文摘

在本文中,我们研究了不同条件下protein-ligand互动的特点。我们已经表明,盐酸胍(GdnHCI) unfolding-refolding GGBP的葡萄糖的存在(相关)是可逆的,但复杂的平衡曲线refolding-unfolding已经达到后10天的孵化GGBP /相关GdnHCl的存在。这种效应尚未透露在燥热引起GGBP /相关变性。本机蛋白质之间缓慢平衡GGBP /相关复杂而展开的蛋白质GdnHCl存在与增加粘度的解决方案在中等和高GdnHCl浓度干扰葡萄糖分子的扩散。因此,限制unfolding-refolding过程的步骤的复杂GGBP /相关的中断/调优配置适合原生状态的蛋白质和配体之间。

1。介绍

建设生物传感器系统的永久监测人体血液中葡萄糖水平的高度重视糖尿病患者(1,2]。的一个最有前途的方向持续血糖监测是葡萄糖生物传感器系统的设计和开发,特别是结合蛋白质作为敏感元件(3]。D-galactose / D-glucose-binding蛋白(GGBP)可以用作等生物传感器系统的传感元件GGBP和葡萄糖之间的相互作用导致的蛋白质结构构象发生了重大改变4]。GGBP低离解常数的葡萄糖绑定(1μ米)这意味着它可以作为敏感元件的生物传感器系统抽样的血液或间质液体稀释。特别是,反向电离子透入疗法降低了样品中葡萄糖浓度的千重(5,6]。

任何生物传感器系统的一个重要的和可取的特性是它的稳定性在不同变性条件下敏感元件。因此,本文重点研究GGBP稳定性及其与葡萄糖(GGBP /相关)的复杂的盐酸胍变性行动(GdnHCI)和加热。一个重要的影响粘度protein-ligand交互的解决方案已经被观察到。

2。材料和方法

2.1。材料

GGBP从大肠杆菌和纯化得到描述。大肠杆菌BL21 (DE3)细胞转化pET-11d GGBP从质粒编码大肠杆菌使用。蛋白表达是诱导增加0.5毫米isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG;Nacalai Tesque、日本)。细菌细胞在培养24 h 37°C。重组蛋白纯化使用镍+琼脂糖用His-GraviTrap列(美国通用电气医疗集团)。蛋白质纯化使用变性控制在15%聚丙烯酰胺凝胶(sds电泳7]。测量在一个20毫米Na-phosphate缓冲区进行pH值8.0。蛋白质的浓度0.2 - -0.7毫克/毫升。

美国葡萄糖的样品(σ)和GdnHCl (Nacalai Tesque,日本)是使用前未经纯化。GdnHCl浓度的解决方案是由阿贝折射仪(LOMO、俄罗斯)。葡萄糖浓度在所有实验GGBP 10毫米/相关复杂。对Ca2 +去除,EDTA(丙烯酰胺、瑞士)添加到它的最终浓度为0.18毫米。

2.2。荧光测量

荧光实验进行了使用卡里Eclipse荧光光谱仪(瓦里安、澳大利亚)与微蜂窝技术( 1 0 × 1 0 mm;瓦里安、澳大利亚)。荧光在297 nm和280 nm)很兴奋。参数的值 = 3 2 0 / 3 6 5 荧光光谱特征位置( 3 2 0 和 3 6 5 荧光强度在 e 米 = 3 2 0 和365海里,分别地。(8])和荧光光谱的仪器灵敏度的修正。

不同的荧光特征的平衡依赖GGBP GdnHCl浓度的记录在几天后蛋白质孵化适当浓度的解决方案在4°C。更详细的分析蛋白质的演变过程,为了确定中间状态的数量出现在通路从本地到展开的蛋白质,我们使用相图的方法9]。蛋白质的评价自由能的差异在本机和ΔG展开状态而你根据标准执行(0)计划(10]。

2.3。圆二色性测量

了CD光谱分光光度计Jasco - 810 (Jasco、日本)。远紫外CD光谱被记录在一个1毫米路径长度细胞从260纳米到190纳米。所有光谱,平均3 - 5扫描。蛋白质CD光谱计算考虑到CD的信号适当的缓冲溶液。

2.4。DSC测量

差示扫描量热法(DSC)进行了实验使用DASM-4差示扫描微热量计(“Biopribor,”Pushchino,俄罗斯)如前所述[11]。蛋白质样本加热以恒定速率1 K /分钟和2.4 atm的恒压。热转换的可逆性被重新加热样品评估后立即冷却步骤与前面的扫描。热过渡曲线被减去baseline-corrected扫描缓冲区只在两个细胞。所描述的蛋白质的热稳定性是最大的热转变温度( 米 )。热变性GGBP也是研究使用荧光蛋白质。色氨酸荧光强度的温度依赖性蛋白质记录在恒定的速度1°C /分钟。

3所示。结果与讨论

GGBP包含两个球状域几乎相同的拓扑连接三个移动区域。Sugar-binding站点位于两个域之间的深裂(12]。两个领域的核心部分包括六个β床单,周围α螺旋两边:两个和三个在另一侧。Ca2 +离子局部循环的c端域(134 - 142年的残留),与氧原子形成协调债券每秒钟渣的循环和Glu 205残渣。Ca-binding中心的结构类似于“类ef - hand”动机,典型的胞内Ca-binding蛋白(12,13]。

描述GGBP的稳定性,GdnHCl-induced unfolding-refolding实验进行了。不同结构探针(以固定登记波长,荧光强度参数 、各向异性和椭圆率222海里)被用来评估GGBP的平衡依赖于GdnHCl浓度和它复杂GGBP /相关以及他们calcium-depleted形式(GGBP-Ca和GGBP-Ca /相关职责)。固定曲线GGBP unfolding-refolding过程蛋白质孵化后GdnHCl解决方案适合24小时的浓度一致,特点是乙状结肠和中点等于形状 0 。 3 6 ± 0 。 1 0 M GdnHCl(图1(一))。在现实中,更快的达到平衡。它表明GGBP展开过程是可逆的,下一个运动计划: G G B P - - - - - - C 一个 U + C 一个 1 ⇆ − 1 G G B P - - - - - - C 一个 N + C 一个 2 ⇆ − 2 ( G G B P ) N 。 ( 3 。 1 ) 这意味着Ca绑定(GGBP-Ca)N是一个快速的过程。显然,GGBP折叠的限制阶段蛋白质天然态的形成。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图1
GdnHCl GGBP的燥热引起变性的存在和没有ligands-calcium和葡萄糖。(a)的平衡依赖荧光强度在320 nm GGBP和GGBP-Ca(黑色和灰色圆圈resp。)和GGBP /相关和GGBP-Ca /相关(黑色或灰色方块,resp)。开放符号:展开,关闭:重折叠, e x = 2 9 7 nm。(b)参数的变化 = 3 2 0 / 3 6 5 在蛋白质展开和折叠。展开曲线测量GGBP孵化后的解决方案的一个适当的变性剂浓度在4°C 24小时(灰色实线和灰色圆圈)和GGBP /相关期间孵化后24小时(黑色虚线和黑色开放广场)和10天(黑色实线和黑色圆圈)开放。日期从展开状态描述蛋白质复性孵化后测量解决方案的一个合适的变性剂浓度在4°C 24 h GGBP(灰色封闭圆圈)在24小时(黑色封闭广场)和10天GGBP /相关(黑色cicl关闭), e x = 2 9 7 nm。(c)多余的热容的温度依赖性GGBP(灰色)和GGBP /相关(黑色)。(d) Heat-incubation变性GGBP(灰色)和GGBP /相关(黑色),记录下荧光实验。两个顺序扫描(实线和虚线、职责)所描述的可逆性热转换, e x = 2 9 7 nm。

GGBP /相关的曲线展开测量24 h后的样品孵化GdnHCl适当浓度的解决方案是转移到更大的浓度GdnHCl相比,GGBP平衡unfolding-refolding曲线(图1 (b))。至于GGBP,葡萄糖结合常数很大(约1.0μ米−1,(4]),我们认为从GGBP GGBP /相关复杂地层和相关将是一个快速的过程。尽管如此,GGBP /相关的曲线复性记录24小时孵化后适当浓度的解决方案GdnHCl不配合GGBP /相关变性曲线,但更接近于平衡曲线GGBP unfolding-refolding。这个结果很出乎意料,因为它只能所以如果GGBP复杂的形成过程与相关限制阶段GGBP /相关地层(GGBP)U在相关的过剩和Ca的存在。这意味着GGBP /相关denaturation-renaturation曲线记录24 h后的蛋白质孵化GdnHCl适当浓度的不平衡曲线。我们已经表明,平衡曲线GGBP /相关展开和折叠同时可以获得10天的潜伏期后GdnHCl适当的浓度(数字1(一)和1 (b))。因此,GGBP的过程/相关unfolding-refolding是由动力学方案如下: ( G G B P - - - - - - C 一个 ) U + G 我 c , C 一个 1 ⇆ − 1 ( G G B P - - - - - - C 一个 ) N + G 我 c , C 一个 2 ⇆ − 2 ( G G B P - - - - - - C 一个 ) N + G 我 c 3 ⇆ − 3 ( G G B P / G 我 c ) N 。 ( 3 。 2 )

unfolding-refolding GGBP /的平衡曲线、相关展示乙状结肠形状转移到大GdnHCl GGBP的浓度有关。GGBP /相关展开的中点(0.93±0.03 M GdnHCl)发生在高GdnHCl浓度相比GGBP展开(数字1(一)和1 (b))。

荧光特性和椭圆率的值在222 nm之间截然不同的GGBP甚至GGBP-Ca变性剂浓度较低(图1(一))。然而,不同结构的平衡依赖探针GGBP-Ca /相关的几乎一致的GGBP /相关(图1(一))。曲线GGBP / Glc-Ca展开10天的孵化后达到平衡。同时,复性GGBP / Glc-Ca需要更大的时间(数据未显示)。

被参数化表示依赖关系的荧光强度在320 nm和365 nm GGBP记录和GGBP-Ca没有和葡萄糖的存在都被一条直线。单独与乙状结肠平衡unfolding-refolding曲线研究蛋白质的形状,这些数据支持GGBP两国展开。的平衡曲线unfolding-refolding GGBP GGBP-Ca单独和与葡萄糖复合物用于估计的差异蛋白质的自由能之间的本地和ΔG展开状态而你(0)ΔG的价值而你(0)GGBP几乎一半大的GGBP /相关(8.04±3.77,14.11±4.48焦每摩尔,职责)。的ΔG而你(0)GGBP-Ca价值不能准确的定义,因为它是不可能估计荧光强度的原生状态,而ΔG而你(0)GGBP-Ca /相关的价值几乎是不变的(13.31±4.40焦每摩尔)。很明显,calcium-depleted GGBP形式很不稳定。所有这些数据反映的稳定影响葡萄糖GGBP结构,而在没有绑定葡萄糖GGBP由钙离子稳定。

GGBP的热稳定性的存在和没有配体研究了差示扫描量热法(DSC)和由UV-fluorescence(数字1 (c)和1 (d))。量热GGBP的痕迹和GGBP /相关有最大温度(图51.3和64.7°C1 (c))。荧光强度对温度的依赖关系GGBP和GGBP /相关与熔化温度对应于s形 米 通过DSC(图的值1 (d))。钙损耗导致的重大变化量热跟踪GGBP-Ca ( 米 = 4 2 。 7 °C)。同时,最大的量热跟踪GGBP-Ca /相关( 米 = 6 1 。 5 °C)是接近GGBP /相关。燥热引起的所有GGBP是可逆的存在和没有配体的量热完全再现性的跟踪评估一次,重新加热样品冷却后一步。这也是由两个顺序扫描的巧合的荧光强度记录在这些蛋白质的热变性范围(图1 (d))。小偏差的重复扫描可以归因于蛋白质聚合发生在高温下。

总之,缓慢平衡GdnHCl-induced unfolding-refolding曲线GGBP /相关尚未观察到燥热引起变性的GGBP葡萄糖的存在。缓慢平衡之间的收购本地蛋白质GGBP /相关复杂,和GdnHCl展开的蛋白质的存在是与解决方案在中等和高粘度增加GdnHCl浓度,干扰葡萄糖分子的扩散。平衡建立了很长一段时间之前,有多余的浓度(相比,平衡)的复杂(GGBP /相关)N在展开的路径,或展开的蛋白质(GGBP)U在复性的途径。所以因为活化障碍必须克服在这两种情况下。的途径展开,复杂的分离的基本行为不会导致配置合适的相互作用分子的干扰GGBP和相关,因此逆反应的概率很高。相反,重折叠的途径不仅因为对于复杂地层的形成原生分子(GGBP)N但也出现配置合适的(GGBP)N分子和相关是必要的。因此,限制unfolding-refolding过程的步骤的复杂GGBP /相关的中断/调优配置适合原生状态的蛋白质和配体之间。

承认

这部分工作由教育部和科学(合同02.740.11.5141和16.512.11.2114),程序MCB RAS和SPb政府(ov)。