文摘

Halictine-1 (Hal-1)——线性抗菌dodecapeptide孤立于群居蜜蜂毒液Halictus sexcinctus详细的光谱研究已经受到包括圆二色性、荧光和振动光谱。我们研究了Hal-1采用两性分子的能力α螺旋结构在交互模型lipid-based细菌膜(磷脂酰胆碱/ phosphatidylglycerol-based大单膜囊泡和钠dodecylsulfate胶束)和螺旋诱导组件(trifluoroethanol)。发现Hal-1响应敏感膜的构成模型和肽/脂质比。的两性分子的螺旋Hal-1似乎支持平带电表面模型的脂质颗粒与trifluoroethanol在没有方向的交互。增加一部分polyproline II型构象被发现在低肽/脂质比率。

1。介绍

有许多已知抗菌肽(安培)相当大的治疗潜力,但其确切的作用机制仍然是一个争议的问题(1]。安培cytoplasmatic膜相互作用,他们的两性分子的结构在这一过程中起着重要的作用。简单的膜渗透模型涉及的形成或溶解毛孔内的膜detergent-like方式(2,3]。这些过程导致分解细胞跨膜电位导致泄漏的内容和最后的细胞死亡。抗菌作用的机制可能与细菌细胞膜包括识别和具体的交互诱导脂质聚类或脂质相分离4,5]。

我们关注的二级结构变化小的线性抗菌肽Hal-1 (Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NH2从群居蜜蜂毒液的)Halictus sexcinctus(6响应各种membrane-mimicking环境)。我们采用圆二色性(CD)、荧光和振动红外和拉曼光谱。我们的模型环境包括2,2,2-trifluoroethanol (TFE)、十二烷基硫酸钠(SDS)和大型磷脂脂质体。

2。材料和方法

肽Hal-1是由固相肽合成使用Fmoc战略的标准程序。孤立是三氟醋酸盐盐,无缓冲的溶液pH ~ 6展出。肽的浓度为0.125毫克/毫升乳糜泻和荧光实验红外光谱和10毫克/毫升。TFE购买来自默克和SDSσ。1,2-Dimyristoyl -sn-glycerol-3-phosphatidylcholine (PC)和1,2-dimyristoyl -sn-glycerol-3-phospho - (1′-rac-glycerol)(钠盐)(PG)获得两代情极性脂质。各种磷脂混合物的摩尔比率用于制剂的大型单膜囊泡(乐芙适)根据[7]。乐芙适的大小(100海里)验证了动态光散射(Zetasizer Nano,莫尔文)。

CD实验使用Jasco j - 815光谱仪在0.1厘米石英电池在室温下。最后的光谱被表示为摩尔椭圆率Θ(度·厘米2·dmol−1每残留物)。二级结构含量估计使用Dichroweb软件(8]。

傅里叶变换红外(FTIR)光谱在ATR模式记录(2厘米的决议−133)力量向量使用单一反射水平奇迹ATR(派克技术)钻石晶体和中华人民共和国交通部负责与探测器。红外光谱中光谱传输方式记录光谱分辨率2厘米−1在室温下对力量Equinox 55使用标准壳体探测器。6的肽测量解决方案μm CaF2细胞。水的干扰信号减去使用标准算法(9]。

稳态荧光测量FluoroMax Z (Horiba Jobin Yvon)在10毫米石英细胞激发发射范围300 - 450 nm 280海里。

3所示。结果与讨论

根据圆二色性(图1)在水溶液Hal-1显示了一个流行的真正无序的结构——消极的乐队在198海里唯一的重要特性(没有正面长波长带的典型polyproline II (PPII)构象)。还有小分数的构象α螺旋(~ 10%)或一些β结构(不显示CD但是清晰可辨的红外光谱,见下文)。Hal-1滴定TFE显示逐步增加的内容α螺旋(两个消极的最小值在205和222海里)只有在某种程度上(在40% ~ 40% TFE解决方案)。TFE似乎并不能够诱导一个完整的构象变化α螺旋。

(一)
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(b)
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图1
CD光谱Hal-1滴定(a) SDS和50% TFE和(b)乐芙适不同的PC / PG成分。

SDS-containing环境中CD光谱揭示更复杂的行为。肽是nonhelical当SDS浓度很低。的存在β床单和β结果证实了数值分析的CD数据和红外光谱(见表1)。α螺旋含量达到最大值SDS浓度在临界胶束浓度(cmc), 2 - 4毫米)高于cmc时减少。再次与SDS浓度高于cmc频谱类似于不完全TFE诱导的螺旋结构。更清楚地观察到光谱变化可能是使用CD光谱的差异。随着浓度的SDS(主要是高于cmc)我们观察PPII构象的增加部分(强烈负面乐队低于200 nm伴随着积极的带附近220海里(10])。

表1
Hal-1二级结构在SDS的存在。

确认这一发现红外光谱在类似条件下光谱测量的SDS(见图2)。按照光盘数据,红外光谱谱Hal-1纯H2O显示无序结构意义重大β表(乐队在1626、1640和1685厘米−1),β词(1672厘米−1)分数11]。随着SDS浓度的形成α螺旋结构(1656厘米−1伴随着消失β表也被观察到。此外,一个小乐队的转变在1656厘米−1归因于α螺旋形或无序结构(11]在SDS浓度高于4毫米。这一发现进一步暗示的可能形成PPII构象在这种情况下。

(一)
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(b)
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图2
我吸收红外光谱酰胺及其二阶导数Hal-1滴定(a) SDS和(b)乐芙适不同的PC / PG成分。

记录,如图2和表2更复杂的膜模型,基于包含乐芙适PC-PG,影响Hal-1构象的方式在特定条件下(共同比率)与SDS。分析数据和提取清晰的画面,在这种情况下,需要考虑到交互的Hal-1乐芙适明显依赖于PC / PG比率。Hal-1形成的能力α螺旋结构显然是增强通过增加比例PG的脂质成分。在PC / PG的比率约为4:1,乐芙适法SDS在某种程度上非常相似。起初,α螺旋结构盛行的脂质/蛋白质比(L / P) ~ 8到~ 50 (α螺旋分数在90%左右),但在较大的L / P比值(~ 200)再次盖过了它PPII-type构象。一般来说,在恒定的L / P比值等于15显著增加α螺旋部分观察PG的比例增加。尽管如此,α螺旋结构观察乐芙适包含电脑,但在后者的情况下~ 40 x高的L / P比值是必要的。这些主要基于cd结果支持并行红外光谱测量。

表2
Hal-1二级结构的大单宝脂质体(L / P = 15)。

车轮投影显示Hal-1α螺旋构象采用两性分子的结构。这样的安排是更有利的互动与合作伙伴需要访问从一个方面(如平面)与合作伙伴喜欢访问从四面八方(TFE、已知的螺旋诱导代理)。如果肽与低浓度的胶束包围,也就是说,低浓度的SDS或在cmc,肽可以很容易地保持理想的两性分子的α螺旋结构。然而,如果胶束浓度增加,然后几个胶束可以争夺交互与一个肽分子和两亲的α螺旋结构不再是一个有利的安排。因此,逐步对观察PPII左手螺旋构象变化。

荧光信号引起的色氨酸残基在第三个位置,这是观察到356海里在纯水和332 nm SDS-containing环境,确认了肽可能只是坚持了胶束表面渗透(12]。胶束内的肽c端嵌入墙壁的概率很低,因为存在的带电氨基酸组。类似的效果时观察到荧光Hal-1被乐芙适包含PG。似乎肽靠双分子层表面,它不是嵌入到双分子层。这可能是一个原因drop-coating沉积拉曼光谱(13)没有变化的振动脂肽的存在。根据荧光光谱与脂质体发生只有肽采用α螺旋结构(见表2)。

4所示。结论

结合使用CD和振动光谱提供了详细信息Hal-1二级结构的变化引起的细胞膜相互作用模型。增加了α伴随着减少无规卷曲和螺旋内容β观察结构与预期但额外PPII结构出现的形成。这种构象的变化可能是由于增加了交互的一个肽与几个膜表面。两性分子的螺旋结构不再是最有利的构造,和肽应采取一个更有利的安排。这是由荧光光谱,表明肽与膜表面的渗透。明确选择肽的作用方式和进一步启发其行动的构象方面Hal-1额外的更详细的分析及其类似物在交互模型膜应该由不同的光谱技术。

承认

捷克科学基金会(不支持。208/10/0376)。