文摘

DNA复合物的结构组织染色体蛋白质和链接器组蛋白和非组蛋白的H1,研究了利用圆二色性光谱(CD)和原子力显微镜(AFM)。它已经表明,由于HMGB1之间的交互和H1高度有序的dna蛋白质复合体出现在解决方案。它们的光谱特性发现类似DNA / HMGB1 - (AB)复合物的报道。AFM图像揭示fibril-like结构解决方案的形成。我们建议HMGB1的静电屏蔽由组蛋白c端域H1促进更强的交互HMGB1 / H1和DNA的有序超分子DNA蛋白质复合体的形成。

1。介绍

各种各样的DNA结合蛋白质与DNA在细胞nucleus-forming复杂的DNA蛋白质复合物。“建筑”有一个特殊的类蛋白在染色质执行结构功能。HMGB-domain蛋白家族是建筑最出名的例子之一的蛋白质。内的蛋白质家族的共同特征是他们的dna结合主题,通常称为HMGB-domain [1,2]。HMGB-domain的结构是高度保守的。这个家族中的一些蛋白质只包含一个HMGB域,但大量的蛋白质具有两个或两个以上的HMGB-domains。家庭的成员能够区分,最好结合在DNA扭曲的地区,如四通接头,结合位点的抗癌药物顺铂,和其他各种各样的弯曲和跨界车3]。另一个丰富的染色质蛋白具有类似属性的链接器组蛋白H1 [4- - - - - -6),另一种连接器DNA的入口/出口核小体。这些蛋白质在活细胞的功能需要大的超分子复合物的形成和DNA。当重建在体外这种复合物通常倾向于总,这导致他们的降水。然而,我们先前的研究显示,在一定条件下HMGB-domain蛋白能诱导有序多分子的复合物的形成在绑定到DNA (7,8]。本研究的目的是探讨HMGB1-DNA复合物的结构组织的链接器组蛋白H1利用圆二色性光谱(CD)和原子力显微镜(AFM)。

2。材料和方法

获得dna蛋白质复合物,H1 (21000 MW)组蛋白和非组蛋白的蛋白质HMGB1(26500兆瓦)。蛋白质都是孤立的从小牛胸腺如前所述9]。描述了系统中的蛋白质含量的蛋白质的DNA碱基对摩尔比 。例如, = 7 0 (或70:1 b.p。蛋白质分子比)意味着有70个DNA碱基对中每一个蛋白质分子的解决方案。在所有复合物的H1 HMGB1摩尔比率维持在1:1。复合物的CD谱记录使用CD6 dichrograph (Jobin-Yvon、法国)5毫米圆柱形石英细胞;DNA的浓度保持0.06毫克/毫升。复合物是由蛋白质和DNA的直接混合解决方案在适当浓度的氯化钠15毫米。云母的AFM图像得到开发模式所描述的其他地方(10]。

3所示。结果与讨论

大的dna蛋白质复合物,在紫外光谱方法研究地区,经常造成相当大的光散射,从而影响光谱波段的形状。的圆二色性(CD)光谱,它会导致特征光谱的形成模式,调用ψ类型CD光谱(聚合物和盐诱导11])。这样的光谱模式的出现是由于静电凝结的DNA与另一种聚合物和高浓度的抗衡离子。然而,有时不是ψ类型CD光谱,它可以观察到增加旋光性DNA的数量级,由于大的存在和高度有序的超分子DNA结构的解决方案(3,8,12- - - - - -15]。正如我们前面显示的,DNA与HMGB-domain蛋白质之间的相互作用的结果在某些情况下结构的形成有序超分子复合物,也诱导DNA异常强烈的旋光性(7,8]。形成该种染色质纤维强烈依赖链接器组蛋白之间的相互作用H1和non-histone建筑蛋白质与DNA。检查是否组蛋白相互作用的H1和non-histone HMGB1蛋白能够引发一种自发形成的有序DNA蛋白质结构,我们准备人工两个染色体DNA和蛋白质之间的配合物:组蛋白H1和non-histone HMGB1的蛋白质。染色质蛋白质最丰富的蛋白质,和他们发挥重要作用在染色质的结构组织在postnucleosomal级别的组织结构。这些蛋白质还能启动形成的超分子结构与DNA时,和他们每个人都能够诱导ψ类型CD光谱的DNA,表示强烈的分子间相互作用出现在解决方案(9,16]。

典型的DNA UV-CD光谱及其复合物的克分子数相等的混合物HMGB1蛋白和H1在图1。DNA碱基对,蛋白质比例超过175:1配合物的光谱显示只有小强度的逐渐减少的DNA带附近的275海里,表明DNA蛋白质相互作用在DNA双螺旋结构的大沟。相当大的样品的光散射 = 1 4 0 导致的形成ψ例如CD光谱。这些CD光谱表明,大型多分子的复合物可能出现在解决方案。进一步提高蛋白质含量会导致增加强度的DNA CD乐队。尽管在 = 7 0 光散射仍相当大的溶液中,光谱类似于DNA绑定到HMGB1 - (AB)蛋白质(图2),它是由高度有序的dna蛋白质复合物(早些时候7]。DNA的结构顺序/ HMGB1 - (AB)蛋白质/ DNA复合物非常敏感率,并观察非常狭窄 时间间隔。当系统中存在两种蛋白质H1和HMGB1 CD光谱的DNA在复杂敏感,在其他因素中,H1 / HMGB1比率。特别是,使用上述方法,我们可以获得强烈的CD信号只有在这些复合物,H1 HMGB1的摩尔比接近1。


图1
CD光谱与non-histone复合物的蛋白质和DNA HMGB1不同DNA和组蛋白H1蛋白比率 ,定义为DNA碱基对的数量每一个复杂的蛋白质分子。复合物的比例175:1;140:1;70:1;10:1标记的阴谋。DNA的浓度在所有样品是0.06毫克/毫升;光程长度为0.5厘米。HMGB1 H1在样品的摩尔比率保持1:1。

图2
CD光谱的DNA及其与重组蛋白复合物HMGB1 - (AB)在不同DNA蛋白比率 ,定义为DNA碱基对的数量每一个复杂的蛋白质分子。比率的复合物45:1;30:1;20:1标记的阴谋。DNA的浓度在所有样品是0.03毫克/毫升;光程长度为1.0厘米。

可视化结构的旋光性强负责DNA复合物,我们利用原子力显微镜。使用这种方法的dna蛋白质复合物克分子数相等的H1 / HMGB1比进行了研究。典型的图像配合物与DNA碱基对蛋白质比例 = 3 5 如图3。图片显示非常延长fibril-like结构。基于线性尺寸,我们认为每个原纤维是由几种DNA分子扭曲在彼此。单个DNA分子在原纤维结合在一起的蛋白质分子。大量的dna蛋白质和蛋白质的相互作用使纤维,而稳定。最有可能的是,组蛋白H1的存在导致了部分中和的负电荷DNA的磷酸基,HMGB1的c端序列。后者H1-HMGB1复合物有点类似于上面的HMGB1 - (AB)蛋白质,缺乏带负电荷的c端氨基酸序列,但保留可用的HMGB域绑定DNA分子。正如我们前面提出的(7,8的中和HMGB1的带负电荷的氨基酸序列是必不可少的两HMGB域之间的相互作用的蛋白质与DNA。这样一个bidomain交互促进,反过来,高度有序的dna蛋白质复合物的形成。的带负电荷的尾巴HMGB1绑定到组蛋白H1,它可以有两个严重的后果:(i)的两个HMGB-domains HMGB1能够与DNA相互作用,形成更强的DNA蛋白质复合物;(2)HMGB1-H1蛋白质复合物能够产生DNA分子间交叉连接非常有效。这两个因素促进超分子复合物的形成,观察上面。


图3
AFM高度跟踪的图像DNA-HMGB1 / H1复合物在云母开发模式。DNA蛋白质比例 ,定义为每一个蛋白质分子DNA碱基对的复杂是35:1。HMGB1: H1摩尔比例是1:1。酒吧的规模相当于100海里。

因此,HMGB1的静电屏蔽由组蛋白c端域H1促进强HMGB1 / H1与DNA之间的相互作用和有序的超分子复合物的形成。

确认

作者感谢俄罗斯基础研究基金会(RFBR)(批准09 - 08 - 01119/12 - 08 - 01134),圣彼得堡的政府,联邦项目,“科学和教育劳动力创新俄罗斯(GC P1163)”为他们的财政支持。他们也感谢卓娅Leonenko博士对AFM实验的帮助。