的影响β词序列上β发夹动力学研究Infrared-Detected温度跳跃

文摘

折叠动力学的β结构损失和无序结构获得模型中进行了研究β发夹基于科克伦的色氨酸拉链肽Trpzip2肽,但改变了Thr-Gly (TG)序列,即SWTWETGKWTWK,使用激光温度突变(不要急于)动力学与红外检测。之前的研究已经证实,TG序列从而减少热力学β发夹稳定而Asn-Gly序列用于Trpzip2 (TZ2-NG)。在这项研究中,我们发现TG-turn减慢整个弛豫动力学TZ2-NG相比,该研究在高温的弛豫时间常数没有区别β链和无序构象。这些时间常数成为TZ2-TG等效在较低的温度比TZ2-NG看到。放松的热力学稳定性和利率的相关性表明从NG TG结果放缓的折叠,低展开速度,用更少的变化,温度升高时,假设两个州的行为。

1。介绍

最简单的模型β表是β发夹组成的一个序列折叠回到本身将产生两股反平行的耦合。发夹已经被提议作为蛋白质折叠的成核点(1- - - - - -4尤其是,,β表形成生物医学相关是由于它的作用在许多疾病,尤其是amyloid-related [5- - - - - -7]。比表结构,β发簪更容易学习和模仿,因为只有两条链限制的方式进行交互,而不是多个链聚合或原纤维结构。

β发夹可以通过选择将残留稳定,倾向于把股接近使cross-strand H-bonding,或交互,通常疏水性,在相反的方向上残留的稳定结构紧凑,便于和H-bond形成(1,4,8- - - - - -10]。把发夹在稳定的角色已经被一些平衡研究的主题,试图提出的折叠机制1,11,12]。研究最多的一些发夹的色氨酸拉链(Trpzip)肽科克伦和同事(8),成对Trp-Trp交互,可以监视一个强大的exciton-based圆二色性(CD)因cross-strand联系(13- - - - - -15]。相比之下,酰胺的红外光谱(C = O伸展振动)肽链构象和特别有用β表研究[13,14,16- - - - - -23]。Trpzip分子在低温下有特点β结构红外返回了一个无序结构光谱在更高的温度16,17,22- - - - - -24]。我们分别报告了平衡研究的各种修改Trpzip2 (TZ2-NG)发卡Ser-Trp-Thr-Trp-Glu -序列Asn-Gly-Lys-Trp-Thr-Trp-Lys (SWTWENGKWTWK) [8),把序列不同Trps和残留(13,14,16,17,25,26]。我们和其他人也用laser-initiated不要急于光谱学TZ2-NG序列的研究动态,结合同位素标签指定序列依赖的折叠机制(17,27,28]。在本文中,我们为这种类型的发夹比较动态修改序列(图1),从Asn-Gly (TZ2-NG) Thr-Gly (TZ2-TG),这降低了发夹稳定,正如我们所示(25)和减缓其弛豫动力学,将显示在这里。

2。实验部分

2.1。多肽合成和红外样品制备

肽TZ2-TG Thr-Gly把合成和表征在UIC使用手动固态方法如前所述[13]。在这项研究中,纯化肽直接溶解在D₂O为平衡红外测量不调整pH值或删除组织抗衡离子肽合成的剩余。先前的研究不同pH值和浓度以及移除组织但对于这里的实验报道使用一种简单的方法,绕过冻干,另外增强的溶解度。红外光谱研究组织包含样本准备在低pH值和~ 20毫克/毫升(~ 12毫米),这证明良好的溶解度和可逆的折叠。

2.2。红外光谱平衡

红外光谱在热平衡测定5°C - 85°C的范围在5°C步骤4厘米⁻¹解决使用力量Equinox 55 HgCdTe探测器的红外光谱谱仪。是由一个温控器控制温度水浴(劳达Ecoline E300)加上一个自建电池座。肽的解决方案是两个CaF之间的密封₂windows相隔100年μ聚四氟乙烯垫片。细胞和样品室的引用都是安装在一个示例航天飞机和平衡后测量顺序为每个温度,以便获得一个光谱干扰由于长期避免基线漂移。热红外光谱光谱的变化符合标准两平衡表达式确定转变温度,,使用一个线性低温和平坦的高温基线连接如前所述16,25]。

2.3。不要急于测量

不要急于进行了实验用自制仪器已详细描述之前(29日]。获得的样本的温度跳跃5 Raman-shifted ns Nd: YAG激光脉冲在1909海里。为了减少不均匀加热的肽样本,泵脉冲被分成两个相等部分和对齐影响样品室的正面和背面。激发脉冲的一部分被推迟5 ns可减少气蚀的发生(30.]。样品的快速加热的激光脉冲转移到1.9μm是调整产量T ~ 10°C的各种初始温度范围从5°C到40°C。

铅盐激光二极管(310年Mutek TLS)为调查提供了CW模式在不要急于瞬态传输的变化。在1641厘米两种模式⁻¹和1663厘米⁻¹被用来检测的衰减吗β表结构和无规卷曲结构的兴起,分别。发现IR-signal使用光伏HgCdTe探测器(20 MHz, Kolmar KMPV11-1-J2)和数字化瞬态记录仪板进行进一步的数据分析。对于每个测量温度和波长,与2000年修正瞬变是获得一个数据集的差异2000收集探测激光与调查和2000年激光阻塞为了消除背景辐射和潜在的基线漂移。

观察到的瞬变是配备一个biexponential函数: 为了描述的动力学TZ2-TG放松和溶剂的冷却。恰当的细节已报告之前(17,27]。

3所示。结果与讨论

像TZ2-NG, TZ2-TG采用β表二级结构主要由Trp-Trp交互(稳定13]。然而,TZ2-TG不太稳定,有明显样本的328 K条件下用于不要急于研究相比345 K (8)或352 K (25TZ2-NG],根据条件,正如我们之前的报道。修改的角色把序列从Asn-Gly Thr-Gly的动态行为变得明显不要急于实验。

的放松TZ2-TG肽样本探测两种不同波长和放松的时刻τ_{奥林匹克广播服务公司}测定温度跳跃后一系列的肽的温度。1641厘米⁻¹职位主要感官cross-strand交互和1663厘米⁻¹无序结构。四个代表瞬变-323 K图所示2。这些数据的动态图片肽仅因为他们已经纠正了贡献的D₂O放松。表1总结了随温度而变的放松时间τ_{奥林匹克广播服务公司}TZ2-TG测量。

TZ2-TG降低肽弛豫时间的增加温度正常符合阿伦尼乌斯的行为和相似的数据我们发现在其他几个(strand-centered)变异TZ2-NG [17,27)和螺旋肽(31日]。不像TZ2-NG及其同位素变异,放松利率的β结构(cross-strand H-bonding)和无序结构TZ2-TG没有显示一个明确的分化。

当温度变化时,利率(弛豫时间)不同类似的方式检测在1663厘米⁻¹和1641厘米⁻¹。由于信号强度的限制,1641厘米⁻¹在较低温度下的数据不允许可靠的瞬态分析,因此是不报道。

高等可比两三个温度点(超过300 K),瞬变的松弛时间监控在1641厘米⁻¹(相关β链展开),1663厘米⁻¹(监控无序分数)在错误是等价的,并可以得出这样的结论:两个过程有相同的利率。这样的高温行为TZ2-NG之前也见过,但只有325 K以上。自从TZ2-TG动摇,被其低,温度区域等效利率似乎也转向更低的温度。

总的来说,观察到放松的时候TZ2-TG TZ2-NG相比更慢(17,27),虽然把多肽二级结构突变造成[25]。虽然很难得出结论关于阿伦尼乌斯行为从几个高温数据点,放松利率获得的斜坡时探测两个波数实际上是相似的,显示激活能量TZ2-NG看到的2 - 3倍,这是符合我们观察的速度慢。在较低温度中,1663厘米⁻¹数据确实表明偏离这一趋势和可能之间的分化β链和无序动力学,但确认这取决于我们重新测量与改进的S / N动力学。

这个速度变化的意义从TZ2-NG TZ2-TG必须躺在角色的Asn。急转弯的蛋白质通常涉及Asn发夹结构。Asn-Gly本身并不足以使成核,但结合链之间的疏水作用,如TZ2-NG,很稳定。TG的丧失稳定的变化将意味着减少折叠平衡常数。如果我们假设这是一个近似两过程在高温和假设影响展开速率常数可以忽略不计,,然后折叠,,将会减少TZ2-TG TZ2-NG相比。对于简单的单分子的弛豫动力学, 在哪里是观察到的弛豫率和平衡常数。在这种情况下,减少将导致减少,也就是我们所看到的实验。然而,在不同的条件下,如果机制变得更加复杂,而不是两个国家,这样一个简单的分析将无效。

在低温范围内,我们可以清楚地得出结论,先前研究TZ2-NG变异表现出多态行为(17,27TZ2-TG],我们不能获得足够的数据来得出类似的结论。然而,我们也希望找到一个放松的分化时间的损失β链和无序的结构。TZ2-NG之间的直接比较低温的时间常数和TZ2-TG可能提供一个更好的理解的总体动态较慢,发夹的热稳定性是不稳定的。

4所示。结论

在目前的研究中,我们报告的构象变化β发夹肽TZ2-TG及其打开残留稳定性的影响。虽然TG-turn残留产生不稳定的影响比NG-turn,如热力学转变温度降低,构象动力学是出乎意料地慢。我们属性,修改多态折叠机制的改变造成的。

缩写

红外光谱:	傅里叶变换红外
吴:	Asparagine-Glycine
组织:	三氟乙酸
TG:	Threonine-Glycine
TZ:	色氨酸拉链

确认

这个工作从美国国家科学基金会的资助(t . a . Keiderling che07 - 18543)和德意志Forschungsgemeinschaft豪泽(HA-5142/2-1 k)和部分研究奖亚历山大•冯•洪堡Stiftung (t . a . Keiderling)。

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