文摘
荧光缩微成像和零差phase-resolved共焦microspectrofluorimetry被用来监控反义寡核苷酸的运输到癌症MCF7细胞和随后的细胞内的分布。Phosphorothioate模拟的15 - m抗议oligoadenylate(哒15)标记阿425年包裹着5、10、15日20-tetrakis (1-methyl-4-pyridyl)卟啉(H2TMPyP4)作为uptake-mediating代理。荧光寿命数据广泛的光谱范围内揭示了细胞内这两个组件的属性。H2TMPyP4一生细胞内不影响在这种恶性细胞系,而修改后的寡核苷酸的一生被发现略有缩短。
1。介绍
目标交付的药物及其控释代表当前生物医学研究中最具挑战性的问题。最严重的障碍使带负电荷的使用人工合成的反义寡核苷酸,antigene,适配子策略(1,2]在于必要性运输通过细胞膜电位梯度。因此建议各种渗透增强剂,意识到,送货人员和研究,包括水溶性阳离子卟啉与阴离子形成可逆离子复合物寡核苷酸(3- - - - - -5]。由于有效电荷补偿没有共价连接到运输代理,解决复杂寡核苷酸可以穿透更容易进入细胞,和他们不是剥夺形成更强和更具体的自然目标内细胞复合物。对交付过程的有效性进行评估,跟踪后续行为的复杂及其成分在活细胞内,microspectroscopic技术充分sensitive-to-low浓度是必要的。使用fluorescence-labeled寡核苷酸和与生俱来的荧光卟啉作为交付代理,可以获得有用的信息的组合两个互补的microfluorescence技术,荧光缩微成像和频域microspectrofluorimetry [6]。
在目前的研究中,该方法测试使用阿425 -标记phosphorothioate oligoadenylate作为一个寡核苷酸运输和荧光H2作为一个投递代理TMPyP4卟啉。一生都在活细胞荧光团的荧光显微分光计研究了两级增益调制图像增强器专门为此类研究。荧光影像被用来监控运输通过细胞膜的复杂和可视化后续分配各自的组件在细胞内的隔间。
2。实验
详细描述实验设置中可以找到的6]。在这里,我们总结的主要技术事实设置。Optiphot-2显微镜数字化装备一个Nipkow轮coaxial-confocal附件(技术工具、德国)TE-cooled CCD相机(美国普林斯顿大学仪器MicroMAX)是用于获得荧光显微图像。microspectrofluorometer一直建立在相位调制原理采用零差方法。所有发射波长的荧光寿命可以确定通过收购一些光谱图像(6)定期在不同励磁和检测器增益调制相移。为了解决多个组件的荧光寿命,光谱采集了从10到180 MHz的频率间隔。激光二极管模块(οLDM 442.50.A350) 50兆瓦输出(减1到10μW在样本级别)用于442纳米波长的激发。这激发波长匹配阿425激发最大和卟啉俗乐队很好。
共焦直立数字化显微镜(蔡司umsp - 80)使用具有高数值孔径水浸63 x客观(1.2蔡司Neofluar, NA)。从针孔收集的荧光信号集中在入射狭缝的Jobin-Yvon HR640光栅摄谱仪配备了100线/毫米。宽光谱检测窗口(375海里)覆盖激发波长(参考)和荧光发射。检测部分由一个增益调制图像增强器光加上CCD探测器(像素)。USB通信接口用于连接CCD控制器来控制电脑,这也直接驱动两个高频数字合成器(调制频率、相位和幅值的输出信号)通过串行接口。
兰伯特LIFLIM软件(工具)用于设置控制和数据采集。内部软件(PHR)已经被写入计算相移和荧光信号的解调谱依赖从获得的数据正确。它还将数据转换成全局拟合程序,执行后续寿命计算和频谱分解。
3所示。样品制备
合成phosphorothioate寡核苷酸(15-mers腺苷酸)阿425标记的3′端(ATTO-dA15)被Biomers合成,德国。5、10、15日20-tetrakis (1-methyl-4-pyridyl)卟啉(H2从Sigma-Aldrich TMPyP4)购买,有限公司
MCF-7癌细胞(人类乳房腺癌细胞株)用于这项研究被视为正常;培养在25厘米2烧瓶在37°C湿润有限公司5%2的气氛。生长介质与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM Sigma-Aldrich)补充小腿胎儿血清,10% 2毫米谷酰胺,链霉素(0.1毫克/毫升),青霉素(100 U /毫升),使用丙酮酸钠。亚文化在细胞培养皿实验和孵化前48小时在一夜之间解决寡核苷酸/卟啉复杂的H(混合股票的解决方案2寡核苷酸ATTO-dA TMPyP4和修改15最终浓度M和米,职责)。
4所示。实验结果
在这项研究中,我们专注于修改后的寡核苷酸的内化到癌症细胞系MCF-7通过阳离子H2TMPyP4。标记的细胞吸收phosphorothioate ATTO-dA15是由H2TMPyP4,它已经有效地用于我们的先前的研究[7,8]。两种荧光团的荧光影像的典型分布在MCF-7细胞被认为在图1。类似于细胞摄取3 t3细胞线(7),H2TMPyP4 / ATTO-dA15复杂的积累在MCF-7的细胞核,寡核苷酸更优先集中到核仁。只有一小部分的寡核苷酸和卟啉仍然在细胞质中,明显从结合图片显示详细卟啉和寡核苷酸荧光发射的单个细胞(图2、中)。
(一)
(b)
(c)
时间分辨microfluorescence光谱分开收集细胞的细胞核和细胞质中。荧光团都是兴奋通过波长442纳米的激光线接近吸收最大值。结果双组分发射光谱实验来自细胞的细胞核如图2。弹性散射的峰值作为零一生参考。重要的优势进一步的光谱分析,这两种ATTO-dA15和H2TMPyP4光谱贡献明显分离。全球安装程序提供了只有两个,一个为每一个荧光团。的ATTO-dA15荧光在细胞核中可以表现为一个一生3.5 ns,而解决方案是4 ns的一生。因此,阿一生似乎略缩短MCF-7细胞环境。同样应该强调,阿一生获得了两个寡核苷酸的细胞核和细胞质中。H的荧光2TMPyP4一生只拥有一个组件附近6 ns。单一的生命周期相同的值被发现的卟啉在细胞核,细胞质和解决方案。尽管H2TMPyP4一生惊人的展品没有改变其细胞内定位,H2TMPyP4无疑与修改后的寡核苷酸形式复杂,促进运输到细胞内,可能改变其绑定状态在细胞核和核仁。
5。结论
结合两种荧光技术代表有效的可靠的监控工具的渗透和分布在活细胞标记寡核苷酸。荧光影像可以及时确认成功的渗透和手表发色团的分布在细胞环境。累积的零差时间分辨microspectrofluorometer拥有广泛的光谱窗口,这是有利可图的multifluorophore分子系统的监控。H2寡核苷酸ATTO-dA TMPyP4 /修改15发现复杂的成功渗透到人类上皮腺癌乳腺癌MCF7优惠积累在细胞细胞核。H2TMPyP4发射寿命并不影响在这种恶性细胞系,而寡核苷酸发射一生被发现略有缩短。
承认
金融支持从捷克共和国(项目的资助机构。P208/10/0941)。