文摘

Drop-coating沉积拉曼(DCDR)光谱来研究脂质体悬浮液。方法是基于一个特定的疏水性表面的干燥过程,有效地积累大分子样品环的边缘的干滴。我们研究脂质体悬浮液从两个来源购买(两代情极性脂质,inc .)和Sigma-Aldrich有限公司),准备在不同条件下。结构的干大大依赖于脂质浓度下降,脂质成分的样品,和使用溶剂。最佳的脂质浓度约为0.3毫克/毫升在所有情况下,asolectin和DSPC悬浮液形成紧凑干滴当溶解在水中磷酸盐缓冲剂,分别。干燥过程的样本不影响初始阶段状态下降(凝胶或高分子液晶)脂质体的研究除了DSPC Sigma-Aldrich,有限公司

1。介绍

脂质体作为弯曲的脂质双分子层形成的球形囊经常用作生物膜的模型系统。拉曼光谱,合适的非侵入性技术研究中,需要高度集中和也经常大量的样本。低灵敏度的古典拉曼技术可以克服drop-coating沉积拉曼(DCDR)光谱学基于沉积体积小的样品溶液(单位μL)在一个特殊的疏水表面(1]。沉积样品蒸发与“咖啡环效应”导致形成环的边缘部分液滴包含大部分的样品(2]。这枚戒指的样品是高度集中,给可再生的拉曼信号。DCDR技术允许测量拉曼光谱的低浓度生物分子(如肽大约0.01毫克/毫升(3])。在我们先前的研究[4,5我们证明了脂质体研究DCDR技术的潜力。拉曼光谱的脂质体初始溶液浓度为0.3毫克/毫升,和干燥过程不会改变他们的初始阶段状态(5]。此外,分离样品的不同部分(复杂的)自由和可以学习交互与双分子的脂质体复合体(4]。另一方面,我们发现各种制备参数可以影响干燥过程,因此获得DCDR光谱。

在本文中,我们研究了两个不同的脂质体:首先由合成脂质(1,2-distearoyl -sn-glycero-3-phosphocholine DSPC)和第二由脂质提取(从大豆asolectin)。我们集中注意力转向脂质体制备过程的影响,即脂质浓度、溶剂(水使用与缓冲)和脂质来源(Avanti极性脂质。与Sigma-Aldrich, DCDR光谱获得的有限公司)。

2。实验

合成磷脂,1 2-distearoyl -sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC),和一个天然提取asolectin,从大豆,混合不同的脂质(磷脂卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰肌醇等)从两个供应商购买:两代情极性脂质,inc .)和Sigma-Aldrich, Co . .样品的脂质体悬浮液准备在基本协议从[6]。准备将讨论进一步的细节。磷酸盐缓冲剂(5毫米,pH值7.4)和去离子水作为溶剂使用。原始悬浮液(1毫克/毫升)三倍稀释的溶剂DCDR光谱和集中≈50毫克/毫升的古典拉曼光谱的解决方案。在DSPC磷酸溶解在缓冲,稀释后悬架是由微孔透析“透析”技术大约15分钟。漂浮微孔过滤盘(微孔膜“V”系列,0.025μ米)放在水面,约5μL样品的沉积。这种方式从缓冲盐可以通过膜扩散。2μL滴样本随后被带和沉积DCDR板SpectRIM (Tienta科学、幻灯片和抛光不锈钢基地组成的表面涂上一层薄薄的聚四氟乙烯)。样品在室温下干燥约为40分钟。

一个共焦拉曼显微分光计LabRam HR800 (Horiba Jobin和Yvon)配备nitrogen-cooled CCD探测器,氦氖激光激发(632.8海里,~2兆瓦),600槽/ mm光栅,目标100 x和没有水浸的积累光谱从悬浮液和干滴,分别。光谱测量在室温和收集在300 - 3600厘米−1光谱范围与 3 × 6 0 收集时间。

3所示。结果与讨论

我们的研究包括两个选定的脂质:一个合成纯DSPC,经常作为一个模型系统的生物膜脂质提取asolectin,混合不同的脂质,例如样本接近真正的生物膜。

溶剂对环的形成在干燥的影响见图1。DSPC脂质体悬挂在水中准备根据标准程序起源于形成非均匀和noncompact结构没有明显的环。另一方面,干的脂质体悬浮液在磷酸缓冲环轮结构,形成明显的区别。盐缓冲留在中心的晶体和/或环的水滴,可以干扰脂类物质的拉曼光谱。为了避免这种情况,可以透析样本在沉积DCDR盘子。透析约15分钟似乎是最优的。透析样本产生干水滴轮形状(~1400年μ米直径)和很好地形成边缘环(约180μ米宽)。Asolectin脂质体悬浮液与DSPC使一个紧凑的干燥后,溶解在水里。因此,我们建议一个条件最优干结构强烈依赖于脂质组成。

(一)
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(b)
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图1
白光缩微图像SpectRIM DSPC干滴沉积的幻灯片;原来悬浮在水(a)和磷酸盐缓冲剂(b)。准备下降缓冲透析后沉积(20分钟)。

优化DCDR光谱分析样品的制备过程,适当的脂质体悬浮液的浓度对沉积是必要的评估。最优浓度似乎是大约0.3毫克/毫升样品。在这种情况下,可再生的拉曼光谱的脂质边缘环可以获得。浓度高于0.5毫克/毫升导致厚干层与拉曼光谱变化根据励磁激光束聚焦。如果使用较低的初始浓度,紧凑干滴没有形成。值得提及的是,asolectin浓度为0.4毫克/毫升只有约100,需要大量脂质体悬浮液的获得良好的拉曼光谱。

图2显示了典型的拉曼光谱asolectin (A)和DSPC (B)购买从Sigma-Aldrich Co .) (B)和两代情极性脂质,Inc . (c)的供应商。光谱的比较脂质体溶液(a)和环的干下降了(b), (c)。在水溶液的浓度样品必须至少高出50 x初始的。光谱测量水中悬浮体(a)包含两大乐队~ 3400厘米−1哦拉伸振动对应的水。这些乐队不发生在光谱从干滴样本的干燥工序完成。其他光谱特征显示典型的碳碳拉伸骨骼模式在1000 - 1150厘米−1和碳氢键拉伸模式在2800 - 3100厘米−1(5,7]。的 2 8 5 0 / 2 8 8 0 和 2 9 3 5 / 2 8 8 0 强度比率描述相变的命令凝胶在低温阶段无序的液晶相在高温下(7,8]。拉曼光谱从水溶液为样本两个供应商都是一样的:DSPC凝胶阶段,asolectin高分子液晶的阶段,分别为(从Sigma-Aldrich看到光谱(a),脂质,有限公司)。碳氢键的强度比拉伸乐队的拉曼光谱测量干滴(光谱(b)和(c))清楚地表明,DSPC样本来自两代情极性脂质,inc .)保持凝胶阶段从Sigma-Aldrich液滴蒸发而样本后,公司经历了从凝胶相变高分子液晶相。相比之下,两家公司干asolectin样本阻止其高分子液晶相的解决方案。因此,我们建议脂质干样品阶段取决于脂质源(供应商、纯洁)。


图2
拉曼光谱的比较从脂质体水中悬浮体(a)和环(b)下降,(c) asolectin (a)和DSPC (b)从西格玛奥德里奇购买样品,有限公司(a)、(b)和两代情极性脂质,Inc . (c)。

4所示。结论

DCDR技术是脂质体研究的有效工具。样品适当准备与最优脂质浓度和不同环形成一轮下跌后沉积DCDR板。非常低的样本浓度DCDR光谱学是充分的。脂质浓度约为0.3 - -0.5毫克/毫升被发现适合DCDR方法,而对于大部分的拉曼光谱暂停30 - 80毫克/毫升往往是必要的。

环的形成实质上还取决于溶剂使用。Asolectin脂质体悬浮液使紧凑一轮下跌后干燥时,溶解在水中。DSPC下降不是紧凑准备时相同的条件。脂质溶解在磷酸盐缓冲剂和随后的透析DCDR板上沉积在这种情况下是必要的。在蒸发过程中不改变脂质体的初始阶段所有样品除了DSPC从Sigma-Aldrich Co .)因此,我们建议的脂质阶段干样品取决于脂质源(供应商、纯洁)。

光谱测量的内部环显示良好的重现性。上滴干DCDR板在水溶液和样品相同的属性可用于生物膜的研究。DCDR技术是关于两个数量级更敏感比溶液的拉曼光谱。

承认

捷克科学基金会(不支持。208/10/0376)。