对皮肤源性间充质干细胞生物化学变化的评价体外通过FT-IR分析的神经细胞化

抽象的

最近，FT-IR分析已经用于研究胚胎干细胞分化期间分子签名的变化。我们有兴趣了解FT-IR光谱是否可以应用于分析人体皮肤间充质干细胞（S-MSC）生物化学型材的变化体外神经细胞化。在六周内，用EGF和FGF-2在无血清培养基中繁殖S-MSC。神经祖细胞系Rencell Cx（Millipore）用作参考细胞系。每周收集样品，并分析神经标志物巢蛋白，小管蛋白βIII，GFAP和CD271表达。使用微孔板读取器HTS-XT（Bruker，Germany）进行FT-IR分析。尽管存在免疫型相似性，FT-IR光谱揭示了S-MSC培养和Rencell CX细胞的明显曲线。FT-IR光谱分析显示在rencell cx和s-mscs中的神经细胞膜和不同碳水化合物组合物中的蛋白质和脂质浓度的变化。在神经细胞期间在不同时间点的S-MSC培养物之间可以区分S-MSC培养物。本研究结果表明，FT-IR光谱比常规免疫型分析更敏感，并且对茎细胞分化状态的监测具有很大的潜力。

1.介绍

许多临床和临床前研究已经证明了成年干细胞治疗各种条件，例如心血管疾病，自身免疫障碍和神经变性疾病的能力[1]。然而，由于风险引入未知表型细胞的风险，安全是干细胞治疗申请的主要问题[2]。常规的细胞表征涉及基于细胞表面和细胞内标记表达的细胞表型分析，并且这种方法的缺点是对细胞生化型材的宽视缺乏宽视。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱提供对细胞群的大分子组成的无快速和无标记分析，这可能有助于监测细胞分化状态[3.-6.]。这里，我们使用S-MSC神经细胞作为FT-IR光谱分析模型，以验证方法区分分化和未分化的干细胞的能力。

本研究的目的是使用FT-IR光谱检查人体S-MSCs的生化变化体外神经细胞化过程。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

根据拉脱维亚中央道德委员会授权批准，从后勤材料获得人体皮肤样品。患者签署了知情同意。

如前所述获得S-MSC培养物[7.那8.]。细胞在细胞生长培养基DMEM-F12（3：1）中繁殖含有青霉素和链霉素（100u / ml和100 μ.G / ml），补充有10％的胎牛血清。rencell cx细胞（millipore）在镶嵌蛋白预热的组织培养瓶中生长（20 μ.在DMEM-F12（3：1）中补充有B27（2％），FGF（20ng / ml）和EGF（20ng / ml）的DMEM-F12（3：1）。

2.2。神经细胞化

S-MSCS 3×10^5.转移到T75烧瓶（SARSTEDT）中并允许在血清补充培养基中粘附24小时。然后，将细胞培养基变为含有FGF-2（20ng / ml），EGF（20ng / ml）和B27（2％）的无血清神经细胞介质培养基DMEM-F12（3：1）。在六周时间（W0，W1，W2，W3，W6）期间每周收获细胞，用于随后的形态，免疫蛋白酶和FT-IR分析。

2.3。免疫蛋白型

对于免疫荧光分析，细胞在神经细胞介质中的4孔室载玻片（Nunc）中生长。每周之后，用PBS冲洗样品并用冰冷丙酮固定/渗透2分钟，在-20℃下进行2分钟。固定载玻片在空气中干燥并在PBS中用5％BSA封闭45分钟。随后将细胞用抗巢蛋白（Clone196908），小蛋白的一抗孵育过夜βIII（克隆TUJ 1），GFAP（克隆273807;来自研发系统）。接下来，用PBS冲洗细胞，并在黑暗中与二次抗小鼠IG-Alexa Fluor 488抗体孵育1小时。标本用DAPI染色，安装有氟轿车（DAKO），并在显微镜下分析（Leica DMI4000 B）。使用图像Pro Express软件执行图像叠加层。用PE缀合的CD271抗体（克隆C40-1457）染色细胞，并使用CellQuest软件（BDBiosciences）在Facscalibur流式细胞仪上进行分析。

2.4。FT-IR分析

样品中的细胞量，1×10^6.根据吸收光谱强度0.35-1.25确定细胞，以实现兰伯特 - 和啤酒律赋予乐队强度与浓度成比例。3-10 μ.将L样品滴在硅板上并在室温下干燥。使用微孔板读卡器HTS-XT（Bruker，Germany）进行FT-IR分析，范围为4000-600厘米^-1在使用OPUS 6.5处理的吸收模式和数据中。通过载体归一化，第2衍生物，分层聚类分析（HCA）和定量分析评估光谱[9.]。

3。结果与讨论

在六周的时间内，在神经细胞介质中繁殖S-MSC，并通过免疫胞间型方法和FT-IR光谱分析。

S-MSC培养物和rencell Cx细胞表达神经祖叶巢巢蛋白，胶质标记GFAP和神经元标志物管蛋白βIII通过免疫荧光分析（图1）。通过流式细胞术分析分析，rencell cx对于神经营养蛋白受体CD271是阳性的rencell cx（图1）。

S-MSCS的FT-IR光谱体外在各种分化阶段，评估参考细胞系Rencell CX。尽管神经和胶石谱系标记的类似表达，但S-MSC和Rencell CX显示了不同的FT-IR光谱曲线（图2）。

FT-IR光谱显示在IID I的变化（1651厘米^-1，C = o拉伸振动和C-n组）与骨干构象直接相关，并且通常被认为是特征α.- 雄辩结构），II II（1154厘米^-1，N面N-H弯曲振动，拉伸C-N和C-C的振动，该带子是一致性敏感的），脂肪带（1740厘米^-1，脂肪酯）强度，在1591厘米处的IID I和amid II带中的最小深度^-1和碳水化合物组成（1186-980cm^-1）。

定量分析表明，在神经细胞期间，蛋白质的含量从W0样品中的68％的干重（DW）降低至第6周的62％DW。在I和AID II带中的最小值增加，这可能表明整个蛋白质含量的变化和α.- ，β- S-MSC中的规范状态。脂质的含量随着3至9％DW的细胞生长时间而增加。在第6周S-MSC的光谱中，1054厘米的小频段^-1分配给糖原在rencell cx光谱中未检测到很好。

所有样品的第二衍生光谱还表明了rencell Cx线和S-MSC样品在所有区域之间的差异。在1050-950厘米的地区^-1，Rencell CX光谱与任何S-MSC样本光谱显着不同。在第二衍生物IR光谱的蛋白质和脂质区域中观察到显着差异。进行所有样品光谱的HCA，树木图清楚地显示了研究下的不同样品簇（图2）。总共，FT-IR光谱的数据分析表明，在神经细胞期间可以区分S-MSC样品。

4。结论

我们的结果清楚地证明了FT-IR光谱可用于监测S-MSC分化状态，并且比传统的免疫表型分析更敏感。IR光谱检测在神经细胞期间不同大分子分数 - 脂质，蛋白质和碳水化合物中的定性和定量变化。HCA显示，从第2周开始，S-MSC光谱簇与参考细胞系Rencell CX，可能表明朝向神经表型分歧。因此，FT-IR光谱似乎对未来的干细胞分化评估非常敏感和希望。

承认

作者谨此感谢ESF资金2009/0224 / 1DP / 1.1.1.2.0 / 09 / APIA / VIEA / 055进行财务支持。

参考

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2. N.Amariglio，A.Hirshberg，B.W.Scheithauer等，“在Ataxia Telangiectasia患者中的神经干细胞移植后的供体衍生的脑肿瘤，”Plos医学，卷。6，不。2，pp。0221-0231,2009。查看在：出版商网站|谷歌学术
3. F. C.帕西库，H.T Goh，N.Welch，L. D. Buttery，C. Denning，以及I.POTINGER，“活性心肌细胞中的分子标记的非侵袭检测和成像”，源自人胚胎干细胞，“生物物理学杂志，卷。100，不。1，pp。251-259,2011。查看在：出版商网站|谷歌学术
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