拉曼显微镜的酵母液泡

文摘

在目前的工作,真正的能力共焦拉曼显微镜监控活酵母细胞内液泡的化学成分研究和批判性评估。简单、经济、实用的协议酵母固定化适合不费力,高通量,空间解决拉曼测量检测他们可能对细胞的生理状态和生存能力的影响。我们已经证明,获得拉曼光谱从统计上声音的固定化细胞和采用先进的多元光谱分析方法,酵母液泡的化学成分可以可靠地研究。似乎最容易而准确地量化聚磷酸盐的浓度,可以明确地确定由于明显的拉曼特性。label-free,我们的方法可以用于常规和无创监测的化学成分液泡活酵母接触到各种压力因素,生物医学研究的重要病原体的信息。

1。介绍

酵母白色念珠菌是一个投机取巧的代表严重威胁人类病原体免疫功能不全的人。它表现出非常大的代谢灵活性,使真菌拓殖主机领域等皮肤,血液、口腔或阴道粘膜。白念珠菌能生存面临严重营养限制和逃避宿主免疫防御1]。最近的研究表明对改编的液泡的意义白念珠菌这些不断变化的环境。液泡作为商店的氨基酸、离子,和众多代谢物。他们是参与体内平衡和渗透调节pH值,它们在消化中起关键作用的蛋白质和回收的营养2,3]。一个白念珠菌突变体缺乏辨认液泡无法杀死宿主巨噬细胞(4]。的化学成分信息活细胞中的液泡暴露于各种外部因素的重视从而可以开发新型抗真菌的策略。

在过去的十年中,共焦拉曼显微镜一再显示为有前途的非接触式和非破坏性方法适用于测定细胞内化学成分和化学成像的活细胞5]。然而,试图采用拉曼显微镜常规使用的微生物学应该应付许多技术和方法上的问题,例如,充分保证固定不动和生存能力的细胞在接触激光,折中要求高空间分辨率和拉曼信号的固有缺点,长时间采集需要提高信噪比,歧视的光谱贡献培养媒体和支持材料,获得统计上声音数据和治疗,以及解释复杂的拉曼光谱在化学成分的浓度。

在目前的工作,适用性的共焦拉曼显微镜测定化学成分的液泡内活酵母测试和批判性的评估。使用显微镜载玻片和盖玻片poly-L-lysine功能化,简化,减少了大量劳动固定化酵母细胞的实现。的坐骑是适用于高通量、空间解决拉曼测量。随着固定化酵母立即停止其细胞周期由于用水洗涤,在几个小时他们仍然活着,可以获得拉曼光谱从众多细胞的液泡。使用先进的多元方法[6,7),意思是拉曼光谱中液泡的酵母提取文化和比较。在所有特定化合物在这个舱本地化,振动的多磷酸盐似乎是最容易和准确量化的特点。我们表明,拉曼显微镜可以用于未来的实验作为一种工具来分析液泡假丝酵母酵母培养在不同的营养条件下,接触到各种压力因素和/或现有的在不同的生理状态。

2。材料和方法

的白念珠菌菌株用于这项工作是临床孤立他169年从真菌学的收集获得的医学院,大学深造,奥,捷克共和国。酵母细胞在营养丰富的YPD在37°C的环境介质(2%蛋白胨,2%葡萄糖,酵母提取物1%)。轻轻整除的细胞悬液离心(500 g×2分钟),用水洗了两次,最后resuspended到五倍的水更少。几毫升水中悬浮的应用于poly-L-lysine-coated幻灯片,覆盖着一个poly-L-lysine-coated盖玻片,和密封具有明显的指甲油。当应用适量的细胞悬液,轻轻按下盖玻片对幻灯片,结合空间限制的化学固定固定化细胞在一个层。细胞从而接触滑动以及盖玻片。消除玻璃衬底的自体荧光,fluorescence-free borofloat幻灯片和盖玻片(nexterion schott)。

拉曼光谱共焦拉曼显微分光计上被LabRam HR800 (Horiba)用氦氖激光激发632.8 nm(3 - 8兆瓦的示例)。获得在拉曼光谱局限于液泡体积,100 x油浸物镜(NA 1.40)结合使用相对较小的共焦针孔(200μ米)消除拉曼信号从盖玻片和幻灯片。拉曼光谱范围在500 - 3900厘米⁻¹收集使用收购时间60年代的每一个细胞。通常,拉曼光谱的50 - 80不同的细胞相同的收集。先进的背景——和medium-correction程序基于奇异值分解(圣)方法被用于光谱治疗(7]。统计评估数据集和可视化的光谱变化是基于提供的因子得分计算分析。最后,水的光谱归一化使用乐队OH-stretching振动在~ 3400厘米⁻¹作为一个内部强度标准。

3所示。结果与讨论

的主要问题拉曼显微镜和不依从活细胞成像是他们的固定。应该附着在固体表面的细胞;然而固定不应消极影响他们的生理状态或光谱测量。在活细胞中也很重要,固定化过程快,并不代表过度压力。从这一点来看,协议依赖于固定在聚合物矩阵(琼脂、琼脂糖、果胶、明胶)在高温或使用高粘度介质被发现不适合常规拉曼实验由于热冲击的风险或光谱贡献固定介质。作为替代,我们试图固定假丝酵母在poly-L-lysine幻灯片修改。细胞被留在栽培介质或纯水清洗,掉在一个幻灯片,直接观察到水浸客观或覆盖着盖玻片和观察到的油浸的目标。然而,固定接触一个功能化表面拉曼测量证明是不够的。甚至细胞的慢动作在收购期间,此外,通常由光学镊子升级激光束完全打乱了空间分辨率的影响。因此,结合幻灯片和盖玻片功能化的胶原蛋白或poly-L-lysine测试,后者被证明是更有效的。除了更好的稳定之间由于紧密的监禁两个官能团的表面,固定细胞密度较高的视野和他们的安排到一个层允许半自动的数据收集在大量的单个细胞。

如图1很容易区分,一些酵母胞内结构视频图像;但是有些是几乎相同的形状和颜色,例如,油脂的液滴(E)和圆protein-containing结构(C和D)。尽管如此,他们能够清晰把握由于不同的拉曼光谱(图1),不需要染色。化学成分的细胞内结构可以进一步详细分析,虽然可靠的频谱分配和分解为纯组分的光谱可能是困难的。

在液泡中,我们发现拉曼光谱可以用于识别和分析他们的化学成分。平均细胞间变异性和提取光谱代表整个细胞培养,拉曼光谱已获得不同细胞的液泡。在同一生产几十个山拉曼光谱测量总共不超过1.5小时,相对应的时间生成的时间假丝酵母条件下培养。所有收集的数据从细胞培养在相似的条件下,应该有相似的生理状态是被测点随机过程(7)提取典型的拉曼光谱(图1光谱变化,B)和代表。根据多次实验,通常只有两个正交谱组件被披露在数据集,提出公平的化学均匀性细胞的文化。细胞尤其是在不同的相对浓度的主要组件,没有在他们的缺席。详细的光谱分析显示拉曼特性的氨基酸,脂肪,和聚磷酸盐的主要成分假丝酵母液泡。尤其是聚磷酸盐表现出典型的拉曼乐队~ 688厘米⁻¹和~ 1154厘米⁻¹在液泡被发现在相当高的浓度。我们建议多磷酸盐乐队在1154厘米⁻¹可以作为标志的液泡,因为它没有检测到的拉曼光谱假丝酵母隔间。虽然细胞来自相同文化在至少根据视频图像类似的生理状态,绝对浓度的聚磷酸盐液泡被发现比其他成分的浓度变化更多。它是通过适当的归一化强度定量确定的1154厘米⁻¹乐队对OH-stretching带水的强度在3400厘米⁻¹(图1)。实际多磷酸盐浓度的液泡白念珠菌标准条件下培养YPD中发现不同有几十到几百毫米(表示的浓度)。多磷酸盐浓度的差异可能源于研究细胞的生理状态的差异。因此拉曼显微镜提供了无法获得的信息原位活细胞的其他方法。

4所示。结论

在目前的工作中,固定协议适用于拉曼显微镜non-adherent细胞进行了测试。这是证明妥善固定假丝酵母细胞可以收集在拉曼光谱在活细胞单独的隔间。细胞内的隔间的光谱可以明确识别类似的外观以及调查他们的化学成分。我们报告的酵母液泡可以可靠地确定多磷酸盐的拉曼乐队在688和1154厘米⁻¹在其他酵母隔间,光谱特性失踪。使用多磷酸盐喇曼乐队规范化对水信号,实际多磷酸盐浓度可以测量内活细胞的液泡。拉曼显微镜将进一步的调查工作白念珠菌空泡及其化学成分受营养、细胞周期条件下的压力,或阶段。

确认

捷克共和国教育部(MSM0021620835),捷克共和国授予机构(P208/10/0376和310/09/1945),和研究项目Z 40550506承认金融支持。

引用

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2. c·李和p . m·凯恩”酵母lysosome-like泡:端点和十字路口。”Biochimica et Biophysica学报,卷1793,不。4、650 - 663年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
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4. g·e·帕尔默·m·n·凯利,j . e . Sturtevant”所需的白色念珠菌液泡是分化和高效的巨噬细胞杀死,”真核细胞,4卷,不。10日,1677 - 1686年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
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