文摘

钒的肌动蛋白相互作用的研究很少。摘要vanadyl的影响,钒酸,decavanadate肌动蛋白的结构和功能进行了比较。Decavanadate显然与肌动蛋白相互作用,如图所示核磁共振光谱。Decavanadate与肌动蛋白诱导蛋白半胱氨酸氧化和vanadyl形成,既避免了天然配体的蛋白质,ATP。单体的肌动蛋白(G-actin)与vanadyl滴定,根据EPR谱分析,表明1:1化学计量学和有约束力7.5μm . decavanadate和vanadyl抑制G-actin聚合成肌动蛋白细丝(f -肌动蛋白),和一个68年和300年的μM,分别分析了光散射分析。然而,只有vanadyl诱发G-actin内在荧光猝灭,这表明高亲和性actin-binding vanadyl网站的存在。Decavanadate增加(2.6倍)肌动蛋白表面疏水性,评估使用ANSA探头,而vanadyl减少(15%)。最后,两个钒物种增加atp汇率(和 decavanadate和vanadyl职责)。把它们放在一起,表明肌动蛋白,参与许多细胞过程,可能是一个潜在的目标不仅decavanadate vanadyl但最重要的是。

1。介绍

钒的影响在生物学,药理学,医学是众所周知的,主要是后发现“肌肉抑制剂因素”,出现在ATP从马获得肌肉和负责Na⁺K⁺腺苷三磷酸酶抑制,事实上,钒酸,充当phosphoenzyme水解的过渡态类似物,阻止酶催化(1]。最杰出的钒及钒化合物的影响可能是特定的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP),促进葡萄糖摄取的增加几种类型的细胞和模仿胰岛素作用[2]。此外,钒的使用作为一种工具来理解一些生化过程很容易被识别(3]。肌动蛋白是细胞中最丰富的蛋白质之一,参与许多细胞过程,比如肌肉收缩,肌肉细胞和细胞骨架的结构和动力学,nonmuscle细胞。很少涉及钒与肌动蛋白之间的相互作用的研究到目前为止所描述的(4- - - - - -6]。这些以前的研究表明,钒酸(钒(V)),在绑定F-actin-ADP子单元,增加actin-actin的力量相互作用,稳定f -肌动蛋白丝(5],vanadyl与单体的交互G-actin揭示了一个强有力的结合位点,其中[4]。最近,它已被证明,钒酸低聚物,如四聚物的和钒酸decameric (decavanadate, V₁₀),防止G-actin聚合,而没有影响钒酸观察到2毫米(7]。也证明了G-actin稳定decavanadate物种,增加其半衰期时间从5 - 27 h (7]。另一方面,细胞的研究表明,钒化合物诱导肌动蛋白细胞骨架的变化,负责形态学和细胞增殖变化8,9]。这些效应可能是通过抑制诱导蛋白质酪氨酸磷酸酶,正如上面提到的,或最终通过活性氧生成,一旦众所周知,过渡元素,如钒、促进Fenton-like反应。这些行为可以解释,至少在某种程度上,钒的抗肿瘤效应(10]。在本文中,我们比较vanadyl的影响,钒酸,和decavanadate肌动蛋白结构和功能,结合几种光谱和动力学研究。

2。Decavanadate、钒酸和Vanadyl与肌动蛋白的相互作用:核磁共振和电子顺磁共振研究

这是验证decavanadate⁵¹V-NMR信号扩大对肌动蛋白滴定,而没有观察到变化的钒酸寡聚物信号(11]。Decavanadate与肌动蛋白的相互作用是特别感兴趣的一旦发现只有V₁₀半胱氨酸氧化物种能够促进蛋白质(11,12]。ATP防止decavanadate减少和蛋白质半胱氨酸氧化(11,12),这表明交互堵塞,最终由于此种网站相同。事实上,在decavanadate与肌动蛋白相互作用,相应减少vanadyl (V (IV))被检测到,EPR谱(图的分析1)。典型的EPR钒(IV)信号能被探测到的decavanadate孵化与肌动蛋白(图1()),以及vanadyl孵化与蛋白质(图1())。ATP的存在中防止减少decavanadate vanadyl(图1()),以及与肌动蛋白vanadyl(图之间的交互1())。

最近在生物系统回顾decavanadate影响指出,decavanadate或多或少的效率比相应的简单oxovanadates针对特定蛋白质,特别是在nucleotide-binding网站(3,13]。然而,尽管decavanadate假定发生的细胞仍有待完全阐明,钒酸通常发生在细胞减少的形式,vanadyl,这种阳离子被绑定到几个蛋白质。我们最近所指出的那样,使用电子顺磁共振光谱学,vanadyl与G-actin离解常数()μM和1:1 vanadyl-actin化学计量学(11]。建议vanadyl结合肌动蛋白的磷酸腺苷网站,自存在核苷酸在中分析防止金属之间的相互作用和蛋白质(图1),也是观察decavanadate [11,12,14]。

3所示。Decavanadate、钒酸和Vanadyl与肌动蛋白的相互作用:荧光的研究

如上所述,与肌动蛋白decavanadate显示一个特定的交互。根据光散射光谱分析,发现decavanadate防止G-actin聚合的扩展f -肌动蛋白细丝,比vanadyl[更有效7,14]。在相同的实验条件下,观察到的IC₅₀聚合反应的抑制decavanadate较低,相比之下vanadyl(68年和300年μM,分别地。)而不影响被观察到2毫米钒酸(7,14]。进行了进一步的研究,利用荧光光谱,比较之间的交互decavanadate,钒酸,vanadyl肌动蛋白。是验证vanadyl诱发总淬火肌动蛋白内在荧光(图2),而decavanadate增加其荧光(12,14]。应该注意的是,decavanadate这些研究中使用浓度低于vanadyl 10倍。这意味着,500年μM decavanadate钒酸(总)对应于50岁μ钒酸decameric物种。关于蛋白质固有荧光,必须注意评估decavanadate或钒酸与蛋白质之间的相互作用,由于内心的过滤效果12]。然而,许多生化研究使用钒不采取考虑到这些影响,也降低了荧光测量精度。decavanadate解决方案与低浓度为0.05毫米(0.5毫米总钒),激发和发射波长的吸光度值用于化验(295和340海里,resp)达到1.72 OD (1。17 + 0。55)超过钒酸(1.02;0。85 + 0。17)或vanadyl (0.17;0。13 + 0。04),同样的钒浓度。修正的荧光强度由于这些内在的过滤效果是可取的和可以通过使用适当的方程(15]。

除了对固有荧光的影响,同时也观察到肌动蛋白表面疏水性,确定使用ANSA探针,增加在decavanadate暴露(2.6倍),而vanadyl促进减少了15%,表明前者造成的变化显然是不同于那些由vanadyl,有利于蛋白质疏水环境(12,14]。然而,decavanadate和vanadyl(最高可达200μ米总钒)增加atp汇率(和,分别地。,in comparison with the control:),两个物种减少ATP交换半衰期时间,表示一个更可用裂(12,14]。肌动蛋白构象变化引起vanadyl也验证了¹核磁共振(14]。

4所示。结束语

为了评估和比较肌动蛋白结构和功能的影响,主要和相关细胞蛋白,诱导了钒物种,即vanadyl,钒酸,和decavanadate EPR的组合,⁵¹V-NMR和荧光光谱研究动能的使用。综上所述,这些研究揭示的存在G-actin high-affinity-binding vanadyl网站,以1:1 actin-vanadium (IV)化学计量学。同时,特定的观察decavanadate与蛋白质的交互,导致半胱氨酸氧化和vanadyl形成。钒物种与肌动蛋白的交互都是通过ATP。把它们放在一起,提出了钒的生物效应,主要生物学作用仍有待澄清,可能解释,至少部分的能力与肌动蛋白相互作用和影响多个生物过程,肌动蛋白可能参与。本文得出的结论是(我)decavanadate vanadyl抑制肌动蛋白聚合,μM浓度;(2)只有decavanadate交互钒酸与肌动蛋白诱导半胱氨酸氧化,还原,避免这些影响ATP;(3)decavanadate vanadyl诱导肌动蛋白构象变化影响蛋白磷酸腺苷网站;(iv)肌动蛋白的存在为vanadyl high-affinity-binding网站。建议肌动蛋白,蛋白参与许多细胞过程,是一种似是而非的蛋白为vanadyl decavanadate以上所有目标。

缩写

ANSA:	8-anilino-1-naphthalene磺酸
G-actin:	单体的肌动蛋白
f -肌动蛋白:	丝状肌动蛋白的聚合作用。

确认

这项工作被CCMAR资金支持。美国拉莫斯要感谢葡萄牙基金会“Fundacao para Ciencia e Tecnologia (FCT)”的格兰特博士SFRH / BD / 29712/2006。