文摘

转体基因(竞技场队伍)是一个homotetrameric几种淀粉样疾病相关蛋白质。竞技场队伍的机制转化成细长的纤维组件进行了广泛的调查,和众多的研究表明,游离的原生四聚物的结构部分的单体的物种在淀粉样蛋白的形成。小差异观察到晶体结构不同的变体竞技场队伍,以及四聚物分离的热力学和动力学,似乎并不完全证明amyloidogenic潜在的不同变体竞技场队伍。记住这一点,我们已经研究了重折叠动力学WT-TTR及其最常见V30M-TTR amyloidogenic变种,监测内在色氨酸荧光的变化在不同的尿素和蛋白质浓度。我们的研究结果表明,在体外重折叠机制WT -与V30M-TTR相似,涉及二聚的中间。然而,有巨大差异重折叠速率常数的两种变体,特别接近生理条件。有趣的是,四聚物的形成发生在慢得多的速度比WT-TTR V30M-TTR amyloidogenic变体,它的在活的有机体内设置可以促进单体的物种的积累在细胞外环境中,导致更高的易感性聚合和淀粉样蛋白的形成,而不是自发的重折叠。

1。介绍

不溶性淀粉样原纤维中发现患者疾病,如系统性淀粉样变、海绵状脑病和阿尔茨海默氏症和其他很多(1]。病态如老年系统性淀粉样变(SSA),家族性淀粉样多神经病(FAP),与家族性淀粉样变心肌病(FAC)的特点是细胞外的原纤维的转体基因(竞技场队伍)2]。在某些形式的FAP这些存款主要是由蛋白质转体基因的变异,而在SSA纤维基本上由野生型竞技场队伍。FAP是一种常染色体显性致死疾病影响个人从二十几岁在许多国家,尤其是葡萄牙、日本、瑞典和美国。最常见的一种V30M-TTR FAP是相关的变体。

转体基因是一个homotetrameric血浆蛋白质传输甲状腺素和视黄醇,后来与视黄醇结合蛋白(2,3]。在竞技场队伍血清的浓度范围从170到420μg / mL和脑脊液变化5至20μ克/毫升(4]。小结构差异观察晶体结构的变异竞技场队伍似乎并不证明其不同amyloidogenic潜力(5,6),和一个重要的努力一直致力于寻找热力学和动力学因素,可能发挥重要作用在竞技场队伍稳定,为了充分理解竞技场队伍的淀粉样蛋白形成的分子机制。根据量热研究,amyloidogenic和non-amyloidogenic变体竞技场队伍非常稳定的热展开(7]。此外,尽管建议作为淀粉样蛋白形成的速率限制(8,9),四聚物解离动力学似乎并不完全解释观察到的光谱amyloidogenic潜在变异[竞技场队伍中2]。有趣的是,其他研究显示越amyloidogenic变异产生大量的竞技场队伍部分展开单体的物种由于边际构象稳定性的四聚物所带来的非单体分离,即使在溶液条件下接近生理(10,11]。因此,四聚物的组合分解动力学、单体构象稳定性和聚合动力学可以通过竞技场队伍发挥决定作用在形成淀粉样蛋白(2]。

在目前的工作中,我们调查的潜在作用形成淀粉样蛋白的重折叠动力学的竞技场队伍。生理相关浓度使用竞技场队伍,重折叠机制V30M——WT-TTR显示涉及的存在二聚的中间。重折叠动力学的数据还显示,在没有变性剂的情况下,重折叠过程展开从单体到相应的本地homotetramer比其更有利于WT-TTR V30M-TTR amyloidogenic变体。

2。实验程序

2.1。材料

重组WT -和V30M-TTR表达大肠杆菌(12和纯化如前所述13]。所有化学品都是商用纯度最高的,从σ化学公司购买。荧光光谱进行了瓦里安Eclipse荧光谱仪,不断搅拌,在25°C。

2.2。竞技场队伍变性

竞技场队伍浓度测定spectrophotometrically在280纳米14]。蛋白质样本孵化2 M硫氰酸胍盐(GdmSCN) 12小时,其次是透析对6 M尿素在10个小时。变性剂的解决方案准备在20毫米磷酸钠缓冲区,150毫米氯化钠,在pH值7.0。股票的解决方案GdmSCN和尿素的浓度检查的折射率。

2.3。重折叠实验

蛋白质重折叠实验进行了几家尿素和蛋白质浓度。WT V30M-TTR,变性如上所述,复合所需的尿素浓度和蛋白质,通过稀释到20毫米磷酸钠缓冲区,150毫米氯化钠,pH值7.0,25°C。重折叠反应被允许进行12小时,监测荧光发射在380海里,在激发290海里。对于WT-TTR,尿素浓度介于1.8和2.6米之间,而对于V30M-TTR重折叠实验0.4和1.2 M尿素之间进行。最终的化验被重复了几次,发现内可再生的实验错误。

3所示。结果与讨论

3.1。转体基因变性和重折叠

竞技场队伍展开在两步化学诱导报道在实验过程中,因为四聚物的竞技场队伍非常稳定,难以变性甚至在高尿素浓度(15]。的固有荧光光谱(图形插图图竞技场队伍1(一))显示一个红移的排放最大竞技场队伍展开后,由于更多的极地环境中色氨酸残基周围由于溶剂暴露在变性状态(10]。此外,荧光光谱的变性竞技场队伍2 M GdmSCN和透析后6 M尿素重叠,这表明尿素能够维持GdmSCN-induced变性的竞技场队伍。荧光光谱(图形插图图1(一))也表明,复合物种发射光谱非常类似于本机四聚物的竞技场队伍,与排放最大值约340海里,表明蛋白质重折叠实现尿素稀释。复合种WT -和V30M-TTR也以尺寸排阻色谱法和甲状腺素结合化验(数据未显示),证明两种变体竞技场队伍再折起故土四聚物的形式与一个非常高的收益。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
(a)的例子再次折叠动力学实验WT-TTR监控随时间变化的内在荧光发射在380 nm, pH值7.0,25°C。曲线(实线)是适合使用最简单的实验数据,拟合折叠模型。图形插图显示了光谱差异反映了构象变化的竞技场队伍展开和折叠。(b)示意图的竞技场队伍再次折叠机制。
3.2。转体基因重折叠机制

WT - V30M-TTR的重折叠动力学机制进行调查后,改变内在色氨酸荧光在380海里,并使用不同的尿素浓度和蛋白质。图1(一)显示了一个示例的荧光强度变化伴随重折叠竞技场队伍作为时间的函数。几个动力学模型进行了测试,最简单的折叠机制,更好地描述了折叠和组装的四聚体包括三个州和一个二聚的竞技场队伍折叠中间(图1 (b))。这个折叠中间的二聚的性质可能假设由于观察依赖速率常数( 1 和 2 蛋白质含量),这表明存在两个寡聚化步骤。因此,最简单的拟合机制的动力学数据是一个折叠和组装机制类型monomer-dimer-tetramer(联合化疗)和速率方程与此相关机制下面列出: ( 米 ] = − 2 1 ( 米 ] 2 , ( D ] = 1 ( 米 ] 2 − 2 2 ( D ] 2 , ( T ] = 2 ( D ] 2 。 ( 3 。 1 ) 怀斯曼和合作者进行重折叠与WT-TTR研究,由小分子绑定监控分析,利用蛋白质浓度的范围0.72 - 36μ米(单体),为了适应全球数据对于这样一个广泛的蛋白质浓度,作者提出了一个非典型monomer-dimer-trimer-tetramer (MDRT)装配机制[16]。然而,他们建议,蛋白质浓度较低,一个简单的机制就像传统的联合化疗一定会发生。我们的动力学数据,在较低浓度和竞技场队伍使用一个更直接的监控方法,符合最佳联合化疗机制,根据被假定为各种homotetrameric蛋白质(17]。

3.3。Amyloidogenic突变蛋白的重折叠率V30M-TTR

WT - V30M-TTR重折叠机制,在低蛋白质浓度(1μ米至0.1μ米),包括一个低聚物的中间,二聚的。通过联合化疗机制两种变体竞技场队伍再折起,高收益。然而对于V30M-TTR折叠和组装过程慢得多。表1显示了表观动力学常数 1 和 2 ,在低蛋白质浓度和外推到变性剂的缺失。比较个人的动力学常数与那些获得V30M-TTR WT-TTR揭示了一个值得注意的差异,与相对应的低速率常数amyloidogenic V30M-TTR。特别是,这些较低的速率常数 1 ,可能反映了构象的稳定性降低V30M-TTR单体相比WT-TTR [11]。

表1
明显重折叠动力学常数WT -和V30M-TTR蛋白质浓度的1μ米没有变性剂的情况下,通过外推的重折叠率在不同的尿素浓度,使用方程: l n = l n 0 + ( ] 。

4所示。结论

总之,我们表明,amyloidogenic变体V30M-TTR比WT-TTR重折叠长得多倍,这可能是至关重要的解释这种变体amyloidogenicity的增加。在活的有机体内,速率越慢重折叠和组装的原生V30M-TTR amyloidogenic变体可能发生的四聚物的形式促进这种变体的单体积累在细胞外环境中,这可能会导致更高的易聚合,因此淀粉样蛋白的形成,而不是重折叠本机四聚物。

确认

作者承认的支持“Fundacao para Ciencia e Tecnologia”,葡萄牙,通过授予PTDC / BIA-PRO / 72838/2006 (r·m·m·布里托)和博士奖学金SFRH / BD / 43896/2008 (c . s . h .耶稣)。作者还要感谢埃尔莎戴安娜批判性阅读报纸和假丝酵母g·席尔瓦建议集成的微分方程。