文摘

我们引入了一个新的有前途的方法测定寡肽pKa常量的固有荧光团和光谱成分指的是他们不同的带电状态。该方法是基于多波长光谱酸碱滴定数据的因子分析。作为一个例子,我们现在研究中的应用的短段马德斯盒子,这是一个高度保守的序列的一个所谓的家族转录因子,通过紫外吸收和荧光光谱技术。研究寡肽没有色氨酸但包含一个酪氨酸作为一种内在的荧光团和吸收器。结果显示良好的灵敏度和光谱选择性的方法,从而可以被视为一种互补技术常规电化学方法。

1。介绍

蛋白质是生物分子,它们通常含有氨基酸与酸性和碱性官能团。这些氨基酸可以分为几个类别根据其残留电荷,极性和疏水性。滴定氨基酸的蛋白质可能完全暴露在溶液或埋在蛋白质的三维结构。他们pKa常量因此受到蛋白质折叠和可能敏感蛋白质寡聚化,绑定的配体,变性,等等。

pKa常数测定的蛋白质通常是由电化学技术(例如,偏振、电位和伏安滴定法)。直接可以使用核磁共振等技术在小肽来监测他们的电离状态。

还有几个方法,计算生物学,分子的造型,和结构生物信息学,可以用来估计大致pKa滴定氨基酸在蛋白质的价值观。

在这项工作中,我们提出一个高度敏感的pKa方法测定(补充前面提到的方法),基于光谱数据的因子分析,即从紫外吸收和荧光测量获得。类似的方法虽然可以应用于任何其他类型的光谱数据。应该提到,因子分析已被用来确定pKa价值观有机小分子(1,2];然而,它并没有被用来研究肽到目前为止(以我们目前的知识)。

马德斯框转录因子家族数量超过200的会员在其中扮演着重要的角色在高等生物的基因调控。马德斯框缩略词来自首字母最初确定的四个家族成员:MCM1, AG) DEFA, SRF [3]。这些转录因子共享一个高度保守的DNA结合主题显示广泛的56个氨基酸序列同源性。还对有针对性的dna是如何被这些转录因子。结构可用数据表明马德斯盒子protein-DNA复合物结构同源性很高,但DNA结合过程的差异(4- - - - - -9]。

核心SRF包含自身的固有荧光团:三个酪氨酸与不同amino-acidic环境。为了区分这些酪氨酸和不同环境的影响,pH值依赖的测量两个小段SRF,每个包含一个酪氨酸,进行了利用紫外吸收和荧光光谱:154年KLLRYTTFS162年和168年IMKKAYEL175年。

2。材料和方法

2.1。材料

八聚物的合成寡肽的序列Ac-IMKKAYEL-amid,平均水平 = 1 0 3 6 。 3 0 ,是根据Fmoc / tBu固相策略10]在433多肽合成仪(美国CA应用Biosystems-Forster城市),使用Fmoc酰胺树脂(应用生物系统公司)。质量特性的纯化肽(98%以上,rp)与期望值一致。

高效液相色谱纯化寡肽98% Ac-KLRRYTTFS-amid, = 1 2 1 2 。 4 3 ,从Apigenex购买(布拉格,捷克共和国)。纯度和质量体重是由高效液相色谱测试和女士。

光谱纯KOH和HCl是来自Normapur和默克公司。

2.2。光学吸光度和荧光测量

光吸收光谱被记录在卡里3 e紫外可见分光光度计。荧光测量进行一系列SLM Aminco-Bowman 2发光光谱仪。使用的激发和发射光谱带宽4海里。的光学路径长度是1厘米。在激发在276 nm,酪氨酸和tyrosinate有助于荧光发射。荧光光谱都纠正了小内滤效应(光密度波形0.1)(11),和贡献的瑞利和拉曼光散射被减去。光谱也纠正(轻微的重正化强度)浓度的微小变化产生的寡肽的盐酸和/或KOH。

荧光和吸收光谱测量寡肽的pH值范围从3 - 11在室温(20°C)。寡肽的浓度 8 ⋅ 1 0 − 5 M。添加盐酸或KOH没有造成降水。

测量智商的pH值是由科学仪器酸度计IQ170G配备不锈钢探针。

2.3。光谱分析

找出各个组件形成产生的荧光或吸收光谱,我们提交的光谱 ( ) 获得在不同pH条件因素分析,也就是说,奇异值分解(圣)算法分解一组 光谱为一组正交归一化光谱资料 ( ) , = 1 , 2 , … , , ( ) = = 1 ( ) , ( 2 。 1 ) 的归一化系数 引用的相关部分 th光谱剖面 ( ) 在原始的光谱 ( ) (12]。奇异的数字 光谱资料的统计权重。作为谱组件要求达到一个下行的奇异值,通常在右边几第一项就足以在一实验误差近似原始的谱集。这个值的 被称为因素维度。它代表了最小数量的独立组件解决分析谱集。

在的情况下 实际上等于2(摘要),光谱组件由两个不同的组件 和 从吸收或荧光光谱()可以提取的,所以 ( ) = ( ) ∗ + ( ) ∗ , ( 2 。 2 ) 在哪里 ( ) 和 ( ) 是原始光谱谱组件形成目前的浓度比例 和 。这些都是由当前的pH值 = 1 1 + 1 0 p H − p K 一个 , = ∗ 1 0 p H − p K 一个 , ( 2 。 3 ) pKa在哪里发色团的离解常数(这里是酪氨酸)。

由于因素两个维度,两者兼而有之 ( ) 和 ( ) 组件可以近似为线性组合(与系数 和 )的第一个和第二个圣谱配置文件 ( ) = 2 = 1 ∗ ( ) , ( ) = 2 = 1 ∗ ( ) 。 ( 2 。 4 )

考虑到上述基本计算公式 ( ) 和正交奇异值分解光谱组件,我们获得了最后的组 2 × 方程 = ∗ 1 1 + 1 0 p H − p K 一个 + ∗ 1 1 − 1 + 1 0 p H − p K 一个 , = 1 , 2 , … , = 1 , 2 。 ( 2 。 5 ) 五个未知参数 ( p K 一个 , , ; = 1 , 2 ) 可以通过同时解决非线性最小二乘匹配的左右(2。5)左边的。

3所示。结果与讨论

3.1。吸收光谱

衡量地区220 - 330 nm,寡肽显示酪氨酸的典型特征峰在275海里。明显的变化观察通过增加pH值:吸收带移到长波长为294 nm,增加了1.5倍的强度(数据未显示)。

3.2。荧光光谱

在测量区域290 - 390 nm,寡肽都有酪氨酸的典型特征峰在303海里。pH值的增加,排放显著降低由于去质子化的酪氨酸tyrosinate(见图1(一)),它有一个低得多的荧光量子产率(13),其排放转移到更高的波长约为345纳米(14]。


图1
荧光的pH值依赖马德斯盒段Ac-IMKKAYEL-amid (a),确定分数(b),规范化的发射光谱的两个components-normalization因素 = 0 。 0 0 3 , = 0 。 2 0 1 (c)和因子分析结果(d)。
3.3。pH值依赖荧光光谱分析

因子分析的结果应用于荧光光谱的寡肽Ac-IMKKAYEL-amid图所示1(d),我们得到一个因素维度2(一样吸收光谱)。第一个光谱剖面 1 代表平均测量光谱,第一个系数 1 因此描述整个光谱强度的降低第二光谱剖面作为博士的函数 2 ,不如第一个重要100倍,占主要的光谱变化。的贡献这个概要文件是关于零光谱pH值低于7,而高于这个pH值增加时,可以看到从第二系数的行为 2 。

通过使用我们的方法, p K 一个 常数测定荧光和吸收数据与一个好的寡肽的协议。从寡肽Ac-IMKKAYEL-amid吸收我们获得 p K 一个 = 9 , 4 5 ± 0 , 0 5 ,从它的荧光光谱 p K 一个 = 9 , 4 3 ± 0 , 0 6 。为寡肽Ac-KLRRYTTFS-amid吸收,我们获得的 p K 一个 = 9 , 0 1 ± 0 , 0 5 ,利用荧光光谱,我们计算 p K 一个 = 9 , 0 3 ± 0 , 0 6 。这是在良好的协议与先前决定的酪氨酸pKa各寡肽(15,16]。

在通信与我们的假设,我们观察到带正电氨基酸(R:精氨酸;凯西:赖氨酸)自由州的离解常数酪氨酸转变为较低的值(自由酪氨酸的离解常数为10.0715,17])。

此外,使用这种方法,我们能够区分两个发射组件(参见图1(c))和各自的分数(图1(b))。组件 代表了酪氨酸发射光谱(最大303海里),而组件 代表tyrosinate的排放(最大345海里)附近,约60倍。

4所示。结论

使用因子分析在吸收和fluorescence-monitored滴定,我们能够确定 p K 一个 常数两个tyrosine-containing寡肽具有精度高以及吸收和荧光光谱资料对应的不同形式。此外,我们获得的定量信息的特定环境的影响 p K 一个 酪氨酸,这将帮助我们更好的区分不同马德斯酪氨酸SRF。

提出方法适用于任何寡肽轴承至少一个pH-dependent光敏氨基酸或探针和一般可以应用于大量的光谱技术反映了质子化作用肽的变化。进一步研究大寡肽段将被执行。

确认

这项工作是由捷克科学基金会(项目202/09/0193)和查尔斯大学的资助机构(402111项目)。b .Řezačova欣然承认法国政府支持她留在Laboratoire酸Nucleiques Biophotonique。