文摘

这项工作的目的是评估的能力拉曼光谱识别分子组织和化学成分的细胞外基质胶原纤维等安排,矿化的程度,在矿物和碳酸盐积累阶段的松质骨股骨的人头。松质骨的组成和结构的变化组织所使用的地图偏振拉曼光谱。特别是,本研究的目的是确定安排的矿化胶原蛋白骨小梁表面通过使用转换的拉曼光谱图。转换所需的拉曼光谱图是为了消除化学成分影响拉曼光谱的图像地图,显示胶原纤维的取向。这些转换允许同时获得骨成分的分布和排列的胶原纤维组织表面。方法表明胶原蛋白开发方向了解分子组织在健康和不健康的骨骼在显微结构的水平。

1。介绍

骨组织是一种多相材料组成的细胞如成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、细胞外基质,主要由胶原纤维、矿物相(羟磷灰石和碳酸磷灰石晶体),和水(1- - - - - -3]。有机基体主要是由I型胶原纤维(4]。胶原纤维的弹性和抗骨折比磷灰石晶体。因此,骨骼结构强度是由矿物成分(5),而弹性的组织是由有机成分(6]。通过结合胶原蛋白的高韧性和高刚度的矿物,骨达到其卓越的机械性能(7]。骨在人类和其他哺乳动物的身体一般分为两种不同的形式:皮质骨和松质骨。皮质骨,也称为密质骨,找到主要的轴长骨头和松质骨周围的外壳。松质骨,也被称为松质骨小梁,发现最后的长骨头,在椎骨和扁平骨(8,9]。皮质骨的密度和多孔比松质骨。两种骨类型层次结构。皮质骨骨单位的基本的一级结构(骨性薄片安排在哈弗斯运河同心模式),而松质骨是由一个网络不同形状和厚度的骨小梁排列方向的机械压力(10,11]。骨小梁排列的模式允许分发和关节接触载荷的能量消散。

骨量和骨矿物质密度是最常见的临床参数评估骨质量。然而,矿物和有机成分的内容,松质骨的微体系结构、取向和交联的胶原蛋白成分,microdamage积累和骨重建活动或营业额也影响骨质量(3,12- - - - - -16]。通过这种方式,骨质量的评估是复杂的。解决这个问题的一个方法是拉曼显微镜。这个振动光谱学已经成功地应用于描述组织,特别是骨组织(17- - - - - -20.]。使用拉曼光谱在生物调查提供了几个优势。这个物理技术使得确定的化学成分和结构组织在显微结构的水平(21,22]。拉曼光谱提供了微米尺寸的空间分辨率(0.5 - 1μ米),使分析生物学上重要的个人水泥线等网站,个人薄片,微裂隙周围地区,和人类牙本质小管(23,24]。光谱数据以非侵入性的方式获得的,所以相同的样本可以检查的各种分析方法。拉曼光谱不被水,允许充分水化样品的分析,以最小的样品制备。可见和近红外光学、拉曼仪器,使用的兼容光纤探针用于临床关节内窥镜等仪器。这样,拉曼光谱法可以直接使用关节镜手术。Esmonde-White等人表明拉曼光谱的使用关节镜的人类共同组织使用一个定制的光纤探针(25]。拉曼光谱可以提供详细的化学信息在未经加工的骨矿物和胶原蛋白基质成分制剂(20.,26]。拉曼乐队敏感分子取向;因此胶原纤维的排列和磷灰石晶体中的骨单位和骨小梁也可以决定(16,27- - - - - -29日]。通过使用一个机动镜台,拉曼光谱技术可以获得样品的拉曼光谱地图空间信息和显示分布和取向在组织表面的化学成分。在先前的研究中,拉曼光谱成像技术被用来研究这个复杂的组织系统,如骨组织(24,27,28,30.]。

兴奋,拉曼散射光的偏振提供附加信息的结构和取向分子骨的组成部分。骨组织的一些乐队在拉曼光谱非常敏感的分子取向(27- - - - - -29日]。磷酸的光谱参数和酰胺我喇曼乐队改变更多不同偏振方向的兴奋和散射光束光谱参数的酰胺三世,磷酸磷酸,拉曼。磷灰石晶体的晶体C-axis沿胶原纤维和相关联磷酸振动。因此,磷酸带强度有一个最大值,当入射光的偏振方向平行的胶原纤维(31日]。胶原蛋白三螺旋结构决定了酰胺键的位置对骨干。C = O债券酰胺我都垂直于胶原蛋白分子轴;因此我乐队的酰胺,这是与C = O伸缩振动有关,更强烈的偏振方向垂直于胶原纤维轴(32]。通过这种方式,磷酸和酰胺我乐队非常敏感的散射光和入射光的偏振方向,已与当地的胶原纤维的取向和骨组织的磷灰石晶体。另一方面,那些分配给酰胺等乐队三世,磷酸磷酸,不太敏感的取向效果和显示骨组织矿物质和有机成分的变化(29日]。在这项研究中所使用的线性偏振入射和散射光获得拉曼光谱图,它允许在骨小梁表面显示胶原纤维排列。

拉曼光谱提供的信息在骨组织矿物质和有机基体组成。两个最常报道的测量拉曼分析化学是胶原蛋白的羟磷灰石骨比和碳酸磷灰石羟磷灰石比率,从集成领域获得的磷酸和碳酸,第三,酰胺乐队。这些参数提供一个指示骨组织的矿化和描述程度的碳酸盐磷灰石晶格取代。拉曼光谱也允许显示骨组织组织胶原纤维取向等由使用羟磷灰石骨单位和骨小梁胶原比例参数。胶原蛋白比例的羟磷灰石是获得综合区域的磷酸盐和酰胺我乐队,依赖于组织的组织。在早先的研究中提出的参数被用来估计骨组织的成分和结构性质(16,23,24,33- - - - - -36]。生物材料表面的不规则乐队在拉曼光谱强度的影响。由于潜在的变化在距离目标样本,乐队面积比率是用来描述骨组织的成分和结构。

这项工作的目的是评估的能力拉曼光谱识别分子组织和化学成分的细胞外基质胶原纤维等安排,矿化的程度,在矿物和碳酸盐积累阶段的松质骨股骨的人头。松质骨的组成和结构的变化组织所使用的地图偏振拉曼光谱。特别是,本研究的目的是确定安排的矿化胶原蛋白骨小梁表面通过使用转换的拉曼光谱图。转换的拉曼光谱图,新应用程序来确定骨头属性,需要为了消除化学成分影响拉曼光谱的图像地图,显示胶原纤维的取向。这些转换允许同时获得骨成分的分布和排列的胶原纤维组织表面。方法表明胶原蛋白开发方向了解分子组织在健康和不健康的骨骼在显微结构的水平。

2。材料和方法

在这项研究中,拉曼显微镜是用来估计胶原纤维的化学成分和取向的人类收集的松质骨股骨的头五个病人在60到85岁之间,接受一个高能股骨颈骨折。上述患者的治疗选择是髋关节置换手术全髋关节置换术()。5毫米厚的截面是获得这些患者的股骨。在这部作品中,一个代表股骨头上的一项研究结果从一个63岁的女人。研究了当地的生命伦理委员会批准Wielkopolska医学室Poznań(没有14/2008从8月27日,2008)。

所有的光谱测量进行共焦拉曼显微分光镜(inVia)由英国配备二极管泵浦激光器发射红外波长785纳米。激光束是紧密关注样品表面通过徕卡50 x LWD显微镜物镜(LWD:长工作距离)和数值孔径(NA) = 0.5,导致激光束直径约2μm。从表面获得的拉曼散射光谱是骨组织的反向散射几何的光谱范围200 - 1800厘米⁻¹。在测量期间,尽量减少样本退化或样本加热大约10兆瓦的入射功率是变暗。波数和强度是定期校准使用521厘米⁻¹乐队的硅样品内部。显微镜物镜的位置对骨组织piezoelectrically控制在三个轴表面映射。在显微镜下测量了高confocality模式的深度分辨率等于2.2μm。入射光的线性偏振选择半波板。发现拉曼散射光的线偏振(垂直和水平方向)使用偏光镜。获得的在不同的激光偏振拉曼光谱在同一位置对于给定样本。拉曼光谱图实现收集单一光谱,曝光时间的10年代为每个光谱没有积累。骨组织表面的拉曼图像获得的矩形区域步骤10μ米在七种不同网站的特定股骨头(35股骨不同站点的五头)。安排的分析矿化胶原蛋白在骨小梁表面通过使用转换这些35拉曼地图给了相同的结果。因此,研究的结果提出了一个站点股骨的头上。样品测定在室温(296 K)。宇宙射线的文物被移除和分析的光谱进行线3.1(英国)软件。瑞利散射背景是减去手动从每个原始频谱利用多项式曲线。综合区域拉曼乐队在单一光谱曲线拟合或反褶积计算。拉曼乐队的综合面积比率是用来检测骨组织的成分和结构的差异。这些照片是由OriginPro 8.0软件生成。

3所示。结果与讨论

图1给出了一个一般的松质骨样本的拉曼光谱显示相对应的主要乐队矿物和有机阶段。主要振动带的位置观察到的拉曼光谱的骨组织和各自的任务表中列出1。光谱的矿物乐队是主导磷酸()内部模式在961厘米⁻¹。的其他标记与矿物成分和磷酸振动检测到431厘米⁻¹和589厘米⁻¹分别为(20.,27]。的内部模式碳酸盐组(在1072厘米)检测⁻¹(模式b型碳酸盐),1103厘米⁻¹(模式a型碳酸盐岩)[16]。然而,a类型的弱点碳酸盐乐队不允许获得信息的复合骨组织;因此使用b型模式。分配给有机成分的乐队(胶原蛋白和noncollagen根)在区域:~ 1200 - 1305厘米⁻¹(酰胺III) ~ 1599 - 1701厘米⁻¹(酰胺我)~ 1405 - 1490厘米⁻¹2800 - 3100厘米,~⁻¹(弯曲和伸展的碳氢键模式组,分别地。)(20.,28]。拉曼信号不仅取决于组成,还在当地胶原纤维或磷灰石晶体的取向。因此,在骨组织乐队来表示化学成分的变化,对方向不敏感的影响。无机和有机成分确定从以下拉曼乐队:酰胺III(整合区~ 1200 - 1305厘米⁻¹),磷酸(整合区~ 370 - 486厘米⁻¹),磷酸(整合区~ 511 - 632厘米⁻¹)和碳酸盐岩(整合区~ 1041 - 1107厘米⁻¹)。我依赖的酰胺和磷酸盐拉曼强度乐队结构组织允许确定安排在骨组织的胶原纤维。胶原纤维的取向是使用集成的指示面积~ 1599 - 1701厘米⁻¹酰胺我乐队和~ 932 - 989厘米⁻¹的磷酸乐队。

综合区域的比例适当的乐队在拉曼光谱被用来获取骨组织的生化性质。化学成分的比率的标记/酰胺三世,/酰胺三世,/被使用。磷酸胶原蛋白比识别差异在骨组织矿化,而carbonate-to-phosphate比率给信息的程度碳酸磷灰石晶格中积累。的比例/酰胺我计算,用于调查胶原纤维的取向。松质骨的成分和结构变化说明使用偏振拉曼光谱的地图。图2提出了图像的比率/酰胺III(数据2(一),2(d)2(g)),/(数据2(b),2(e)2)和(h)/酰胺我(数据2(c),2(f)2(我))。拉曼光谱的地图生成的垂直和水平极化入射和散射光。图中的箭头表示这些极化方向。每个图像显示松质骨表面的同一区域。规模的酒吧、指定比率的最大值和最小值是0对所有图像。鲜明的对比与最大比例,而黑暗的最低的一个。

中使用的乐队的比率/酰胺三世和/定向效应不敏感,所以地图基于这些比率是相似的,不显示相当大的变化对比不同偏振的入射和散射光。通过这种方式,/酰胺三世和/率分布的图像作为指标松质骨组织的化学成分。结论在松质骨的矿化程度可以从图2显示的比例/酰胺三世获得激光的垂直极化(V极化(图)2(一)),垂直偏振激光入射和散射光束(VV极化(图)2(d))和激光入射和散射光束的水平极化(HH极化(图)2(g))。这些图片现在非常相似的对比变化尽管获得的拉曼地图在不同极化方向。因此,对比图像比的基础上/酰胺III是一个很好的指示器的羟磷灰石晶体的含量变化对胶原蛋白在骨小梁表面。这些图像对应的光明和黑暗区域更高和更低的比率的矿物有机的内容。图2显示图片的比例/获得的垂直极化激光(图2(b)),垂直极化激光入射和散射光束(图2(e)),水平极化激光入射和散射光束(图2(h))。这些图片说明相对分布的矿物成分骨小梁表面也存在类似的对比变化的比率/酰胺三世尽管获得的拉曼地图在不同极化方向。这些图片的光明和黑暗区域对应于更高和更低的比率的碳酸磷灰石羟磷灰石内容。carbonate-to-phosphate晶体的高比率数据2(b),2(e)2(h)发生在同一地区的比率越低羟磷灰石胶原蛋白含量的数字2(一),2(d)2(g),有可能增加碳酸磷灰石晶格中替换发生在应对不足的矿化。

图2显示/酰胺我乐队的比率对比图像获得的胶原纤维取向很敏感的垂直极化激光(图2(c)),垂直极化激光入射和散射光束(图2(f)),水平极化激光入射和散射光束(图2(我))。的/酰胺我比对比图片应该确定小梁胶原纤维排列;然而这些图片不显示明显的结构性影响。数据2(c),2(f)2(我)的基础上/酰胺我比率显示轻微的对比变化相比,那些在其他比率图像指的骨小梁的化学成分(数字2(一),2(d)2(g))。相似的字符映射指的胶原蛋白定位和化学成分可能是与骨组织成分的分布有关。这意味着在地图指化学成分差异对比太大对这些指胶原纤维排列,所以定向效应是无法觉察的。因此,数据2(c),2(f)2(我)非常相似的数据对比图像2(一),2(d)2(g)。此外,在数字图像2(f)和2(我)说明胶原蛋白对骨小梁表面取向几乎相同的和他们对比不改变不同的激光入射和散射光偏振。因此,很难得出结论,如果最高对比对应于胶原纤维的取向或化学成分的变化。去除化学成分的影响/酰胺我比对比图像获得不同的激光入射和散射光偏振,这些对比图像的转换。转换允许显示在图像的方向没有化学成分胶原纤维。

图3显示对比度图像通过使用转换的拉曼光谱图。规模的酒吧、指定比率的最大值和最小值是0对所有图像。鲜明的对比与最大值,而黑暗的最低的一个。数据3(一),3(b)显示图像通过使用第一个转换的拉曼光谱图。图3(一)说明了图像之间的不同的值/酰胺我比率值获得的水平极化激光入射和散射光束(HH极化)和/酰胺我只比率值获得的水平极化激光偏振(H)。图3(b)说明了图像之间的差值/酰胺我比率值获得的垂直极化激光入射和散射光束(VV极化)和/酰胺我只比率值获得的垂直极化激光偏振(V)。第一个拉曼光谱转换地图可以显示胶原纤维取向,这是平行于水平方向(图3(一))和垂直方向平行(图3(b))。如果胶原纤维的取向不是平行于水平或垂直偏振激光,如果纤维倾斜,那么检测到胶原蛋白分子的极化率变化的光偏振。因此,这种胶原纤维排列也同时在数据可见3(一)和3(b)中的箭头人物3(一)和3(b)对骨小梁表面显示胶原纤维排列。

图3(c)显示对比度图像通过使用拉曼光谱的第二转换地图。图3(c)与总说明了图像值[(VV−V) + (HH−H)]的总和(VV−V)值和(HH−H)值从第一个转换。这第二个转换允许显示胶原纤维排列在每个方向的骨小梁表面。圆图3(c)显示最大值的地区。最大值的地区发现的部分骨小梁表面箭头交叉的地方。它可能意味着在这些部分骨小梁胶原纤维互相重叠。拉曼图转换的结果表明,该方法分析胶原纤维排列的骨小梁表面可能是非常有用的,以确定属性的骨组织在显微结构的水平。

4所示。结论

在这项研究中所使用的线性偏振入射和散射光获得拉曼光谱地图显示骨小梁的结构的变化。拉曼光谱的地图比例的基础上/酰胺三世和/没有显示出相当大的变化对不同偏振的入射和散射光,所以这些图像作为一个指示器的松质骨组成,也就是说,给信息相对数量的羟磷灰石胶原蛋白和碳酸磷灰石羟磷灰石。拉曼光谱地图基于的比率/酰胺我应该显示在小梁胶原纤维排列,因为乐队在这个比率是相当敏感的胶原蛋白取向。然而,这张照片没有显示明显的改变对不同偏振的入射和散射光。它可能意味着在地图指化学成分差异对比太大对那些指胶原纤维取向的取向效应是无法觉察的。这些结果说明利用拉曼光谱转换映射,允许删除化学成分对这些地图的对比图像的影响。在这项研究中,我们使用两个变换拉曼光谱的地图。第一转换移除化学成分的影响对比图片和显示胶原纤维排列在骨小梁表面平行于水平和垂直方向。第二个转换允许显示胶原纤维排列在每个方向的骨小梁表面。结果允许结束/酰胺我比率允许确定在松质骨组织中胶原纤维的取向;然而,如果我们想说更多关于胶原纤维安排,我们可以使用转换提出了工作。

调查结果表明拉曼光谱应用的可能性微量分析的成分和胶原纤维排列人体骨组织。方法,它允许区分取向和创作的贡献,关键是骨矿化的胶原纤维组成的交替方向骨单位骨小梁。了解骨组织组织在显微结构的水平可以帮助发现骨质疏松症等骨骼疾病的起源或骨关节炎。测定胶原纤维排列的模式允许评估骨的生物力学性能,因此提供信息敏感性的骨头骨折。

确认

波兹南的样本准备大学医学科学。所有的测量进行了英国inVia显微镜在波兹南理工大学。实验过程都是通过当地的生命伦理委员会在波兹南Wielkopolska医学室(没有。14/2008从8月27日,2008)。这项研究是在研究项目中执行DS PB 64 - 001/12波兹南大学的技术。作者托马斯·布赫瓦尔德宣称他是一个奖学金项目持有人在“奖学金支持博士生专业专业Wielkopolska发展战略”,Submeasure 8.2.2人力资本运营计划,共同提供资金由欧洲联盟欧洲社会基金。作者要感谢地中海。b . Ciesielczyk博士和博士n .地中海。a . Piotrowski大学的医学科学研究的准备材料。