文摘

在本文中,我们描述了一种新的方法来获得D₂O / H₂O交换在光合反应中心Rhodobacter sphaeroides。方法的特点是:(i)同位素置换效率非常高;(2)极低的D₂O需要;(3)所需的短时间内脱水和D₂O补液;(iv)控制的可能性,与此同时的水化状态样本。该方法也适用于其他蛋白质。

1。介绍

不同反应傅里叶变换红外光谱(FTIR-DS)不仅在中区域(4000 - 800厘米⁻¹)是一种重要的工具的蛋白质生物化学与生物物理研究过程(1]。FTIR-DS的潜力充分利用已知蛋白质的结构时,至少一些乐队的差光谱已经被分配给一个给定化学一半的振动内的特定氨基酸或辅助因子的蛋白质。一系列的策略存在正确的赋值(1]。其中,红外光谱的比较不同光谱记录在H₂O D₂O通常是第一步。事实上,H₂由D O替换₂需要交换的N - O - S -绑定质子带谱的变化。不完整的主要缺点来自交换(即使是水可残留),导致“混合”D₂O / H₂O谱。

光合反应中心(RC)Rhodobacter (Rb) sphaeroides在生物能学代表一个模型系统,特别是适合调查电子转移(ET),质子转移和醌氧化还原化学在蛋白质2]。这也是一个优秀的系统研究矩阵对膜蛋白的动力学的影响和等过程[3]。的结构Rb。sphaeroides钢筋混凝土是在原子分辨率及其光化学详细特征(4,5]。

FTIR-DS研究Rb。sphaeroides钢筋混凝土进行了超过20年的时间里(见[6)最近的一个评论),导致乐队标志的辅因子,氨基酸侧链和内部水分子(6,7]。RC也一直在研究时间分辨FTIR-DS ([8- - - - - -12)和引用其中)和用作“案例研究”来开发和测试新的数据分析技术([12,13)和引用)。尽管如此大量的数据,几个问题仍在争论(见例如,[10,11,14])。

在最近的一份工作(15)已经表明,钢筋混凝土的水化状态控制等反应相关的蛋白质动力学。水化状态被使用一个等压精确控制方法,它由在平衡脱水RC电影的存在饱和盐解决方案提供明确的相对湿度值,r(15]。在目前的工作表明,上面提到的等压法可以用来获得H的效率非常高₂O / D₂O交换Rb。sphaeroidesRCs。该方法可以扩展到其他蛋白质。

2。材料和方法

RCs提取Rb。sphaeroides应变2.4.1使用lauryldimethylamine N-oxide (LDAO)作为洗涤剂和纯化后[描述的过程16]。红外光谱光谱被记录在一个力量IFS 88光谱仪。碳硅棒源和壳体探测器。完整无缺的RC在样品室检查记录FT-UV-Vis光谱在15000 - 10000厘米⁻¹使用硅光电二极管作为探测器范围。温度设置为281 K的N₂低温恒温器(牛津仪器)。

准备在CaF RC电影₂窗口使用40 -μ60 L滴μRC solution(10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.0,LDAO 0.025%和10毫米o-phenanthroline)。一个小隔间(卷~ 1毫升)被插入CaF获得₂窗口携带电影和第二个,由一个o形环,剪切试样夹。的相对湿度车厢内包含RC电影是由几个控制μL滴饱和氯化钠或氯化锂的解决方案来实现在281 K的值分别为76%和11% (15]。

3所示。结果与讨论

光谱记录在两个水化水平(%和76%)如图1(一)。酰胺(~ 3295厘米⁻¹),我(~ 1655厘米的酰胺⁻¹),酰胺二世(~ 1550厘米⁻¹与光谱)乐队很容易识别,在协议中获得风干RCs重组磷脂囊泡(17]。周围的山峰2900厘米⁻¹归因于各种CH₂拉伸模式(17]。哦的酰胺频带重叠很大程度上伸展带水。结果大乐队~ 3300厘米⁻¹强烈样品脱水时减少了平衡%相比%。样品的脱水可以更好的评估(带水)组合,集中在5150厘米⁻¹,放大如图所示1 (b)。面积低于这个乐队已被证明是成正比的含水量,独立于H键组织(15,18]。峰值为4850厘米⁻¹水,在低波数的组合乐队,是由于北半球的结合拉伸频率为3280厘米⁻¹和肽频率为1550厘米⁻¹(15),显然是在解决%。当水组合乐队是纠正这个贡献,减去背景(15),它可以估计%的不到20%样品的水分含量检测%被保留。协会的水可见~ 2100厘米⁻¹在频谱%也强烈降低%(图1(一))。

当脱水样本(%)是患者在生理盐水中D₂O (%)光谱表现出强烈的改变、诊断的一个有效含重氢。在图1(一),所有的光谱被规范化的振幅酰胺我乐队,由D的影响较小₂O替换而酰胺二世乐队。虽然该地区的酰胺我从水弯曲模式包括一些贡献,规范化的振幅酰胺我带允许一个更好的比较之间的光谱记录在H的存在₂O和维₂在阿%。

图1(一)表明在补液和D₂O乐队集中在3300厘米⁻¹在振幅几乎减少了一半,而一个记录在H₂在阿%,持续减少的水哦拉伸贡献和酰胺的部分含重氢NH组一个乐队。正如所预料的那样,在补液D₂啊,哦拉伸带的水是蓝移约800厘米⁻¹(19),导致一个强大的吸收带集中在2500厘米⁻¹。在水化样品%,在H₂在D O和₂O,酰胺带展品肩高的波数。这个肩膀,基本上消失在脱水的样本%,是由于水噢模式和延伸至和NH组织的蛋白质。我们建议肩脱水样本中反映出的消失不仅水损耗,也可能转向低波数的蛋白质哦和NH组,大概是因为H-bonds的加强。这个解释可以解释为什么肩膀变得再次检测时补液和D₂啊,虽然减少幅度和宽度。因为在维₂阿含重氢的程度非常高,H₂O本质上是没有(见下文),蛋白质的贡献哦和NH团体可能负责带肩氘样本。

众所周知,N-deuteration转换酰胺二模式很大程度上是CN伸缩振动在1490 - 1460厘米⁻¹名叫酰胺二世”乐队(1]。符合这一变化,我们观察一个疲软的乐队在1550厘米⁻¹(酰胺II)和吸光度的大量增加1420至1500厘米⁻¹,峰值为1460厘米⁻¹,这可以归因于酰胺二世的乐队的出现。有趣的是峰值为1550厘米⁻¹也出现,对应的波数预期水协会乐队在D₂替换(阿19]。

D的程度₂O替换可以从图来进行评估1 (b)。与D补液后₂啊,5500和4700厘米之间的光谱⁻¹还展示了NH乐队在4850厘米⁻¹,()组合乐队的水基本上消失了。我们推断D的效率₂O替换实现在补液的D₂O大于95%。自补液与维₂O发生在样品仍保留一些残余H₂O(看频谱%在图1 (b)),平衡与D₂O蒸汽不仅导致补液氘水,但也导致残余H的交换₂与D O₂O。

上面讨论的等压同位素替代方法提供了重要的资产:(i)同位素替代的效率是非常高的;(2)的D₂哦,需要的是极低;(3)脱水和D₂O补液需要相对较短的时间(不超过6小时相比,例如,透析超过12);(iv)的水化状态样本可以通过(与此同时控制)组合乐队的水15]。

确认

作者感谢w . Leibl博士(CEA-Saclay)帮助红外光谱测量。意大利的财政支持MIUR(格兰特普林斯顿2008 zwhzjt)由m Malferrari和g . Venturoli感激地承认