生物物理技术在抗菌肽研究中的应用GydF4y2Ba

抽象的GydF4y2Ba

越来越多的细菌对传统抗生素的耐药性导致了对替代疗法的需求。作为人类先天防御系统的一部分，抗菌肽具有广泛的抗细菌、病毒、原生动物和癌细胞的活性，是一种非常有前景的选择。抗菌肽的作用机制似乎与它们靶向细菌细胞膜的能力广泛相关。为了了解和提高它们的作用，阐明它们的作用机制，特别是了解肽-膜的结合是非常重要的。一些生物物理技术，如荧光光谱、圆二色、ζ电位测定和原子力显微镜可以用来实现这一目标。本文将讨论amp -膜相互作用的特点和这些生物物理技术的应用。GydF4y2Ba

1.抗微生物肽（AMPS）GydF4y2Ba

由于细菌抗性的增加，抗生素的有效性受到限制;因此，与传统治疗相比，新的抗微生物剂增加了增加了效果和减少副作用的主要相关性。具有广泛的动作光谱，并且对细菌抗性的发展较少的易感性，AMPS被认为是古典抗生素的激发替代品[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．它们作为先天免疫系统的一部分存在于几乎所有的生物体中，并具有对抗细菌、病毒、原生动物和癌细胞的活性[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．通过在宿主细胞上选择细菌细胞膜，AMPs诱导细菌细胞裂解和死亡，而对宿主细胞没有毒性。GydF4y2Ba

一般来说，AMPs是短的(少于50个氨基酸残基)，阳离子的，具有两亲性[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．然而，这些肽表现出较大的序列变异性，可以分为基于其二级结构的四个主要类别：GydF4y2Ba- 从中​​，GydF4y2Ba- 拼接，循环和扩展[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．安培有GydF4y2Ba- 雄性结构通常存在于溶液中的非结构化单体，但在与磷脂双层接触时获取螺旋形容物[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．与细菌细胞膜的相互作用对抗菌肽的活性至关重要。因此，了解AMPs与细菌膜的相互作用，识别膜特性/活性成分对提高效率和降低对宿主的毒性具有重要意义。GydF4y2Ba

2.amp与细胞膜的相互作用GydF4y2Ba

质膜负责细胞的区隔化，并作为一个选择性屏障来控制生命所必需的梯度。它主要由磷脂和蛋白质组成，但每一种生物都有其特有的膜组成[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．例如，真核生物膜主要由中性甘油磷脂构成(如含有磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺头基的磷脂)，而细菌膜则含有大量的阴离子脂类，如心磷脂和含有磷脂酰甘油的磷脂[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．此外，细菌比真核细胞具有更强的电负性跨膜电位，并在其表面具有带负电荷的成分(例如革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中的脂多糖和脂磷壁酸)[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

带净正电荷的AMPs在中性真核膜上对带负电荷的细菌膜表面具有选择性[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．尽管如此，AMPS可能具有不同的动作模式，可以大致分为两种主要组：AMPS，导致穿过膜的细菌膜或安培的破坏，并在不破坏膜的情况下侵蚀细胞内靶影[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

肽和膜之间的第一个相互作用似乎是由磷脂磷酸基和肽亲水性氨基酸之间的静电相互作用驱动的。在第一次相互作用后，肽可以插入细胞膜，或者扰乱质膜的完整性，或者以非破坏性的方式转移到细胞的细胞质中[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

破坏性安培的作用可以通过在膜中形成孔（“桶塔”和“环形孔”机制）或通过膜表面上的肽分子积聚（“地毯机制”）来解释[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．另一方面，非破坏性多肽能够穿过细胞膜并攻击细胞质目标，如核酸和/或细胞蛋白质，或可能对这些化合物的合成具有抑制作用[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．例如，已显示富含富含脯氨酸的昆虫肽的Pyrrhocoricin抑制抑制伴侣蛋白辅助蛋白折叠的热休克蛋白DNAK [GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．检测破坏性amp和非破坏性amp活力丧失所需的时间不同[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．破坏性肽在几分钟内导致细胞死亡，而不可行的肽以较慢的方式行动[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

3.膜模型GydF4y2Ba

如上所述，肽-膜相互作用对amp的作用机制非常重要。生物膜是由数百种脂质和蛋白质组成的复杂而异质结构[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]并且具有不同作品的结构域[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．因此，常用简单模型膜来区分不同细胞组分对amp作用模式的作用。脂质电荷、膜粘度和有无固醇是可以调节的特性[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．此外，用合成脂质或从某种细胞中提取的脂质很容易制备模型膜[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

最常用的膜模型是磷脂囊泡，根据其大小和组成它们的片层的数量进行分类[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．直径大于或等于100nm的单片小泡称为大单片小泡(LUVs)。由于其在分子尺度上的无约束曲率，luv具有较大的稳定性，具有与生物膜相同的脂质堆积，是首选的模型[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]．利用生物物理技术，这些囊泡可用于肽-膜相互作用的研究;特别是，通过荧光方法，多肽的固有荧光可以用来跟踪多肽与膜的相互作用。GydF4y2Ba

SUVS，小的Unilamellar囊泡也广泛使用，但它们的小​​尺寸（20-50nm），因此它们的高表面曲率可以导致扭曲的脂质包装，因此对异常的肽填料和亚稳定性[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]．尽管SUV由于光散射而易于引起伪像，但是上面提到的缺点以及与LUVs相关的散射伪像可以容易地校正，使LUVS成为优选模型[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]．值得一提的是，GUV，巨大的Unilamellar囊泡，直径大于1 μGydF4y2BaM，可以达到真核细胞的大小，因此对于显微镜研究非常有用[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

人(如红细胞)和细菌细胞也可以用来研究肽-膜相互作用，对验证简单模型膜获得的结果很重要。然而，生物物理技术在细胞上的应用是有限的;例如，肽的固有荧光不能与大的细胞背景荧光区分开来[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]．这一限制要求amp与外部荧光团如罗丹明和硝基苯并恶二唑进行衍生化;除了实验和货币需求的增加，多肽的衍生化可以改变它们的性质[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

理论模型也可以使用，一般来说是对实验数据的很好的补充。然而，虚拟膜贴片的小尺寸、肽分子的有限数量以及可采样的短时间尺度限制了这些研究的推断[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

4.amp -膜相互作用的相关生物物理研究GydF4y2Ba

存在可以使用的各种生物物理技术来研究肽 - 膜相互作用。在本节中，将简要描述一些这些技术。GydF4y2Ba

4．1.荧光光谱GydF4y2Ba

肽的内在荧光特别可用于研究AMPS膜相互作用，因为它以非侵入性方式提供结构和动态信息[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．可以采用几种荧光方法，下面将讨论其中一些方法。GydF4y2Ba

以下4.4.1。分区常数,GydF4y2Ba

如上所述，AMPs必须与质膜相互作用才能发挥其抗菌活性;因此，它们将隔板扩展到膜中是特别相关的。分区可通过确定分区常数(GydF4y2Ba）定义为脂质中的肽分子的比例（GydF4y2Ba）在水相中的肽（GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]：GydF4y2Ba 在哪里GydF4y2Ba是水溶液中存在的溶质（GydF4y2Ba）和脂质（GydF4y2Ba）阶段和GydF4y2Ba是水吗?GydF4y2Ba） 和 （GydF4y2Ba)脂质体积。当多肽分割成膜时，通常观察到荧光量子产量的增加和光谱向更有能量的波长的转移(如图中AMP LEAP-2所示)GydF4y2Ba1（a）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba1（b）GydF4y2Ba。因此，响应是由自由发出的信号的组合（GydF4y2Ba）和绑定（GydF4y2Ba)肽，方程(GydF4y2Ba4．2GydF4y2Ba)可以用来量化GydF4y2Ba（数字GydF4y2Ba1（a）GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]：GydF4y2Ba 不同脂质体系的肽分配常数可以比较，以评价肽的脂质偏好。AMPs对带负电荷的膜模型(细菌的模拟)有更大的亲和力。GydF4y2Ba

4.1.2。微分淬火GydF4y2Ba

肽的固有荧光猝灭可以用来研究它们在脂膜中的深度定位[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．该方法将简单的扩散淬火概念应用于双层的限制尺寸[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．双层被视为一种板坯，其中荧光团和猝灭剂以确定的深度分布存在。先前通过单分子褐色动力学模拟确定猝灭剂的统计分布，而荧光团的分布可以使用一般溴化或非烷基衍生的酰基链（在酰基链的不同位置处）估计荧光团的分布脂肪酸或磷脂[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．一个例子是对5和16-NS，其脂肪酸分别在位置5和16上用Doxyl组衍生。5-ns位于环境 - 环境膜界面中，而16-ns定位在疏水核中[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．猝灭剂和荧光团之间的相对猝灭程度取决于这些分子之间的接近程度，因此，荧光强度将提供关于膜中多肽普遍定位的信息[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．此外，水溶性猝灭剂(如丙烯酰胺)可用于确定荧光团是否易于进入水环境，从而补充这种分析。GydF4y2Ba

4.1.3。膜透化性GydF4y2Ba

如前所述，某些amp可以通过不同的机制引起质膜的破坏。特定肽诱导某一模型膜渗透/裂解的能力可以通过这些肽诱导的渗漏百分比来量化[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]．一种经常使用的方法是遵循羧基荧光素荧光强度[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]．该探针被植入luv内部，高度浓缩，自猝灭。然而，当amp诱导膜泄漏时，羧基荧光素被释放并被稀释，导致荧光强度与泄漏百分比成正比的增加[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．应用方程(GydF4y2Ba４．３GydF4y2Ba），可以计算肽在膜上诱导的漏百分比，其中研究了组合物：GydF4y2Ba 是否存在肽存在下的荧光强度，GydF4y2Ba在缺少肽和的情况下荧光强度如何GydF4y2Ba是否存在阳性对照中的荧光强度;通常使用Triton X-100 [GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

4.1.4。圆形二郎GydF4y2Ba

圆二色性是一种光谱技术，可用于估计肽的总体二级结构[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．肽键是远紫外区(240 - 180nm)吸收力最强的组分，每个二级结构元素都有一个特征光谱[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．多肽的二级结构在插入脂质囊泡时发生变化。这一变化可继之以圆二色性，为了解amp的作用机制提供了理论依据。数字GydF4y2Ba1（c）GydF4y2Ba比较粗糙的革兰氏阴性细菌的外膜模型的朴素蛋白4的二次结构[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．从随机线圈到GydF4y2Ba-螺旋结构与模型膜相互作用明显。GydF4y2Ba

其他的研究，如多肽的取向，可能使用光谱技术，诉诸于线性二色。它们的特殊性超出了本文的讨论范围。读者参考参考文献[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

4.2。原子力显微镜GydF4y2Ba

原子力显微镜（AFM）可用于获得微生物细胞表面和脂膜的三维图像。可以在生理条件下实时获得AFM图像，具有最小的样品制备[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]并且可用于检查模型膜[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba或细胞细胞[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]处理AMP(如图中AMP BP100所示GydF4y2Ba2(一个)GydF4y2Ba和GydF4y2Ba2 (b)GydF4y2Ba）.细菌细胞表面可以表现出形状和凹凸度的变化，而在模型膜中，孔洞的存在和相位的变化是可能的影响。此外，力的测量可以用来研究分子内和分子间的力[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba[用安培治疗后测量细菌细胞的机械性能[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．利用这种技术，可以直接比较模型和细胞膜对模型和细胞膜的影响。GydF4y2Ba

4.3。Zeta潜力GydF4y2Ba

细菌膜表面的负电荷可以通过阳离子amp滴定来中和，这一现象可以通过Zeta电位(GydF4y2Ba-潜在的） [GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．在溶液中，聚电解质粒子表面有一层离子，随粒子移动。在这一层之上是不随分子运动的离子，在这一边界上存在的电势被称为GydF4y2Ba-潜在的 [GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．以前已经观察到GydF4y2Ba-阴离子脂囊泡和细菌细胞的负电位随着肽/脂质比的增加而降低。这种效应反映了肽与膜之间的相互作用，如图所示GydF4y2Ba2 (c)GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba用AMP BP100滴定细胞[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．用脂质囊泡和细菌细胞进行这些研究的可能性是一个很大的优势，因为它能够在两个系统之间直接比较。的GydF4y2Ba- 使用亨利的关系来测量 -GydF4y2Ba 在哪里GydF4y2Ba是亨利的职责GydF4y2Ba是GydF4y2Ba可能性,GydF4y2Ba是电泳移动性，GydF4y2Ba介电常数是多少GydF4y2Ba为溶液的粘度。GydF4y2Ba用激光多普勒测速法计算粒子速度，该方法中粒子速度与由散射光强度变化所测得的频率有关。对于水溶液中的粒子，亨利函数的值为1.5，遵循Smoluchowski近似。当粒子悬浮在非水溶液中时，根据Huckel近似，函数值为1 [GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

amp具有大范围的活性、高效率和低毒性，是传统疗法的潜在替代品。它们的作用模式依赖于肽-膜相互作用;因此，对于这些肽的广泛应用，提高它们的活性并降低最终毒性，了解它们的作用方式是很重要的。生物物理技术是理解肽-膜相互作用的有用工具。利用脂质囊泡和荧光光谱方法，有可能获得关于肽-膜亲和性、肽深度定位和与模型膜相互作用的膜稳定性的信息。利用圆二色光谱可以识别多肽的二级结构基序，并可以评估与模型膜接触后二级结构的变化。另一方面，GydF4y2Ba-电位和AFM可用于模型膜或生物细胞。GydF4y2Ba- 可以在浅表电荷中和和AFM上提供细节，可以直接观察到模型膜和生物细胞上的AMPS动作。总共可以得出结论，生物物理技术是研究安培和其他膜活性肽的作用机制的有价值的工具，因为可以获得对肽 - 膜相互作用的见解。GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

S. Henriques是第七届欧洲社区框架计划（PIOF-GA-2008-220318）的玛丽居里国际传出。我们对抗菌肽实验室的工作得到了葡萄牙（PTDC / SAU-BEB / 099142/2008）的基本基金会的助剂的助剂支持。GydF4y2Ba

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