文摘

快速和可再生的细菌病原体之间的歧视是一个明确的目标在微生物实验室在处理被感染的临床样本。在这项研究中拉曼光谱来自至少30殖民地等四种细菌的菌株葡萄球菌epidermidis(1457和9142)大肠杆菌使用英国(K12的和前10名)通过拉曼显微镜系统。基于主成分分析表明,即使应变微分(例如,1457与9142或K12与全球)是可能的。

1。介绍

可再生的和健壮的细菌鉴定是尖端临床微生物学的关键。目前的方法确定的身份未知的细菌在临床标本包括传统方法基于生物化学(例如,API测试),具体的活动(如凝集),或增长的需求(例如,高氯化钠浓度)。更现代的方法现在自动化生化测试(凤凰城)和发展特定的分析方法确定细菌的DNA(聚合酶链反应)或蛋白质(MALDI-TOF);见,例如,(1,2]。

在过去的10年左右,拉曼光谱得到更广泛的接受作为细菌鉴定方法。研究表明,拉曼光谱产生细菌菌落给予足够的信息来识别和区分医学相关的微生物,包括葡萄球菌spp。假丝酵母种虫害和大肠杆菌(见例如,(3,4])。我们也用拉曼光谱来确定细菌物种和建议,具体地说,在某些情况下它可能是一个有用的技术来检测生物膜的形成(5]。其他人已经证明,只要可以增强的拉曼信号,通过表面增强(ser)或tip-enhanced(参数)拉曼光谱,光谱也可以生成从单一细菌(见例如,[6]);这导致微生物的可能性可以直接追踪和识别在生物液体。

因此,以前的工作已确认潜在的拉曼光谱鉴别细菌。更少的工作都集中在这个方法的限制和再现性真实测量的临床实用性。我们已经分析了众多殖民地造成相同的细菌标本,这样可以确定明确的限制和敏感性和拉曼光谱在常规临床诊断的潜力可以测量。

2。仪器和方法

我们的实验中使用的仪器是英国inVia系统用电荷耦合器件(CCD)探测器和莱卡DM2500显微镜。显微镜是提供一个机动样品阶段。显微镜配备5 x 20 x, x 50, 100 x客观镜头,和基于windows的拉曼环境软件(WiRE3.2)用于为数据采集控制系统。两个耦合的激光设备inVia拉曼系统,操作激发波长532 nm和785 nm);工作报告我们只使用近红外光谱在785 nm激光激励源。

大量的细菌标本,即美国epidermidis1457年和9142年大肠杆菌全球和K12的单独培养24小时在孵化器37°C,从冻结的股票供应传播到哥伦比亚(马)血琼脂培养皿(CBA)。24小时后,部分含有细菌菌落琼脂削减从培养皿放在显微镜幻灯片。

样本定位直属50 x显微镜物镜和激光点集中顺序(中央)的单个菌落。收购用于每一个测量参数包括激光功率的目标~ 110 mW(静态)曝光时间的10年代完成同一个频段扫描(72年代)。光谱范围扩展到了600 - 1600厘米−1覆盖最相关的细菌拉曼特性使用系统的SynchroScan模式单一光谱积累;测量的总时间的一系列30个人殖民地通常是不到两个小时(这包括时间的单独的殖民地和交换样本)。

拉曼光谱是Savitzky-Golay耦合的先进的轧制过滤器——对待围巾背景消除常规(见,例如,7]),然后使用标准的多元主成分分析程序PyChem(8];此外,这里不包括判别分析步骤。

3所示。结果

评估拉曼光谱的再现性,我们哥伦比亚血琼脂平板接种美国epidermidis1457年,9142年或大肠杆菌全球、K12的和收集的数据从至少30使用英国殖民地inVia拉曼系统。典型的(生)光谱如图1(一)。最优化生成的这些光谱主成分分析的数据点,从中可以分析测量的重现性。这种类型的数据可以用来比较细菌物种和应变水平,允许我们调查的影响,连续的主要组件的能力区分细菌菌株。

(一)
(一)
(b)
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(c)
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(d)
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图1
分析不同殖民地的重复测量相同的细菌,培养24小时,比如有两个美国epidermidis(1457和9142)和一个大肠杆菌(Top10WT)菌株。典型的拉曼光谱从单个细菌菌落所示(一个);相关的3 d绘图原则组件关系30重复测量比较(b)两种细菌(c)两个细菌菌株和(d)细菌类型和品种。

为了调查再现性区分细菌物种,我们比较了前五个主成分(pc)产生的拉曼光谱从30的殖民地美国epidermidis1457年和大肠杆菌分别为全球(见图1 (b))。在图1PC1生物显示在一个3维图;显然,这三个组件似乎足以定义和包含所有的变化在两个集群。同样,PC-plot,来自30殖民地美国epidermidis1457年和9142年,分别表明也能区分细菌菌株(见图1 (c))。我们喜欢提到类似的定义区别是两者的比较大肠杆菌菌株Top10WT和K12虽然这些数据并不包含在简洁的图。

最后,在图1 (d)所有细菌和病毒如图1 (b)和1 (c)包括;独特的集群维护集群虽然相对取向是改变。这是一个典型的主成分分析的行为当额外的数据集添加到评估中。在这里显示的三个电脑足以提供清晰的区别在这个特定的例子中,额外的电脑可能需要实现集群独特的协会。尤其是这时需要额外关系密切的菌株物种都包含在整体比较。进一步明确细菌strains-requires额外的电脑可能需要导致集群独特的协会。

4所示。结论

我们的重复测量的结果表明,殖民地的细菌种类和/或菌株聚在一起,而;集群的确切性质正在调查。集群的最可能原因分散与测量的难度有关殖民地每次都在同一中心位置;除了有证据表明,在琼脂板上的微妙的表型差异的贡献。因此,传播聚类与变化相关的测量生物样本和携带多个测量的要求定义一个细菌数量在一个物种或压力。变化从集群的中心将帮助定义误判率,这是一个参数我们正在调查。这些发现符合Choo-Smith和同事的研究中观测到的异质性小集落分析(9]。

本研究也强调了精确定位的重要性贡献个人的主成分分析。理解关键细菌结构负责拉曼转换(第一次图书馆集合,例如,(10])定义在头几个重要主要components-looks至关重要评估使用这种技术的优点和局限性进行日常歧视的细菌。

个人的起源的确切理解光谱贡献仍处于起步阶段,但进一步比较其他样品的光谱样品正在进行中,希望这将帮助追求完整的应变歧视。

我们也开始在这项研究中描述的方法应用于其他问题在临床微生物学,如抗生素敏感性测试,分析一个个独立王国,单个细胞和细菌代谢的理解。

确认

作者感谢教授d·麦克归档的细菌样本。n Kapel支持纳米卫生中心的博士奖学金,斯旺西大学;j·f·m·Almarashi由Taibah大学,沙特阿拉伯。