文摘

吸收的β阻断剂药物普萘洛尔的生活胶质C6细胞已经被观察到使用与双光子激发荧光寿命成像630海里。普萘洛尔的吸收和释放,几分钟内即可发生温度的依赖,在37°C约5倍比20°C。普萘洛尔的胞内荧光寿命是一般短于9.8 ns的价值确定稀释中性水溶液,和不同的是归因于浓度猝灭。在细胞内,普萘洛尔是积累在细胞内酸性囊泡和细胞质,但排除在细胞核。在孵化的细胞中含有100μ米普萘洛尔,药物累积达到细胞内浓度10毫米,这个过程被认为是由酸性细胞车厢内质子化作用。

1。介绍

普萘洛尔是一种非选择性β阻断剂药物防止绑定的肾上腺素和去甲肾上腺素β1,β2-andrenergic受体(1)以及抑制细胞摄取5 -羟色胺和多巴胺(2]。普萘洛尔是一种弱碱性亲脂性的化合物已知的和修改的行为互动双分子层脂质膜(3- - - - - -5]。研究表明,普萘洛尔被分成一系列的细胞包括上皮细胞(6和肝细胞7]。在后一种情况下,它最近报道说,有两种细胞内网站,高亲和力、低能力之一,另一个是低亲和力和不饱和的网站提出的细胞膜(7]。

众所周知,普萘洛尔展览固有荧光紫外地区solvent-dependent最大之间的320和360海里(8- - - - - -11]。这已被用于许多目的,包括量化的心得安药物化验,在微芯片电泳检测,监测绑定印迹聚合物。然而,一个光子荧光激发所需的波长的紫外线(260 - 320 nm)损害细胞系统,生产有潜在毒性中间体(12),不通过普通光学显微镜(13]。这些约束因此使困难的直接激励和成像普萘洛尔与紫外线激发荧光在细胞系统。相比之下,双光子显微镜使用红色和近红外波长和封闭区域的利益激发震源体积的飞秒激光束集中衍射极限,这进一步允许pseudoconfocal成像(14,15)降低整体的光毒性。多光子显微镜应用在医药科学16)有效地允许成像的紫外线固有荧光等生化生色团的5 -羟色胺(17,18]和dehydroergosterol [19]。

2。材料和方法

试剂
所有的化学品都来自Sigma-Aldrich,作为收到。河鼠神经胶质瘤,指定为C6神经胶质细胞,是购自LGC Promochem ccl(写明ATCC号码- 107)。他们成长为单层文化F-12 K中补充2.5% (v / v) FCS在37°C调湿5%有限公司₂。成像、细胞用0.25%胰蛋白酶和播种到菜1号盖玻片基地(MaTek公司)浓度的~细胞毫升⁻¹和发展了50个小时。
荧光寿命成像显微镜系统已被先前描述(18]。简单地说,它是基于Ti:蓝宝石激光(相干米拉)注入一个光学参量振荡器(猿)耦合到一个倒置显微镜(尼康TE2000U),水浸法紫外纠正目标(尼康VC x60、NA 1.2)。细胞工作,权力在样本有限的< 1 mW本地化photodamage降到最低。荧光检测通过结合饱和硫酸铜溶液和340海里(U340 Comar)干扰过滤器使用time-correlated单光子计数与滨松R3809U光电倍增管与PC模块SPC830(贝克尔和Hickl,德国)。

3所示。结果与讨论

在溶液pH值7.3,心得安和色氨酸有相似的吸收最大值约为280 - 290纳米,可比消光系数(见表1)。然而,激励在红边在310 - 320海里允许选择性刺激心得安荧光的蛋白质含有这种物质的存在在某种程度上类似于先前描述的观察血清素和5-hydroxytryptophan荧光(18,23]。普萘洛尔,长波长吸收峰在289 nm (ε= 5900⁻¹厘米⁻¹在315 nm)而消光系数是1730 dm³摩尔⁻¹厘米⁻¹。在中性水溶液,普萘洛尔的荧光光谱峰值在353 nm和重叠明显与色氨酸。荧光量子产率()普萘洛尔的pH值7.3测量励磁315海里相比之下的集成解决方案的荧光强度匹配使用时吸光度值5-hydroxytryptophan作为标准(0.27 [21])。

细胞的成像研究,2-photon励磁(2 pe)在630纳米左右是通过使用180 fs的激光脉冲持续时间的重复频率76 MHz。在这种情况下,普萘洛尔荧光强度表现出预期的二次激光功率的依赖。双光子截面(普萘洛尔为样本)(在590 nm和630 nm)所列出的方法获得的马塔伊et al。(2007)24使用参考荧光团())的已知值使用(3.1),代表了测量双光子荧光强度的实验中,的浓度,荧光量子产率和FI^λ荧光团的荧光强度在一个光子激发光谱波长λ用于双光子实验相对于综合光谱强度ΣFI: 使用这种方法测定截面在一个激发波长(这里590海里)有效地调整发射的敏感性/仪器的检测部分,并允许测定其他激发波长的截面。只有修正为显微镜物镜的传播在每个激发波长激发波长和激光功率是必需的。的双光子激发光谱色氨酸被雷姆曾为此写过报告和愈伤组织22),1.9通用单元(10⁻⁵⁰厘米⁴年代光子⁻¹在552 nm)计算3 -甲基吲哚。他们的数据表明0.21通用的色氨酸双光子激发在590海里,这是作为一个标准的值。结果列于表1显示的值0.40和0.17的通用单位普萘洛尔在590和630海里,分别。相应的截面为比较和5 -羟色胺显示大约两倍高于普萘洛尔虽然消光系数很低,前295和315海里。相比之下,第二次的决心普萘洛尔是由2 pe在628 nm使用9-chloroanthracene作为标准通用汽车在630纳米25]。再次使用的方法概述了马塔伊et al。24),的值普萘洛尔的0.22通用在628 nm得到优秀的协议0.17通用单元获得的价值以色氨酸为标准。

测量荧光寿命的普萘洛尔在各种条件下使用双光子激发630纳米显微镜系统,将一滴溶液盖玻片恒温控制的显微镜上安装阶段。在稀释的中性水溶液20°C,一个好的单指数寿命10.1 ns (χ²= 1.03)测量。磷酸缓冲溶液与导致轻微下降,寿命在0.1摩尔dm 9.8 ns³磷酸。如图1(一),一生则保持恒定范围pH值5到8.5但在碱性降低解决方案的方式与报道一致9.53 (26]。在中性水溶液37°C,荧光寿命也降低到9.4 ns。自灭的荧光寿命1毫米以上浓度测量和跟踪Stern-Volmer动力学动力学淬火,绘制根据(3.2)在图1 (b)给一个二阶速率常数,,()×10⁹米⁻¹年代⁻¹: 这是接近diffusion-controlled极限。较弱的动能淬火普萘洛尔的磷酸盐荧光寿命的pH值7也观察到()×10⁷米⁻¹年代¹。普萘洛尔的寿命测量稀溶液比色氨酸的长(长寿命的主要组件2.88 ns (21)使好歧视内在色氨酸荧光在生化系统如下演示。

细胞内的成像普萘洛尔
C6细胞能够保护神经细胞对超标的类,通过钠-和chloride-dependent单胺转运蛋白(27]。使用上面描述的心得安的荧光性质,证明可能图像细胞内积累的心得安与激发细胞利用双光子荧光寿命成像在630 nm和检测紫外线荧光(340海里)。吸收是由添加心得安(100μ米决赛浓度)上述培养基汇合的单层细胞上盖片形成一个恒温控制的室的一部分。C6细胞的典型形象获得孵化后与普萘洛尔在37°C如图1。强度图像(图1 (d))显示普萘洛尔主要分布在细胞内细胞质和细胞核排除在外。荧光寿命的图像(图1 (e))表示有生之年的范围从9.4 ns的解决方案价值37°C到淬火的值小于5 ns,平均大约6.5 ns(图的价值1 (c))。显微镜系统的校准与普萘洛尔已知浓度的解决方案允许估计细胞内浓度普萘洛尔纠正Stern-Volmer淬火后使用寿命数据。块校准解决方案的荧光强度与浓度自己需要修正,因为自灭的影响根据(3.2)。应用细胞类似的生命周期调整强度数据提供了一个集中的地图普萘洛尔浓度在细胞(图1 (f))。可以看出实质区域细胞的细胞质中含有大约5毫米普萘洛尔与峰值浓度达到10毫米。这些值是两个数量级高于普萘洛尔的浓度(100μ米)添加到外部介质。C6神经胶质细胞内积累的利率普萘洛尔进行评估通过测量显微镜领域内总荧光强度。图2(一个)表明,在37°C吸收迅速,发生的半衰期小于2分钟。尽管S-propranolol 100倍更有效比R-propranolol作为药物,无显著差异之间的吸收速度2观察对映异构体和外消旋混合物。在22°C,吸收的速度慢得多的半衰期约15分钟。普萘洛尔的损失从以前装载的细胞也可以测量更换外部介质包含普萘洛尔与磷酸盐。结果在图2 (b)显示< 2和8分钟半衰期分别为37岁和20°C。普萘洛尔是一种弱碱(9.53),积累酸性囊泡内通过质子化作用和捕获的酸性形式(28]。我们之前的成像实验(29日)大鼠主动脉平滑肌细胞显示colocalisation普萘洛尔与Lysotracker绿色DND-26 20°C,但更广泛的分布在细胞细胞质在37°C。进一步在C6神经胶质细胞成像实验(图中未显示)提供进一步的支持,表明最初的积累发生在溶酶体和线粒体。在更高的温度,把心得安到这些细胞器的膜,由于药物的亲油性,可能导致泄漏到更广泛的区域细胞的细胞质中。普萘洛尔的速度吸收直接观察到这些荧光寿命成像实验是按照以前的非成象测量使用放射化学分析(7]。荧光的方法,然而,不仅给吸收的细节,但也使细胞内的直接成像位置和积累的药物浓度。

确认

我们感谢STFC生物医学网络提供助学金,安娜和索尔福德大学的佩罗和凯瑟琳谢勒,STFC提供激光科学设施在卢瑟福阿普尔顿实验室。由于博士也由于p·雷诺兹太太和拉胡尔Yadav和细胞培养寻求帮助。