文摘
I型和静脉注射胶原蛋白是皮肤的重要成分。I型胶原蛋白被发现在所有皮肤层比例高,虽然IV型胶原蛋白是本地化的基底膜dermo-epidermal结(DEJ)。这些蛋白质强烈改变在衰老和癌症进展。尽管他们拥有氨基酸成分,接近,他们同样重要的存在结构差异诱导特定的物理化学性质。拉曼光谱是基于无损光与物质的相互作用。这种技术许可调查的内在分子组成的样品没有染色或特定的准备。我们的研究的目的是研究I型的分子构象之间的相关性和静脉注射胶原蛋白及其拉曼特性。我们表明,信号可以显示特定的每个蛋白质,他们翻译两个胶原蛋白之间的结构差异。从这个胶原蛋白的光谱特征,分析皮肤的部分也可以识别光谱真皮的标志,表皮,表皮和真皮接口。这些初步结果代表基本数据进行进一步研究,尤其是探测皮肤分子按时间顺序的老化引起的改变。
1。介绍
胶原蛋白我和IV keyconstituents皮肤和参与各种physiopathological改变与癌症和衰老有关。I型胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质之一,存在于所有皮肤层皮肤的高比例(85 - 90%)。它会导致伟大的抗拉强度和允许承受变形的真皮。在按时间顺序的老化,I型胶原真皮越稀疏的可溶性(1]。发现在基底细胞癌,I型胶原降解的瘤旁真皮(2]。IV型胶原蛋白是本地化的基底膜dermo-epidermal结(DEJ);这个成分保持完整性至关重要,稳定,这种薄膜的功能。抗血管新生和IV型胶原蛋白被证明在体外抗肿瘤活性;这些属性是由NC1域的蛋白质(3- - - - - -8]。皮肤老化,基底膜的厚度增加但IV型胶原蛋白含量下降(9]。
所有的胶原蛋白类型由一组三个叫做原胶原蛋白多肽链,大约300 nm和360 nm长I型和静脉注射胶原蛋白,分别为(10]。每个多肽链的特征是一个Gly-X-Y频繁序列对应X Y脯氨酸和羟脯氨酸(11]。每个Gly-X-Y三肽单位,只有一个直接链内的氢键之间- h组甘氨酸和C = O组X残渣。此外,稳定的相互作用之间的氢结合源自网络水和羟脯氨酸残基(12]。这些不同类型的交互确保原胶原蛋白triple-helical构象。的I型胶原真皮,原胶原蛋白主要是相互关联的三种不同类型的交叉连接(lysinonorleucine、glucosyl-galactosyl-hydroxylysinonorleucine histidinohydroxymerosine链接),形成一个非常抗纤维(10]。因此,当前“纤维”是一个形容词I型胶原蛋白。IV型胶原结构不同于胶原蛋白i .它不形成纤维但平面网络,稳定的安排四个原胶原蛋白的氨基端域。这些领域在四聚体相关联,通过二硫键和lysinonorleucine glucosyl-galactosyl-hydroxylysinonorleucine交叉连接构成了7 s域(10]。胶原IV的另一个特性是几个中断Gly-X-Y序列的存在(13]。
目前,免疫组织化学和免疫印迹技术是主要的技术来探测在基底膜胶原IV内容,探讨分子改变如与年龄增长有关的(10,14]。这些技术的弱点是他们破坏性的自然和必要的使用外在标签。相比之下,拉曼光谱是一种非破坏性的方法基于光与物质的相互作用。这种振动技术是一个有趣的label-free工具来检测样品的内在的分子组成和访问一些结构信息的保留样品的完整性。据我们所知,没有研究指人类胶原IV的拉曼光谱的分析已经发表。I型胶原蛋白,研究显示原位拉曼显微镜获得的优势构象信息皮肤部分(2,15]。
在我们的研究中,拉曼光谱被用来研究I型的分子构象之间的相关性和静脉注射胶原蛋白及其拉曼特性。从皮肤的部分,我们还研究了拉曼信号DEJ水平,而真皮和表皮签名。
2。材料和方法
2.1。拉曼仪器
拉曼数据收集LabRAM显微分光计(Horiba Jobin Yvon,维d 'Ascq,法国),配备CCD探测器,使用660 nm激光二极管作为激励源。100 x目标(徕卡)允许入射激光束和收集拉曼散射。光谱分辨率是4厘米−1使用950槽/毫米全息光栅。
2.2。参考胶原蛋白
纯从Sigma-Aldrich IV型胶原蛋白了。I型胶原蛋白是在我们实验室准备从雄性sd大鼠中(萧条、圣Doulchard、法国)尾腱0.5醋酸提取(16),透析对蒸馏水和冻干。
2.3。拉曼分析参考胶原蛋白和组织部分
I型CaF和静脉注射胶原蛋白沉积2窗口(Crystran有限公司,多塞特郡,英国)。光谱的胶原蛋白是获得使用的模式。收购时间设置为30 s /光谱和光谱范围500 - 1800厘米−1。皮肤分析,一个皮肤样本收集的乳房得到癌症乳腺癌手术期间,从一个41岁的病人。正常的皮肤样本,特征标准组织学,被冻结,薄片(5μ米)沉积在CaF2窗户。分析了三个组织部分由拉曼光谱成像模式。总共6地区约50×50μ米2DEJ周围都是通过点扫描使用步长为0.5μm。
3所示。结果
3.1。拉曼分析类型的我和静脉注射胶原蛋白
图1显示我和静脉注射胶原蛋白类型的典型的拉曼光谱基线校正和归一化后我带的酰胺。我带集中在1668厘米的酰胺−1和1673厘米−1分别在I型和IV型胶原蛋白。它们源自C = O拉伸Gly-X-Y peptidic债券的三肽序列。酰胺的频移我乐队表明不同比例的氨基酸残基之间的X和Y位置两个胶原蛋白。酰胺III地区也提出了两种胶原蛋白之间的显著差异。强度比我的差1271年/我1246年反映了脯氨酸残基的比例不同。事实上,振动在1246厘米−1和1271厘米−1分别被分配到脯氨酸和proline-poor地区(17]。这个特性与不同的光谱资料820 - 985厘米−1的范围内。峰值为875厘米−1来自羟脯氨酸环(12]。振动在856和920厘米−1被分配到脯氨酸环;938厘米−1带对应于碳碳伸缩振动(vc- - - - - -c)的骨干由Gly-X-Y序列(12]。考虑光谱酰胺我乐队的正常化,脯氨酸和羟脯氨酸的含量残留在出现胶原IV高于胶原蛋白I两个乐队在1004和1033厘米−1分配到苯丙氨酸在胶原IV更强烈;这个观察可以翻译较高含量的苯丙氨酸在胶原IV或构象差异两种蛋白质之间的这些残留的水平。振动在815厘米−1,可见空泡和分配给C-O-C拉伸(18),可以与glucosyl-galactosyl-hydroxylysinonorleucine原胶原蛋白之间的交联(10]。在胶原蛋白我更强烈;这表明内容使交联的胶原蛋白我高于胶原IV。这个光谱特性是与胶原蛋白的纤维结构即信息关于二硫化物桥也可以提取500 - 550厘米−1光谱范围。IV型胶原的s振动出现在510厘米−1和540厘米−1。这些信号是相对的二硫桥7 s域;他们表明,这些桥梁是非常稳定的gauche-gauche-gauche构象(510厘米−1)和更不稳定trans-gauche-trans构象(540厘米−1)[19]。这些山峰也与c伸缩振动在722厘米−1。这个构象信息具体的7 s域可以作为原位标记的胶原IV大分子网络的稳定性。在I型胶原蛋白,s振动在510和540厘米−2没有出现明显。
3.2。拉曼分析表皮、真皮和表皮和真皮接口
图2显示了平均和标准偏差光谱()的表皮、真皮和表皮和真皮接口。考虑到信号变化,重要的光谱差异调查皮肤结构的酰胺可见我,第三酰胺、脯氨酸的乐队。我带的酰胺是集中在1668厘米−1波数在真皮;这个值被分配给我胶原蛋白纤维(2]。在表皮,达到1654厘米−1是代表α螺旋结构的角蛋白(20.,21]。表皮和真皮的接口,我带的酰胺是集中在1658厘米−1,表明主要α螺旋结构。表皮之间的结构差异,真皮,表皮和真皮界面也可以显示在酰胺III地区。振动出现在1246厘米−1和1271厘米−1与脯氨酸(非极性)和proline-poor(极性)地区的胶原蛋白17]。表皮光谱的峰值为1271厘米−1是相关的α螺旋结构的角蛋白(15]。在800 - 980厘米−1光谱范围,分配给羟脯氨酸的山峰(876厘米−1)和脯氨酸(920厘米−1)残留存在更高的光谱强度的真皮和表皮和真皮界面比表皮。信号在815厘米−1胶原蛋白交联,分配给C-O-C伸缩振动,也可见真皮和表皮和真皮接口而不是在表皮的层面上。在830年达到顶峰,853厘米−1被分配到费米紧身上衣的酪氨酰残基的蛋白质。在表皮,峰的强度在830厘米−1高于表皮和真皮的接口。在真皮这个峰值不明显。此外,费米的强度比紧身上衣,丰富的蛋白质构象的酪氨酸残基(22),皮肤结构之间的差异。根据这个比例的价值,我们可以确定暴露或埋酪氨酸残基在蛋白质的构象,分别诱导内部或分子间键合。二硫化物桥的光谱范围(500 - 550厘米−1),没有光谱区别表皮,真皮,表皮和真皮界面出现明显。s伸展振动特定的胶原蛋白是很难被察觉,因为其他成分,如角蛋白(表皮),弹性蛋白、纤连蛋白(真皮)和层粘连蛋白(DEJ)可以叠加信号。
4所示。讨论和结论
我们的研究结果表明,拉曼光谱许可来识别结构类型之间的差异我和静脉注射胶原蛋白。之间的光谱差异也明显发现真皮,表皮和表皮/真皮接口。进一步的工作将致力于皮肤原位分析部分样本。光谱特性特定类型的我或静脉注射胶原蛋白表示基本数据进行进一步研究,尤其是探测皮肤分子按时间顺序的老化引起的改变。此外,它必须表明,光谱收集在表皮和真皮界面组成不仅DEJ信号,而且这两个信号从表皮和真皮。事实上,基底膜(≈100海里)的DEJ比名义光斑大小细的分析在传统拉曼显微镜。新仪器的发展,基于近场光谱,目前进行重点分析dermo-epidermal结。
确认
t·t·阮博士奖学金的接受者和硕果累累的CIRGE区域。作者要感谢Ligue靠le癌症(拉西de l 'Aisne) INSERM的内线Imagerie, CNRS项目Exploratoires Pluridisciplinaires,和CNRS PIR Longevite et Vieillissement金融支持。