BRAF（V600E）突变和恶性黑色素瘤在尼日利亚拉各斯P16的免疫组化分析：10年的回顾性研究

抽象

背景. 与白人相比，黑人恶性黑色素瘤（MM）的发病率和死亡率更高。BRAF V600E突变的MMs和p16蛋白表达缺失的MMs与侵袭行为和预后不良相关。目标. 我们检测了尼日利亚拉各斯地区MM患者BRAF（V600E）突变状态和p16表达缺失，并与组织病理学参数和患者年龄相关。方法。2005年1月和2014年12月在拉各斯大学教学医院的解剖和分子病理学部之间的接收进行免疫组化研究，以确定BRAF V600E突变和p16蛋白的表达45例MM的。这些措施包括皮肤（ñ= 37)、musosal (ñ=3)， MM (ñ= 2）以及淋巴结metastatases（ñ= 3)。结果。在5/45（11％）中检测到BRAF（V600E）突变而的情况下31/45（69％）有p16蛋白表达的丧失。没有统计学显著相关性的BRAF（V600E）突变，p16蛋白表达的丧失，和组织学参数，如组织学变型中，Clark分级，Breslow厚度，和溃疡之间找到。结论。BRAF (V600E)突变仅在一小部分病例中检测到，p16表达缺失的病例最多，同时伴有高Clark水平、高Breslow厚度和溃疡。

1.简介

恶性黑色素瘤（MM）是最致命的所有皮肤恶性肿瘤，占皮肤癌相关的死亡的79％[1个]。它是在白种人发病率，其最常见的癌症之一，以惊人的速度一直在增加2个,三]。在澳大利亚，它被称为国家癌症因为该国在全球拥有MM的发病率最高，它占全国癌症负担约10％[4个]。

先前的研究表明，MM是尼日利亚第二常见的皮肤癌，在一些系列的组织学诊断皮肤癌中，其比例高达37.4%[5个–八]。大多数患者目前晚期疾病：一项研究的病例69％是克拉克水平的V，以作为发生在足部的病例多达95％[6个]。

尽管它具有侵袭性，但如果及早发现，MM仍然是高度可治愈的。当疾病在局部阶段被发现时，五年存活率约为90%，超过98% [9个]。生存是随肿瘤大小（>2厘米）恶化，增加浸润深度（Clark分级> II和Breslow厚度> 2毫米），溃疡，和远处转移的存在。转移性疾病，5年存活率仅为15％，且中位生存期<1年。在演示文稿，黑色素瘤的约10％已转移[9个,10个]。

尽管由于较高的皮肤黑色素浓度的保护作用，黑皮肤的黑色素瘤发病率比白种人低得多，但由于诊断延迟导致的疾病进展阶段意味着更高的发病率和死亡率[11个,德意志北方银行]。在南非进行的一项研究显示，临床表现的阶段是第一阶段:32%，第二阶段:52%，第三阶段:14%，第四阶段:2%。在58%的病例中，肿瘤大小至少在一个维度上大于40mm, 43%的患者在发病后一年内死亡[13个]。一世ñanother study in Tanzania, Clark’s level I and II diseases were not seen and Clark’s levels III, IV, and V accounted for 27.9%, 17%, and 26.9% of cases, respectively, while Clark’s staging was not performed in the remaining cases [14个]。

在黑色素瘤中，一些分子的变化导致了癌症的发生，这一发现使得靶向治疗的发展成为可能，从而提高晚期疾病的存活率。这些包括激活BRAF基因的突变和p16蛋白表达的缺失[15个,16个]。

位于7q34号染色体上的BRAF基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRAF，属于生长信号转导非受体蛋白激酶家族[17岁]. 癌基因BRAF激活导致RAS/RAF/MAPK信号通路下游靶点的结构激酶活性和磷酸化。在7%的其他人类癌症中，如结直肠癌、黑色素瘤、甲状腺乳头状癌和一些淋巴瘤中发现了功能增强突变[18岁]。

黑色素瘤中BRAF基因突变的检测，BRAF（V600E）蛋白抑制剂的开发，以及用BRAF抑制剂治疗的一些晚期和转移性疾病患者令人印象深刻的临床反应，对黑色素瘤的诊断和治疗产生了重大影响[16个]。

该基因CDKN2A位于9p21的并且编码三种不同的蛋白质;p16蛋白也被称为INK4A，P15 / INK4B，和P14 / ARF（替代阅读框）（细胞周期蛋白依赖性激酶4的抑制剂）。所述p16蛋白是负责控制G / S细胞周期转换。它防止了视网膜细胞瘤蛋白（PRB）的磷酸化通过结合CDK4和CDK6抑制的CDK4 / 6 /细胞周期蛋白复合物d，负责磷酸化所述PRB [形成19个]。

p16（蛋白和mRNA表达）的降低与家族性和散发性黑色素瘤的临床进展有关[20个]。在黑色素瘤中p16的损失已与增加的肿瘤厚度和克拉克的水平，增加的增殖率/较高有丝分裂计数，和疾病复发的风险相关联，并且已被证明是降低存活的独立预后指标[21岁]。

然而，在尼日利亚人群中还没有研究确定BRAF V600E突变状态和p16在黑色素瘤中的表达。

2。材料和方法

从档案中检索2005年1月至2014年12月在拉各斯拉各斯大学教学医院解剖与分子病理科10年内发现的45例经组织学诊断的MM的石蜡包埋组织块和苏木精伊红染色切片。

年龄、医院编号、实验室编号和临床细节等相关信息从部门癌症登记处和患者文件夹中提取。

组织块的新鲜切片是在原始载玻片未被发现或损坏的情况下进行的。

根据2006年WHO标准，皮肤MM病例被分为组织学变异[22个]. 克拉克水平，布雷斯洛厚度和溃疡状态也被确定。

分别用VE1（生物科学）和抗CDKN2A/（载体）单克隆抗体进行免疫组化（IHC）研究，以确定突变BRAF V600E和p16蛋白的表达。

染色BRAF（V600E）突变的抗体VE1被评分为阳性时多数活肿瘤细胞的呈棕黄色细胞质染色。当没有细胞质染色或只分离出核染色，单个散在细胞的弱染色，或单核细胞/巨噬细胞的染色染色评分为阴性。阳性对照是已知的BRAF突变状态黑素瘤，而阴性对照是正常角质形成细胞。

对于p16蛋白表达染色的评价为阳性的肿瘤细胞的百分比和细分成分数：分数1 /负，在肿瘤细胞中的所有<30％不存在红核染色显示红核染色;2分/阳性，肿瘤细胞的≥30％，表明红核染色。阳性对照是宫颈癌组织，同时正常角质形成细胞被用作阴性对照。

数据分析使用SPSS version 20 (IBM SPSS Statistics for Windows, version 20.0 Armonk, NY: IBM Corp .)。采用Chi²分析确定突变型BRAF V600E表达/ p16蛋白表达缺失与患者年龄、组织学变异、Clark水平/分期、Breslow厚度和溃疡之间的关系。设alpha为5%，p值小于0.05为差异有统计学意义(表2)1个)。

3.结果

原发性黑色素瘤42例，其中皮肤黑色素瘤37例，粘膜黑色素瘤3例，眼黑色素瘤2例。淋巴结转移3例。

年龄范围为24至85岁，中位数年龄为50岁。

男女比例为1：1.5。

皮肤MM主要位于足部(68%，n=25/37)。少数位于腿部(8%，n=3/37)、躯干(8%，n=3/37)、上肢(5%，n=2/37)、臀(5%，n=2/37)、颈部(3%，n=1/37)和阴囊(3%，n=1/37)。

组织学上，皮肤MM为结节性MM 81%，30/37，肢端皮孔性MM 16%，6/37，结缔组织增生性MM 3%，1/37。

的皮肤MM病例百分之八十八（33/37）为克拉克的第四阶段和皮肤MM病例五，84％（31/37）有Breslow厚度≥4mm。溃疡是存在于67％（37分之25）的情况。

在5/45（11％），其包括4皮肤MM和1淋巴结转移（图中检测BRAF（V600E）突变1个)。

在27例皮肤MM，2例粘膜MM和2例淋巴结转移酶组成的病例中，69%（31/45）检测到p16表达缺失（图2个)。

4。讨论

在这项研究中，相当一部分（86%）的病例是克拉克的IV和V级，与Mohammed等人在Jos报告的88%相似。[八]本研究中没有克拉克一级和二级病例。来自尼日利亚、非洲和非裔美国人的其他地区的文献也显示了类似的发现[14个]。一个可能的属性可能迟到的介绍，因为大多数这些肿瘤的发生对脚，恕不另行通知，直到后来发生溃疡。这类患者会一直管理慢性足溃疡在黑色素瘤的诊断最终前的一段时间。这强调了在识别黑色素瘤的其他早期来预防这些发现增加了患者和医生教育的必要性。

此外，与白种人的现有研究相比，绝大多数84%(36/43)的病例存在Breslow厚度≥4mm的情况，白种人的病变通常要薄得多[2个]. 晚期黑色素瘤患者的临床表现意味着该病的临床进展和淋巴结转移的侵袭性。在喀麦隆的一系列病例中，32%的晚期病人在发病后12个月内死亡[德意志北方银行]。

在仅11％的情况下，MM在这个系列中检测BRAF（V600E）突变。这远远低于白种人，在这种突变的发生率大于40％的报道18岁,23个]。虽然这可能表明,大部分的MM在当下研究野生型,这些发现可能也反映了这样的事实:BRAF突变怀有的一些病例可能在小的如BRAF (V600K), BRAF (V600R), BRAF (V600 E2),和BRAF (V600D) [24个]。同样值得注意的是，BRAF突变的高比例的白种人实际上出现较早且病变较薄。这表明，晚期表现实际上是一个重要的因素，使黑素瘤在黑人中更具侵略性，几乎是死刑。

无论如何，BRAF激酶抑制剂是有效治疗只有极少数的我们的病人。

在本研究中，p16蛋白表达缺失的病例占大多数(69%)。这与Parvey等人在白种人中的研究结果类似，52%的病例显示p16表达缺失[25个]. Straume和他的同事也报道了45%和77%的原发性和转移性黑色素瘤病例没有核染色[26个]。这表明，CDKN2A基因可能在大多数导致P16 / INK4A表达的损失我们的情况下可以发生突变。这或许可以解释被记录在这项研究中，并且在白种人进行的研究已经证明增加肿瘤厚度和克拉克的水平[26个]。

结节性黑色素瘤是黑色黑色素瘤中最常见的类型，通常发生在下肢[22个]。我们的研究与本次提交与我们的皮肤MM案件是结节性黑素瘤81％同意组织学和皮肤MM病例的75％发生在下肢（腿和脚）。

结节性黑色素瘤患者中p16表达缺失的比例（88%）高于肢端扁豆状黑色素瘤患者（50%）(第页= 0.064）。与此相比，通过Parvey等的研究。谁报告结节性黑素瘤有比浅表扩散对应显著较低水平表达p16的[25个]。

在本研究中，克拉克的阶段IV和V的情况下的比例较高有p16蛋白表达的丧失。这也符合Parvey等人的研究结果一致。谁发现，P16染色的损失与较厚的病变相关。这支持的概念，即p16基因的损失是在零星的原发黑素瘤的进展的后期事件及其与更积极的肿瘤协会[25个]。

五，结论

在路德的大多数MM病例中P16表达缺失；这些病例也有高Clark分期，Breslow厚度增加，并出现溃疡。BRAF（V600E）突变仅在少数MM病例中检测到。绝大多数，超过80%的病例出现在晚期，这使得通过增加和持续的患者和医生教育来认识黑色素瘤早期症状成为干预的关键点。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据由尼日利亚拉各斯大学教学医院解剖与分子病理学系提供。应向Omobolade Obadofin博士提出访问这些数据的请求，boladeoshaks@gmail.com。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

我们会喜欢欣赏联盟国际癌症控制（UICC），用于通过国际癌症研究技术转移奖学金（ICRET）这项研究赞助。摘要本手稿是在美国和加拿大学院病理年会（USCAP）在2017年提出的。

工具书类

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