCP的结束部分。

此外,我们表明,感染的单纯疱疹病毒可以通过SPC,发现细胞收集来自不同解剖区域的口腔(脸颊和牙龈,舌头,舌头和嘴底限)可以通过SCP杰出。此外,降解产物的光谱模式止痛药用药(布洛芬)可能会发现在细胞光谱,可以使用尼古丁的副产品(48]。尽管这些降解产物产生的变化太小被视觉感知细胞检查,主成分分析可以很容易地从污染细胞光谱分类未被污染的。特别是,PCA沿着光谱类被加载向量分化往往给一个好迹象的光谱变化检测到主成分分析。这将在下一节中进一步讨论。

3.2.3。光谱细胞病理学的宫颈粘膜

在宫颈细胞学研究的最初目标这里描述(见上图),完全观察到类似的结果,也就是说,大部分细胞异常样本显示光谱异常,尽管他们表现出正常的形态。这些结果反映了早期发现Cohenford et al ., (33)和Cohenford里加斯(34),但考虑到额外的混杂因素,如上所示:细胞受到hormone-mediated成熟过程包括,例如,糖原的积累成熟的最后阶段。由于糖原吸收带面具的很大一部分的低频(1000 - 1200厘米⁻¹)谱,有价值的信息在核酸磷酸拉伸区域(ca。1090和1235厘米⁻¹)无法呈现。因此,下面的研究报道来自受试者使用口服避孕药,防止颈完全成熟鳞状上皮,于是减少糖原。宫颈细胞的成熟模式的变化以应对更年期可以很好地演示使用SCP (40]。

图8显示了主成分分析的结果分析脱落细胞从正常的病人,和病人诊断为LSIL / HSIL(见部分3.2.1之上)[50]。这里,口服细胞学结果是重复的,大多数的细胞发育异常患者表现出光谱异常,虽然细胞形态正常(见细胞图像如图8)。更令人吃惊的是前细胞从一个病人的诊断HSIL和随后的治疗仍然表现出异常与异常光谱谱模式和集群。

这个观察的影响是相当深远的检测异常宫颈并不局限于少数细胞片状剥落,表现出异常的形态。相反,SCP检测异常光谱特征所表现出的大部分细胞,即使他们仍然有正常的形态。异常的持续治疗后带领我们探索的可能性光谱变化(与“恶性肿瘤相关的变化”(51]或“癌化”(52前面提到的)实际上是由于病毒感染。在某种程度上,这种思想被激起的结果与急性病人单纯疱疹口腔感染。在这种情况下,大多数的细胞显示光谱异常,不仅那些被病毒感染,他们所以奇异地变形可以由一个细胞学者[视觉诊断48]。从统计上超过95%的宫颈发育不良发生一起(和可能是由于)感染人类乳头瘤病毒(HPV),可能存在程控检测人乳头状瘤病毒的感染宫颈细胞学(53]。同样,口腔发育异常可能是由巴尔或HPV引起的。

这些观察结果可能有助于解释细胞颗粒研究积极成果报告(图4):虽然细胞颗粒的成分的贡献从表面,中间,和parabasal细胞,中性粒细胞和细菌,不清楚这些样本,大量的病毒感染细胞可能导致了疾病的区别。努力回答的可能性的参与病毒感染对观察到的光谱变化将在下一节中。

3.2.4。病毒的影响

为了探索SCP对病毒感染的敏感性,进行的一项研究中,48个样本检测高危HPV感染(hrHPV)通过Digene混合捕获测试(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。分析的光谱结果SIMCA [54]。10个样本训练子集的结果,如图9,看起来非常有前途的,具有良好的光谱分离患有乳腺癌和HPV-negative样本。当应用到剩余的样本集,实现了88%的敏感性;然而,特异性只有43%。这意味着SCP很擅长hrHPV应变检测时存在(由Digene测试),但没有hrHPV感染在场时不准确的。我们认为低特异性低风险的人乳头状瘤病毒(lrHPV)感染的流行人口20到25岁之间的女性,与感染率约为30%,约一样的感染率与hrHPV [55]。因此,它很可能的样品检测结果为阴性hrHPV Digene测试已经低风险的HPV感染,其光谱方法(还)没有能够区分。

检查PCA加载向量(图中未显示)表明,光谱变化,以及PCA和SIMCA区分HPV-infected从正常细胞,发生在蛋白质光谱区由不同的转变我乐队的酰胺和小肩膀的外观。这导致这样的结论:这不是一个检测到的病毒DNA的变化,而是不同的蛋白质表达的病毒。鉴于病毒基因组的大小(ca。5000个碱基对,bp)和病毒基因组的复制份数在宫颈癌细胞(最大限度ca。600年CaSki细胞系,在海拉细胞更少),到达一个约300万个碱基对数量添加到人类基因组在HPV感染的情况下。人类基因组的30亿个基点;因此,它与目前的方法来检测这种变化是不可能的。如果影响细胞产生蛋白质不同于正常的宫颈细胞蛋白质组,这种变化可以被放大和检测光谱方法。工作正在进行中,以揭示上观察到的光谱变化的原因(54,56]。

3.2.5。SCP的未来

除了固定的研究,进行了剥落和培养细胞,病毒载量的研究,并进行培养细胞,绝大多数的工作提出了在上面的部分中脱落细胞处理;也就是说,它报道一个真正的新形式的细胞学、即SCP。我们所知,工作上脱落细胞在细胞层面正在进行专门LSpD,和数据集的大小LSpD远远超过所有以前收集的数据集相结合(48,54]。写这篇文章的时候(2011年夏季),SCP似乎已经成熟到可以检测细胞异常,如发育不良、癌症、脱落细胞病毒感染,因此将被应用到领域经典细胞学表现却很差,在很多情况下低于50%的准确率。

SCP的原因进展有点慢,在其他领域的光谱诊断是古典细胞病理学和SCP之间的相关性是很困难的。在SCP,不得不依靠运气,在一个细胞受到SCP可诊断,异常细胞。几成千上万的细胞发育异常的病人,然而,它将很有可能会出现一些细胞发现显示异常光谱,可以,事实上,是诊断。这种情况下如图10显示明显异常细胞的光谱集群与其他异常光谱(54]。

培养细胞的努力和研究方向更多样化和代表其他一些研究小组以及LSpD。这些努力已经证明红外显微镜可以检测细胞分裂周期的阶段(57),药物治疗对细胞的影响(58- - - - - -60],侵略性的程度[61年),μRNA表达(62年)、癌症激活成纤维细胞(63年),和其他几个人。总的来说,这些研究的结果表明,仔细也是红外光谱研究可以揭示出大量的信息,发生复杂的生物化学变化,当细胞接受自然或诱导过程。似乎一些一般规则适用的精心策划和执行研究。原始光谱、是否监控上述药物治疗或任何其他的变化,表现出没有或几乎没有可见的光谱变化,多元分析方法需要使用可视化的光谱变化。一个典型的例子是布鲁塞尔的研究小组(59],它展示了优雅的未经处理的细胞的光谱和那些接受药物肉眼几乎是相同的,但统计(或者,在这种情况下,2 d)这些数据集的分析,将揭示生物化学变化可以解释。一些光谱变化,例如,由于药物的相互作用,小于变化是由于癌疾病;因此,作者认为,细胞的光谱分析可以揭示更多的信息,可以用来揭示非常微妙的细节。细菌细胞,例如,红外光谱,结合神经网络的分析,可以预测新发现的药物的作用方式(64年]。

3.3。光谱组织病理学(SHP)

3.3.1。总论

虽然古典组织病理学是初级医疗诊断的金标准(几乎所有的癌症诊断是最初基于组织病理学)和具有较高的敏感性和特异性检测癌症,该方法更模糊评分时的疾病。它本身也是一个主观的方法来诊断和缺乏再现性和不容易执行通过量化和可再生的测量。此外,特定亚型的检测,例如,癌症基因的过度表达,需要免疫组织化学染色和随后的病理分析。轴马力有承诺加强这些方面,结合形态学和生化成分方面信息到一个新颖的方法。

轴马力比SCP进展速度,主要用于与经典方法相关的原因,也就是说,标准组织病理学,更直接,并行图像从组织病理学和轴马力可以随时进行比较(见图11- - - - - -13)。在这些数字,即便是外行能感知的组织形态和建筑信息可以从古典组织病理学,直接转移到组织结构揭示了轴马力。因此,它变得明显,不同的生化成分表示组织形态学变化是在轴马力也检测到。轴马力和圆)图像的相似性允许一个详细的“注释”,也就是说,相关组织和细胞形态特征与相应的光谱特性,而反过来,允许训练的诊断算法。

成功轴马力研究课程,首先是一系列开创性的论文中概述的罗伯特·科赫研究所小组柏林(21,65年- - - - - -67年),包括以下主要步骤:获取很高的S / N光谱数据(原始的空间分辨率研究受限于仪器性能),预处理包括1或2的计算衍生品和标准化来减少仪器和背景工件,无监督方法如presegmentation的数据分层聚类分析(HCA),非常小心注释病变区域的病理学家,和足够大的训练数据集来构造一个健壮的诊断算法。这些初步的研究中使用的诊断算法是一个人工神经网络(ANN)训练成千上万的光谱(67年]。这项工作奠定了基本规则在轴马力和证明患者身上观察到光谱的变化小于由于疾病分类或组织类型(21]。

在过去的十年里,从膀胱组织部分,骨骼、大脑,乳腺癌、软骨、子宫颈、结肠癌、食道癌、肾、肝脏、皮肤、脾脏,牙齿,甲状腺,和其他一些研究,主要由轴马力,但最近也通过拉曼光谱成像。所有这些研究的总结,读者被称为最近的一些评论(68年- - - - - -70年]。不幸的是,许多这些研究只进行到presegmentation (HCA)阶段,因为足够数量的样本不同的相同的疾病患者的诊断通常并不是可用的。这方面变化很大问世以来的商业组织微阵列(tma)。蓝玉由50至120个人组织核心,每个直径约1 - 1.5毫米,已穿孔的石蜡包埋组织块和可能被视为典型的给定癌症类型的例子。这些核心本身是嵌入在石蜡和分段标准厚度。因此,一个可以购买TMA含有几十个病人样本或疾病阶段。开创了使用tma集团。莱文在美国国立卫生研究院(71年),通过几组(68年),包括LSpD。因为这些归档组织部分可提供详细的疾病诊断和经常与疾病的结果,作者认为,轴马力的未来将与TMA方法一段时间。

在SCP的情况下,固定问题许多问题的根源,对轴马力的批评。早期研究[72年,73年]报道大型光谱变化在固定,无法复制的其他组织。然而,毫无疑问存在治疗引起的光谱变化的一些更严厉的固定协议;在这里,只有两个最常见的组织将讨论处理方法。组织准备的破坏性最小的方法,当然,速冻cryo-sectioning组织切片和解冻后立刻进行光谱分析,干燥的组织切片21]。另一种方法涉及福尔马林固定和嵌入在石蜡组织切片,切片组织块,并随后deparaffination。这些过程,常用的标准组织病理学实验室,肯定会改变蛋白质结构;另一方面,这些变化是足够小,免疫组织化学制剂仍然识别特定的蛋白质结构和结合位点。当然,它是不可能直接比较冷冻和formalin-fixed和石蜡包埋组织部分,但如果不进行研究混合组织的准备过程,这两种方法都产生类似的结果。这两种方法的等价证明当这篇文章的作者是一个特殊的客座编辑杂志的问题,巧合的是,两个几乎相同的红外成像研究胶质母细胞瘤的老鼠模型各种形式提交出版(46,47]。一项研究使用冷冻组织切片,福尔马林固定和石蜡包埋部分。当然,尽管有两个组织之间的光谱差异准备,研究到达图像,都是相当类似的,也得出了类似的结论。

在轴马力,不同的组织类型经常发现在一个部分,如白色和灰色的大脑,基质,上皮细胞层,炎症细胞,当然病变组织类型。一般而言,红外成像技术,结合无监督多元方法,可以检测到不同的组织类型,允许一个生化解释组织类型之间的光谱变化。一个典型的例子是光谱检测的成熟鳞状上皮组织通过糖原的积累,这是发现的葡萄糖聚合物作为成熟鳞状细胞的糖原颗粒在细胞质中。另一个例子是不同蛋白质的检测类:基质和其他一些组织含有胶原蛋白,它有一个非常特征红外光谱和光谱可实现甚至通过目视检查。角蛋白结构蛋白,通常是发现在角质化鳞状细胞癌,以及由此产生的“角质珍珠”第一次被舒尔茨et al ., (74年]。同样,角化不全(角蛋白的沉积)鳞状上皮被木头et al ., (75年]。

3.3.2。宫颈腺癌

宫颈组织的感染HPV病毒被认为从squamous-columnar结(SCJ)和基底层鳞状组织内进行,并最终导致子宫颈的鳞状细胞癌。因此,努力后的LSpD旨在通路在宫颈上皮细胞的病毒。

一些报纸报道的正常光谱变化的层内鳞状组织,和底层的区别从鳞状组织基质75年- - - - - -77年]。光谱检测宫颈发育不良和鳞状细胞癌是由斯特勒等。77年),但光谱表征宫颈腺癌尚未记录在文献中,部分因为罕见的疾病。在这里,我们现在选择的结果从一个大的部分组织(ca。12×2毫米²SCJ)包含正常鳞状上皮组织,正常的柱状上皮(腺),和大片的宫颈腺癌。特别是,我们希望专注于大量的炎症细胞附近的腺癌。

鳞状上皮和腺癌上皮(癌和腺癌,resp),炎症细胞经常被观察到。斯特勒et al ., (77年]报道光谱变化由于这些细胞在基质中潜在的鳞状细胞癌,但炎症细胞的浸润是相对温和的。在这里,我们报告结果严重发炎的组织切片;事实上,乐队的炎症细胞能被探测到的视觉图(11日)。这些炎症细胞,浅蓝色和红色色调在图所示11 (b),很容易从周围的基质隔开分层聚类分析。正常,uninflamed基质透明区域显示为图的右侧11 (b)所示,腺癌是绿色的。紫色层表示身体的腺体细胞,包括最近的核层基底膜。细胞核(绿色)潜在的癌细胞的紫色层集群,表明这些细胞是不正常的。像所有图像基于分层聚类分析(HCA),没有参考数据集是利用图像重建过程;相反,图像是完全基于光谱的相似之处。光谱类从HCA获得图像,和病理诊断的基于集群的区域,被用来训练诊断算法的自动诊断组织部分。

这个样例宫颈腺癌的组织部分提出了重大困难的解释光谱结果,无监督聚类分析,诊断算法的训练,由于大量的炎症细胞。然而,基质的分离和鳞状上皮和腺上皮组织由轴马力微不足道,是区别不同层的鳞状上皮组织。这里的光谱变化可再生的,诊断网络,如一个安,可以训练这些组织类型分开。然而,炎症的区域存在一些困难。首先,炎症细胞小而近球形的形状和现在的强大RMie散射。纠正后,似乎这些免疫细胞的光谱特征变化与邻近的癌症。在一些地区的组织切片,炎症细胞的光谱都几乎无法分辨的光谱细胞腺癌,如红色区域的数字11,而在其他(浅蓝色区域图11),炎症细胞癌变区域很好地分开。有可能是炎症细胞的生化特性是不同的两类:我们之前已经表明,B淋巴细胞的激活可以检测到轴马力;此外,有迹象表明,某些免疫细胞的光谱(特别是吞噬周围)改变相互作用和摧毁癌细胞。因此,腺癌相似的细胞和组织细胞生物化学的起源。解决这些问题的唯一方法通过免疫组织化学染色,进一步确定样本的细胞类型。

3.3.3。乳腺癌微转移淋巴结

在本节中,我们将介绍红外成像研究的结果,结合层次聚类分析(HCA),乳腺癌微转移淋巴结组织部分渗透的(13,18,28,78年,79年]。这是一个重大医学问题,因为治疗取决于是否存在癌细胞的前哨淋巴结,形成转移性肿瘤。转移小于2毫米大小被称为微转移,往往形成被膜下的鼻窦的淋巴结。在这项研究中,50岁以上的1毫米×1毫米光谱图像采集,每个光谱组成的25600人。在这里,我们特别感兴趣的HCA能否可靠的原始数据集分割成光谱的胶囊,淋巴细胞,转移性癌症,等等。特别是,我们希望建立的光谱转移性癌症足够类似,允许训练他们的检测,诊断算法。

图12显示了三个典型的1×1毫米²H&E-stained淋巴结组织切片的图像。在他们每个人,淋巴结的胶囊,fibroconnective组成的组织,是粉红色,而淋巴结的淋巴细胞体内出现暗紫色。根据组织切片的稀缺性,淋巴细胞可能出现强劲RMie散射。深红色区域的三个面板图12是红外光谱的重叠区域的转移性癌细胞的说明。这些地区coregister区域的淋巴结显示完全符合浸润性乳腺癌细胞的形态学异常。因此,它出现的自动检测和诊断乳腺癌微转移通过红外光谱成像方法应该有可能使用一个训练有素的诊断算法。

然而,尽管优秀从周围的淋巴细胞癌变的地区歧视,最初的研究显示可怜的转移性癌光谱不同样本之间的相似性(78年]。这是显示在图(13日)描述了大型光谱差异酰胺我地区乳腺癌的地区。下面ca。1480厘米⁻¹光谱是几乎相同的,除了一个强度比例因子。很快意识到这种光谱差异是工件由于干扰色散线形状。当从五个不同的光谱结果收集从组织部分仍然嵌在石蜡(79年),几乎相同的光谱观察,见图13 (b)。(光谱组织切片的地图,还嵌在石蜡,首先报道了兰斯集团(80年]。他们显示非常相似的地图可以获得如果石蜡的一些强烈的振动被适当的使用)。在这种情况下,有更好的匹配的折射率占领的地区组织和领域缺乏样本;索引匹配极大地降低发病率的散射效应,吸收和反射如上所述线形状(见(3.2)和(3.3))。色散线形状主要影响的波数高一边酰胺我乐队,并导致巨大的二阶导光谱的变化;参见图(13日)。这些影响校正后,光谱的结果被发现是足够相似,诊断与训练算法是可能的。这些结果解释了为什么,在过去,最好的轴马力图像得到如果我光谱范围的酰胺是排除81年]。

自开创性论文分散带污染的起源发表(4,17),这些困难理解和被经常纠正。这打开了轴马力的广泛应用的可能性诊断目的,因为主要的方差谱数据已被消灭。几个研究小组使用组织微阵列数据集大小的增加,和发现的光谱特征相似的疾病非常重现。在密集的和有凝聚力的组织部分,例如,从结肠(82年)或肝脏(83年],散射的影响小得多,因此被允许早期研究没有进行干扰分散带形状。另一方面,非常稀疏的组织,如正常肺组织,由很少的“丝”一致的细胞表现出巨大的带变形;在这些,则无法获得可靠的数据没有散射修正。

3.3.4。轴马力的诊断算法和未来前景

振动光谱指纹的内在敏感性对组织的生化成分变化像素使轴马力医疗诊断成像的理想人选。在数据预处理与最新进展,越来越多的研究小组参与,以及光谱之间的一般协议和病理结果,看来轴马力准备进入主流诊断领域。轴马力的广泛应用的主要障碍是,在作者的眼中,难以获得足够和可靠的注释训练诊断算法。

这个问题的严重性在审查章首次表示由石头et al。84年),他一直在拉曼光谱和组织病理学的前沿在活的有机体内拉曼诊断。他报道说一个共识诊断由一群三个病理学家获得了在只有30%的情况下提交给他们。作者的合作者的轶事证据表明相同的组织切片在不同的时间可以产生不同的病理诊断。中出现的最成功的方法获取准确和可再生的注释包括使用高分辨率数字图像H&E-stained组织部分上的HCA图像可以叠加。这一步要求数字)和HCA的图像是完全一起注册,可以放大。这种方法允许病理学家带注释的光谱图像基于单细胞特性;也就是说,病理学家可以选择最典型的特征在组织切片和关联光谱特性的一个或几个细胞。光谱从pathologist-annotated组织地区随后从数据中提取,用于训练的诊断算法。如上所示,必须组织样本来自不同的病人用于训练阶段,因为小但系统提取的光谱之间会有不同的病人。目前,尚不清楚是否这些差异可以以后相关疾病类型和发展的特殊方面。 These questions can only be answered by parallel spectral and immunohistochemical studies.

LSpD,诊断方法选择的人工神经网络(ann)在不同的实现。人工神经网络自学习方法模仿人类大脑神经的相互作用。他们可以作为二进制(两级)分类器或区分两个多输入类。它们可以“堆叠”操作层次网络,例如,当几个连续的二元分类器。最近的研究比较其他多元分类器建立了他们表现出类似的水平的预测精度,例如,“随机森林”算法。作者的使用网络已经被评论家经常批评的建议和出版物LSpD新兴,和“过度训练”和众所周知的故障的早期应用人工神经网络反复引用。这两点将简单地解决。首先,存在完善的规则在生物信息学需要训练集和验证集的大小产生可靠的算法;未能遵守这些规则肯定会产生算法,可以训练过度的不可救药。然而,任何歧视性的算法,包括人类大脑的运作,这个缺点。 In the latter case, the subjectivity of classical histopathology is certainly a manifestation of insufficient training.

其次,任何形式的歧视算法的编外失败可以归因于训练不足,如省略整个类可能的输入或条件。同时,许多任务区分算法被应用,也就是说,异常的形态学歧视正常脱落细胞或面部识别,需要翻译的某些特性,细胞的nuclear-to-cytoplasm比率或height-versus-width比率的脸,收集度量标准,随后分析了安。可想而知,这些指标缺乏特异性手头的任务,而歧视的失败,不是因为歧视性的方法的缺点但是缺点的输入数据。在SCP和轴马力,强度数据的形式的光谱results-one-dimensional向量给出波数是适合一个安或“随机森林”,不涉及指标的构建。

3.4。鳞状细胞的拉曼光谱图像

拉曼数据的回顾本文有点偏向细胞成像,而不是诊断的应用。所有的诊断工作由LSpD利用红外显微镜提供更高的速度和空间分辨率的大小的细胞。拉曼成像,另一方面,提供了更高的空间分辨率,因此高度敏感的检测生物变化更小的亚细胞水平。因此,本文将集中在细胞成像的应用拉曼显微镜;然而,其他小组也拉曼显微镜用于诊断目的的散焦激光光斑尺寸更大(2 - 5μ米直径)和牺牲空间信息。在这里,我们希望报告信息,补充的细胞学努力LSpD通过开发label-free方法来可视化细胞组织。图14显示了喇曼图像获得的三种不同的鳞状上皮细胞通过光栅扫描激光束,集中地点约300 nm直径,在细胞和从每个点收集整个拉曼光谱。随后,无人监督的层次聚类分析用于高光谱数据集转换成伪彩色图像。

图(14日)显示了一个拉曼的形象培养宫颈癌(海拉)细胞85年]。它从一个数据集包含重建ca。10000年光谱通过HCA。光谱分割成不同的类是基于他们的相似性;也就是说,像素所示相同的颜色非常相似的光谱的结果。细胞的细节可以在这张图片是惊人的:大核(典型的积极增长的细胞,看到部分1所示),深绿色叶,很容易区别于细胞质中。此外,两个核仁深蓝色中检测到细胞核所示。原子核的光谱(主要是蛋白质和DNA)和核仁(主要是蛋白质和RNA)不同非常详细;在一个光谱,这种差异不是很明显。然而,HCA检测相关光谱差异的物理意义;因此,意味着集群之间的光谱核和核仁显示不同的光谱变化可以解释(生化反应85年),是可再生的不同细胞成像。

细胞质中也显示了小但重要的光谱差异。使用mitochondria-specific污点,我们能够分配的黄绿色的细胞核周围的地区和鲑鱼色的集群中是由于大量的线粒体。这是通过添加染色细胞在水环境中,没有再对准样品,重新扫描使用拉曼显微镜的细胞共焦荧光显微镜。这些实验可以为其他特定的细胞细胞器进行染色(86年]。

形象图14 (b)从一个成熟的口腔黏膜细胞,细胞核固缩的(43]。从细胞核固缩的光谱分离容易于细胞质中。在细胞质中,观察到一个有趣的特性是,由紫色斑点的出现。这些斑点的意思是集群光谱显示细胞质蛋白质和磷脂的叠加,由强大的脂肪族CH表示₂变形和拉伸模式ca。1445和2950厘米⁻¹。天然磷脂斑点可能是由于细胞内脂滴或由于结构如高尔基体、液泡或multilamellar囊泡。当细胞暴露在氘磷脂(87年](例如,产生完全由氘磷脂脂质体),我们发现氘脂质平衡与细胞质内的天然脂质。因此,拉曼成像可用于研究运输和交换现象由其他成像方法难以执行。

最后,图14 (c)描绘了一个从远端尿道鳞状细胞。这些细胞构成的大多数细胞中发现尿液细胞学。像大多数复层扁平细胞,他们积累糖原在成熟。细胞质内的糖原并不是均匀分布而形成颗粒可以通过拉曼光谱成像可视化。在图14 (c),红色所示的区域表现出细胞质蛋白质和糖原的签名,可以识别与参考光谱相比。紫色区域,如图14 (b)由于磷脂。

拉曼光谱成像的优势超过其他细胞成像方法,没有特定的标签或染色的细胞,但需要添加图像是基于一个固有的振动光谱指纹模式能被探测到的空间分辨率类似共焦荧光显微镜。共焦拉曼显微镜样品制备是微不足道的:现场或固定细胞生长或放在CaF₂衬底,沉浸在缓冲溶液接触水浸的目标。这种方法产生的信息尽可能的“原状”,非侵入性的方法。特别是拉曼成像的可能性方法在水环境中进行活细胞打开监控可能性后医疗用途,例如,干细胞。事实上,早期的干细胞分化的步骤(88年- - - - - -93年),胚胎已发现尸体。最近,Notingher报道跳动的心肌细胞的拉曼光谱94年]。

此外,大量的研究已经出现在文献中,使用拉曼显微镜(较低的空间分辨率,正如上面指出的)拉曼光谱细胞病理学。这里,观察活细胞的能力在他们的本地环境和振动光谱承担巨大的承诺的高选择性识别细胞的拉曼光谱的应用在血液和细胞排序应用程序使用这种技术,例如,对于循环肿瘤细胞的检测和隔离。努力朝这个方向一直是由Jena(德国)组下Popp来说,报告了不同细胞类型的识别在血,甚至流条件下(95年- - - - - -97年]。此外,研究分化细胞具有不同的病毒感染已经发表56]。同时,由于过度的光谱差异的最近报告了致癌基因(98年]。LSpD,药物的吸收有针对性的和不属预定目标的纳米颗粒,和随后的细胞内释放药物,研究[99年,One hundred.]。这些研究都是针对读者在医药科学,本文将不讨论任何进一步。

拉曼光谱已经被用于在活的有机体内和体外诊断应用程序。在前一类,努力在活的有机体内宫颈癌的诊断(49,101年癌症和工作在活的有机体内检测食管和膀胱癌102年- - - - - -104年)定义fiberoptic-based喇曼诊断的巨大潜力。石头在格洛斯特郡医院集团(英国)这些起到了至关重要的作用在活的有机体内努力;他们也有探索的可能性使用拉曼光谱术中评估的组织(105年,106年]。体外拉曼组织收集的图片,主要是利用近红外线激发,对肝107年和肺108年)和显示信息类似于图像描述的部分3.3,虽然具有较高的空间分辨率。

在这一点上,似乎红外和拉曼显微镜都有类似的诊断敏感性和正准备进入医疗诊断领域。两种方法有不同的优点(速度、能力来衡量在水环境中),可能以同样的方式相互补充经典拉曼和红外光谱是免费的。在该领域的下一个前沿的承诺是非线性技术,显示增加数据采集的数量级(109年,110年]。

4所示。结论

本文的红外和拉曼光谱成像和医学诊断。虽然有重大分歧古典生物分子的光谱,由于系统的规模和复杂性本文报道指出,这是很重要的工作是基于依赖biospectroscopy数十年的研究。方面最不同于“古典”biospectroscopy是这项新研究的严重依赖,努力在数学方法对数据分析,部分需要,收集的数据量通常措施g政权,和视觉的解释这样一个数量的数据是不可能的。此外,多元分析的方法提取小,非常适合相关光谱差异往往小于,埋在不相关的噪声水平。

因此,作者希望本研究不仅医疗诊断领域的进步通过光谱方法,也有助于开创外观和处理光谱数据的新方法。

承认

部分支持本研究的拨款CA 090346 CA 111330和CA 153148来自美国国立卫生研究院在过去五年。