文摘
我们研究了分布下的磷锰毒性不同组织的10μm thin-root截面的道格拉斯冷杉(DF) (Pseudotsuga menziesii)幼苗通过synchrotron-based傅里叶变换红外显微镜(SR-FTIR)作为化学敏感成像方法。锰在所有生物必不可少的微量元素,但在过量时可能会有毒。我们发现以前DF品种glauca(DFG)和品种menziesii(DFM)不同磷吸收、亚细胞定位、交通和组织分配,作为锰中毒的效果。解决P在幼苗宽容Mn毒性的作用,我们确定P分配在不同的根组织。脱硫,但不是在回转体,P的浓度保持在一个恒定水平即使在锰毒性。早期的x射线微量分析显示,Mn积累在表皮和皮层细胞的两个品种Mn治疗后,这表明根内皮屏障了Mn保护血管系统和拍摄从高锰、P经验的可能角色。在这里,我们讨论P Mn划分的潜在作用和毒性公差在两个不同的品种。
1。介绍
锰(Mn)是一种重要的营养元素所必需的多种酶的激活。只需要履行其代谢功能,Mn在浓度较低的情况下。植物Mn的可用性取决于土壤性质,主要是pH值,对根系分泌物Mn螯合或减少。一般来说,过量的锰引起正常植物代谢的紊乱。因此,Mn-homeostasis在细胞层面上是严格管制1]。两个主要品种的道格拉斯冷杉(Pseudotsuga menziesiivar。menziesii(DFM)和p . menziesiivar。glauca(DFG) Mn敏感性不同,也就是说,DFG但不是DFM显示锰中毒的症状,当暴露于过量的锰(2,3]。
我们之前的结果显示不同的运输和易位Mn的性质在不同亚细胞车厢两个品种的道格拉斯冷杉(1,3]。Mn-resistant品种DFM显示Mn保留在电子致密的根系和截留Mn沉淀(“黑色尸体”),含锰浓度极高,加上Ca和P [2]。相比之下DFM, Mn-susceptible各种运输更高分数地上光合活性组织(3]。除了这些差异、脱硫和DFM在P积累在植物组织内也有所不同。磷限制DFM,但不是脱硫、种苗Mn-susceptible较低(2]。这表明P中扮演一个重要的角色在调停Mn宽容。然而,磷的组织分布在应对Mn压力是不知道。解决P定位在根组织中Mn压力的条件下,我们完成了synchrotron-based红外光谱分析thin-root横截面。
Synchrotron-based红外光谱spectromicroscopy成像是一个有用的工具的有机化合物在不同的细胞,没有任何染色/标签或切削工件,如图所示(前4- - - - - -6]。的对比成像技术是基于振动状态的局部密度特征为功能性分子组(7]。同步辐射红外无疑是最有用的来源,因为它是一个“白色”来源与一个平坦的宽带分布在整个红外光谱范围(从远红外到近红外线)8]。高亮度比传统实验室来源(8,9)打开了机会把最高的光谱分辨率和空间分辨率的衍射极限(7,8]。
2。材料和方法
2.1。样品制备
植物生长水产标准中,包含两个不同的锰浓度锰2 +形式(如[2])。简而言之,2-weeks-old幼苗受到另外两个星期5μM Mn(控制)或5毫米Mn (Mn2所以4)。2周后,植物取样分析。根技巧,从完整的幼苗,在组织快速冷冻冷冻介质(德国徕卡020108926,荣格)加载5 mm长的明胶胶囊和液氮冷却−196°C。冻块5毫米在根尖直接削减与cryomicrotome (Reichert-Jung,型号2800 Frigocut N)。10μm截面被安装在MirrIR低辐射反射红外研究显微镜载玻片没有干扰的吸收范围从4000到400厘米−1(美国Kevley技术),冻干−70°C两天,和调整房间温度通过增加温度缓慢20°C在接下来的两天。标本被存储在一个在室温下硅胶干燥剂。
2.2。Synchrotron-Based红外光谱分析
的红外光谱的测量进行了红外光谱的ID21 spectromicroscopy站欧洲同步辐射设备(ESRF)同步加速器设施。IR spectromicroscopic地图收集在反射模式下使用一个红外显微镜(那些时光Nexus热Nicolet)耦合到一个红外光谱谱仪(那些时光连续热Nicolet)。红外显微镜配备电动样品阶段和液氮冷却碲化镉汞(MCT)检测器。大部分的收集分析和地图的像素大小5×5μ米2和步长为2μm,每个谱与64年收购积累在4厘米−1光谱分辨率。
3所示。结果
地区的300μm×300μm是映射在脱硫和DFM根组织完整的高分辨率,和光谱记录每个像素的SR-FTIR分光显微镜。数据收集在一个冻干样品在反射模式下,在上面描述的设置。2 d图像可以生成所有相关的红外光谱吸收线代表感兴趣的区域的光谱特征,如指纹峰的分子组色标。
磷酸和/或膦氧化物(Pi)组织光谱显示强大的乐队在1100厘米左右−1。两个乐队可能与不对称和对称的阿宝−2拉伸乐队在1236和1086厘米−1分别与CH第一2剪刀振动或CH3不对称弯曲振动(10]。另一方面,红外光谱波段约1100 - 1000厘米−1在某些植物的贡献也被酒精和多糖化合物存在于组织(11]。
数据1(一),1(一),1(D)和1(d)的2 d和3 d图像显示控制和Mn-exposed DFM根横断面图,生成的磷酸和膦氧化物组织(一个强大的乐队在1100厘米−1分别与P-O相关债券的磷酸盐)。扫描感兴趣的区域(ROI)选择包括中心柱,内皮,皮层和表皮获得spectromicroscopic地图、基于内联(同轴)可见光光学显微镜数字1(B)和1(b)。
累积10的红外光谱的吸收光谱μm根尖的截面控制和Mn-treated DFM工厂数据所示1(C)和1分别(c)。皮质Mn-treated植物显示P积累,内胚层的,和中心柱细胞,除了在控制植物的表皮。
乐队在1270厘米−1已经分配给愈创木基木质素(12)也占主导地位的光谱Mn -和un-treated植物。木质素乐队在1265厘米−1和1311厘米−1很明显因为木头木质素含量在20%左右(13]。向更高的波数,中的下一个明显的特征吸收光谱是我和二酰胺的酰胺乐队,表现出在1656年达到顶峰,1550厘米−1分别对应于振动的蛋白质骨架(8]。集成的峰值强度的酰胺乐队可以作为衡量当地蛋白质浓度。蛋白质是叠加的山峰象征纤维素纤维素因为有非常接近峰值为1635厘米−1(5]。
图2显示了π组2 D和3 D图像生成的红外光谱吸收线,控制和Mn-treated DFG植物(A, A, D, D,职责)。(即扫描区域的利益。,central cylinder, endodermis, cortex, and epidermis as for DFM analysis (Figure1)是基于内联可见光光学显微镜(数字2(B)和2(b))。累积10的红外光谱的吸收光谱μm根尖的横截面的控制和治疗植物DFG植物展示非常相似的P分布在整个根组织,也就是说,Mn压力并不影响P划分(数字2(C)和2(c))。
4所示。讨论
Synchrotron-based红外光谱显微术研究薄截面DF的根组织提出了研究。重点是利用红外光谱spectromicroscopy磷映射。到目前为止,只有少数的原位研究元素分布在DF样本已执行,主要由电子microscopy-based x射线显微分析(EDX) [2,14]。而电子显微镜需要侵入性样品制备,通常包括固定在薄切片样本之前,红外光谱可以提供光谱没有改变的细胞组织化学固定的风险。
红外光谱spectromicroscopy显然透露π山峰DFM(图的根源1)和脱硫(图2)。这个分布关联与Mn划分后synchrotron-based x射线荧光分析(数据未显示)。红外光谱分析显示Pi-compounds地图在整个截面的根,提供了更好的概述(数据总P的位置1和2)。Mn压力后,磷再分配向中心柱DFM(图中被发现1),但不会在被各种脱硫(图2)。DFG幼苗保持均匀分布P在所有根组织,控制以及Mn-treated植物。Mn压力P的再分配后,只有在根的DFM,可能已经提高了Mn宽容这个品种因为P搬迁的组织可能结合盈余Mn,以这种方式保护血管系统和拍摄从锰毒性。
特别是红外光谱spectromicroscopy推断蛋白质二级结构信息中所有蛋白质通过本地平均激发体积。蛋白质的空间分布在1635厘米−1,截然不同于脂质,是叠加在纤维素峰(数字1(C),1(c),2(C)2(c))。观察到的酰胺乐队峰值的位置主要是由于β褶板构象,以及他们不同的DFM和脱硫反应Mn治疗。差异也观察到以下波数:1245厘米−1,他们来自C-O-H不对称变形振动的半纤维素和纤维素5),然后在1420厘米−1,这是与碳氢键弯曲不对称CH3群纤维素,脂肪和多糖,以及在1740厘米−1从C = O拉伸烷基的酯化果胶和脂质。对称和不对称的CH2拉伸的脂质乐队在2850年和在2925厘米−1分别为(5)还在vlsi和脱硫Mn治疗后变化,底层的复杂变化的生物分子细胞水平在这两个品种在Mn压力。
确认
作者感谢玛格丽特爱博士介绍红外光谱显微术和批判性阅读论文的,安德里亚Olbrich博士建议在样品制备和克里斯汀Kettner植物。欧洲同步辐射设备(ESRF)在格勒诺布尔被公认为梁时间分配和良好的工作条件。