文摘
由于稀有默克尔细胞癌(MCC)、前瞻性临床试验没有实用。本研究旨在确定生物标志物与预后的意义。在六十二名患者确定治疗MCC在我们的机构,只有17个病人有足够的formalin-fixed石蜡包埋档案被包括在研究组织和跟踪。患者分层为好,温和,或预后不良。激光捕获显微解剖分离肿瘤细胞用于随后的RNA分离和基因表达分析Affymetrix GeneChip人类外显子1.0位数组。在191个基因中展示重要的预后组之间的差异表达,角质20和神经丝蛋白之前被确认在MCC的研究和显著调节肿瘤患者预后不良。免疫组织化学进一步证实20角蛋白过表达在肿瘤预后不良。此外,小说感兴趣的基因,如磷脂酶A2组X,驱动蛋白家族成员3,肿瘤蛋白质D52,粘蛋白1,工具包在标本调节患者预后较差。我们的试验研究确定了几个基因表达差异,可用于未来MCC患者预后的生物标志物。
1。介绍
默克尔细胞癌(MCC)在1972年首次描述的可能性,这是最初认为是源自汗腺(1]。1978年,猴颗粒被发现在这些肿瘤与神经内分泌细胞一致,特别是默克尔细胞(2]。MCC最近关注不仅由于其与新发现的默克尔多瘤病毒但也由于其发病率的增加(3]。事实上,与年龄相关的发病率从1986年到2001年的世纪挑战集团几乎翻了三倍(3]。风险因素包括高龄、紫外线照射和慢性免疫抑制。MCC通常位于头部和颈部,常常伴随着其他皮肤原发性肿瘤,符合紫外线曝光。
MCC的预后很差。与遥远的疾病患者有两年存活率仅为32%4]。只有50%的患者有局部疾病(阶段1)诊断的时间。阶段主要是根据肿瘤大小和程度的疾病诊断的时候(5]。患者诊断为疾病和肿瘤大小< 2厘米没有节点参与十年死亡率29至39% (6]。这是四倍多的黑色素瘤患者的死亡率与相同的疾病诊断阶段(7]。目前,预后最好由最初诊断疾病的程度。
由于稀有MCC,前瞻性临床试验已经证明是不可行的(8]。最近,一些研究主要集中在生物标志物分析以识别预后因素(9- - - - - -11]。在这项研究中,我们进行了全球患者肿瘤标本的基因表达分析好,贫穷,和温和的结果来确定新基因和通路可能确定新的预后标记或新的治疗目标。
2。材料和方法
2.1。病人和标本
我们审问博蒙特医院肿瘤登记为所有病人治疗MCC在过去10年;62名患者。患者排除那些没有肿瘤切除或组织诊断在我们机构由于缺乏标本。患者也排除后续不足或如果他们的标本未能通过基因表达研究质量控制措施。检索所有组织蜡块标本解剖病理学的验证和识别疾病由一个dermatopathologist (RM)。经过验证的组织,MCC患者分为三组基于状态之一诊断后24个月。预后不良的病人提供或远处转移的进展。病人被认为有一个温和的预后如果他们面对当地疾病复发或节点疾病的报告,但是没有在不到24个月的后续进展。患者的预后有当地疾病没有节点疾病表现和进展跟踪期间至少24个月(12]。17 MCC病人满意所有入选标准(6预后不良,3温和的预后,8病人预后良好)。
2.2。激光捕获显微解剖(LCM)
LCM, 5μm删去了部分formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)组织和安装到聚乙烯细丝网膜玻璃幻灯片每张幻灯片(两部分)。deparaffinization之前,幻灯片放在烤箱在60°C 25分钟然后染色并通过一系列分级脱水乙醇和二甲苯的步骤。在3小时的切片,pathologist-identified肿瘤地区microdissected紫外和红外激光,在适当的地方使用分子显微解剖系统(设备)到CapSure HS LCM帽(分子设备)。4帽使用分级区域解剖的1 - 4部分代表大约5000肿瘤细胞(1 - 2毫米2区)捕获/帽。
2.3。RNA隔离
模块组织总RNA是孤立于使用PureLink FFPE RNA隔离设备(表达载体)。附加的转移膜切割材料分开CapSure HS LCM帽,放置在deparaffinization融化缓冲区在72°C 10分钟,然后处理蛋白酶K 60°C 45分钟。制造商的协议后,使用旋转筒技术纯化总RNA, DNase处理,量化(Nanodrop 8000,热科学),并存储在−80°C。RNA完整性决定前处理表达芯片分析。RNA完整性数据范围从2.0到2.4,由生物分析仪分析(安捷伦)。
2.4。全转录组(WT)放大,净化、碎片和杂交
总RNA是放大和标签使用WT-Ovation FFPE系统V2, WT-Ovation外显子模块,和安可生物素模块(NuGEN公司圣卡洛斯、钙、美国),这使得放大和目标从FFPE制备低质量RNA, LCM样本。放大后与100 ng总RNA进行输入程序中描述WT-Ovation FFPE系统用户指南。目标准备Affymetrix人类外显子1.0位数组(美国Affymetrix,圣克拉拉,CA)都使用5μg放大cDNA和安可生物素模块后,制造商的建议。杂交、清洗和染色(GeneChip流体站450,Affymetrix)和扫描(GeneChip扫描仪3000)进行以下制造商的协议。阵列扫描从这个过程产生的信号强度与阵列准备从高质量的RNA细胞系(数据没有显示)。这个方法也被独立近日报道提供最佳的核糖核酸杂交(13]。
2.5。基因表达分析
玻璃纸文件包含的原始强度数据Affymetrix GeneChip数组被导入到Partek基因组学套件(6.6 beta版本,构建6.11.1115)和规范化使用健壮的多片平均guanine-cytosine内容背景校正、分位数正常化,log2-transformation,中位数波兰probeset总结。基因外显子被总结使用probesets的平均值。差异表达基因被确定使用方差分析有两个因素:预后和扫描日期(随机变量)。无人监督的层次聚类进行了使用Partek软件(Partek Inc .,圣路易斯,密苏里州,美国)。层次聚类分析进行了使用欧氏距离作为相似性度量和平均链接烧结的方法。基因集富集分析(GSEA)和途径进行了分析使用途径Studio 9.0(阿里阿德涅基因组学,罗克维尔市,医学博士,美国)。本出版物中讨论数据已经存入NCBI的基因表达综合14),可通过地理系列加入GSE36150数量。
2.6。免疫组织化学
组织部分从相应的FFPE组织块被放置在幻灯片,接受高pH值抗原检索,并随后被孵化的以下主要抗体:鼠标单克隆反角蛋白20 (prediluted, Dako IS777),小鼠单克隆反粘蛋白1(1:100年,徕卡,NCL-HGM-45 mL),和兔多克隆反工具包(1:250年,Dako A4502),兔多克隆反KIF3A(1: 1200年,σK3513)。幻灯片被连接和可视化使用Flex Dako设想系统Dako Autostainer。免疫组织化学染色强度得分是基于4-tier系统(0 =缺席,1 =弱,2 =中间,和3 =强烈)。解决interobserver可变性,得分是由2独立调查人员,平均分数。费舍尔的确切概率进行了测试比较好,预后不良组(15]。
3所示。结果
3.1。识别和隔离默克尔细胞样本
病人的人口统计和病变特点概述在表1。在这个小群体的病人,几乎是偶数的男性和女性(53%和47%),和53%的17个病人(9)病变位于四肢。虽然绝大多数(59%,10的17)患者的II期,75%(3,4)的患者诊断为III期肿瘤预后不良。
激光捕获显微解剖被用来分离和去除尽可能纯净的人口的肿瘤细胞由dermatopathologist基于形态学鉴定。图1显示了一个典型的病变从49岁女性第二阶段在下肢病变;这种病变是患者预后不良,需要手术,挽救化疗。病变显示结节状排列的细胞在真皮与稀疏细胞质制服,单调的中型核(数字1(一)和1 (b))。肿瘤的组织学成分清楚显示激光捕获显微解剖方法的重要性在这项研究中由于皮肤及附属器的结构的存在。数据1 (c)和1 (d)显示所选领域概述解剖之前和之后的激光捕获显微解剖。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。在MCC基因表达变化与预后有关
17 MCC的样本进行了分析使用人类外显子1.0从Affymetrix数组。两个数组(一个预后良好,预后不良)数组没有通过质量控制指标。比较患者的不良预后()与那些有良好的预后(),191被发现差异表达基因(截止1.5倍,表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/596459)。这包括127个基因的过表达在肿瘤预后不良underexpressed病人和64个基因。NEFM(神经丝、中多肽),PLA2G10(磷脂酶A2组X)KRT20超过三倍(20角蛋白)是一种调节肿瘤预后差。体内CYP2A6基因表现(细胞色素P450,家庭2亚科,多肽6),MCART1(线粒体载体三重复1),和KRTAP19-5(角蛋白相关蛋白19-5)下调至少2.8倍预后不良样品。
191个差异表达基因中,有45个基因的一个子集,满足严格的条件。MCC的层次聚类样本进行基于这些45个差异表达基因。集群基于这些基因的表达强劲划定良好和不良预后之间的病人(图2(一个))。包含3样本的温和的预后导致患者2例集群与预后不良的病人,与病人预后良好(图12 (b))。与注释(美国癌症联合委员会)阶段,这些数字表明,集群基于预后相关基因表达是独立的阶段。
(一)
(b)
3.3。子网分析
为了更好地理解生物MCC基因表达差异的背景好,预后不良的病人,表情微阵列数据分析使用阿里阿德涅通路工作室的子网富集分析工具(16,17]。通路工作室利用MedScan,文献挖掘程序搜索PubMed等公开可用的文学实体之间的关系(18]。子网由单个种子(即。,disease or cell process) and genes associated to this seed by regulation of/by the seed [19]。表情微阵列数据集是审问没有意义滤波之前,和浓缩的子网是由网络的监管水平和网络的大小。一种类型的网络由与调节疾病相关的基因;子网的“种子”,是一种疾病或疾病状态。有趣的是,顶部子网识别与调控肿瘤转移相关的基因(图3)。可视化的子网仅限于只包括那些在方差分析差异表达的基因截止1.5倍。更严格的条件之前已经被证明是更适合通路分析(20.,21]。
然后利用子网富集分析发现细胞过程高度管制良好的肿瘤基因表达差异和不良预后患者(表2)。十四的前20个类别相关的增长,包括再生,有丝分裂,侵入性增长,细胞的能动性。另外,两类(神经突和神经发生,产物图3)显示的连接神经内分泌MCC的性质。
3.4。免疫组织化学
几个差异表达基因进一步探讨在蛋白质水平。免疫组织化学是用来检查MUC1蛋白产品,装备,KIF3A和KRT20(表3)。虽然大多数的所有MCC样本(17 88%,15)阳性KRT20,预后不良样品(图4(一)染色)显示强于病人预后良好(图4 (b))。使用费舍尔的精确概率检验比较缺席/弱染色中间/强烈的染色,这个结果显著重要的试点研究。这同意超表达的基因水平分析。KIF3A蛋白质检测的患者样本(图1的6预后不良4 (c)),但没有明显的蛋白质样品的中度或预后良好病人(图4 (d))。MUC1蛋白无法在几乎所有的样品除了低水平的染色样品从一个病人预后良好。蛋白质水平的装备没有证实基因表达的结果。尽管有83%的预后良好(5 6)和75%的不良预后(6 8)工具包阳性样品,没有基于预测模式来染色的程度。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
默克尔细胞癌的诊断是很困难的。目前的治疗包括手术切除广泛切除边界。几乎所有患者接受放疗后广泛的手术切除,而积极的淋巴结或转移性疾病患者诊断时可能的候选化疗。标准的化疗协议尚未建立了MCC的治疗。由于形态学和免疫组织化学相似性MCC的小细胞肺癌(SCLC),化疗已经完成在SCLC与代理协议主要基于活跃。讨论了各种化疗药物,包括抑制细胞生长的药物如环磷酰胺、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、依托泊苷、顺铂、卡铂、5 -氟尿嘧啶、达卡巴嗪,米托蒽醌,博来霉素和iphosphamide。不幸的是,报告日期由只有小型研究和轶事证据(22- - - - - -24]。需要摆脱MCC的主要经验临床管理,找到方法来理解和采取有针对性的治疗。
这项研究的最终目标是发现标记可以识别不良预后患者在诊断时;这些病人可能受益于增加或改变手术后的治疗。为了发现这些新的生物标志物,表情微阵列技术是利用病人检查全球基因表达差异,证明了一个已知的预后(预后良好或预后不良)基于状态切除后24个月。分析导致一组191个基因被确定为差异表达。层次聚类的患者样本基础上的表达这些基因(图的一个子集2(一个))展示了他们在辨别两个预测之间的效用。而不能得出明确的结论,由于有限的数字在这个试点研究,也许更有趣的是添加温和的患者预后的结果聚类(图2 (b))。良好和不良预后患者保持隔离成两个集群主要集群而温和的病人与病人预后良好和两个病人预后不良。集群的病人预后良好的患者是一个71岁的女性为主要位于乳房。集群的患者样本与不良预后患者样本来自一个84岁的男性与主位于手臂和一个81岁的男性与主在嘴唇上。温和的预后患者组与预后不良组代表了更多的“典型”MCC病人:男性,年龄的增长,和引起的主要区域。集群的温和的病人预后良好病人主要在非典型位置和女性。一般来说,女性MCC病人已被证明有更好的预后比男性患者(6]。长期跟踪这三个病人可以帮助确定这些预测的准确性好或预后不良组基于这些45差异表达基因的表达。
进一步使用子网浓缩特性表达式的微阵列数据分析显示,与肿瘤转移相关基因表达和神经突之间的结果是高度管制的患者样本和糟糕的预测。肿瘤转移相关基因KRT20,肿瘤蛋白质D52 (TPD52),MUC1,工具包调节不良预后的肿瘤,而同源框B1 (HOXB1)是表达下调。TPD52,调节肿瘤的预后不良患者近2倍,已被证明是在结直肠癌(25)和卵巢癌(26),和基因扩增TPD52出现在前列腺癌(27和乳腺癌28]。工具包也是调节不良预后的标本。工具包是一个跨膜受体对肥大细胞生长因子,也称为干细胞因子。与MCC细胞系的研究显示,激活工具包通过旁分泌或自分泌肿瘤细胞衍生自洽场MCC在体外的刺激增长29日]。在一项研究中观察KIT表达在MCC肿瘤,Andea等人显示戏剧性的生存患者基于设备之间的差异蛋白表达高水平的设备导致[5年存活率降低30.]。HOXB1表达下调的不良预后MCC,是一个高度保守的转录因子,在形态发生中起着重要的作用,已被证明是胰腺癌的转移潜力(31日]。
基因与神经突包括基因的产物NEFM和PLA2G10。这两个基因调节多不良预后的肿瘤患者的3.5倍。NEFM编码一个IV型中间丝状体中链和常用的生物标志物神经元损伤。在一项研究中,神经内分泌细胞系表达NEFM虽然nonneuroendocrine细胞株没有(32]。随着KRT20, NEFM被证明是有效的在小细胞肺癌歧视MCC从大多数MCC积极NEFM和KRT20 NEFM和小细胞肺癌KRT20几乎完全缺席(33]。
除了这些基因外,还有其他基因与癌症有关的利益和发展或进展包括dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 (DDAH1(3),驱动蛋白家族成员KIF3A),MUC1所有调节预后不良的样品。编码的酶,DDAH1参与methylarginines一氧化氮生成通过监管。一氧化氮代谢与致癌作用,肿瘤进展,血管生成,和对治疗的反应34];特别是,过度的DDAH1导致增加肿瘤生长和血管化模型的神经胶质瘤肿瘤发生[35]。KIF3A活动与刺猬信号,调节在MCC (36]。KIF3A纤毛的发展需要存在于大多数细胞和在开发过程中涉及信号转导刺猬(37]。MUC1蛋白表达在顶端表面粘膜表面的上皮细胞不同的组织。在一项由Kurzen et al ., MUC1表达被发现在默克尔细胞和MCC的82%和66%的转移(38]。
当检查这些差异表达基因的蛋白质产物几个通过免疫组织化学,蛋白质和基因表达的结果是在协议只有1的4个基因。KRT20证明增加mRNA和蛋白表达的肿瘤患者预后不良。KRT20中间丝蛋白负责上皮细胞的结构完整性。微阵列表达分析显示3.0倍超表达在肿瘤预后不良,免疫组织化学结果证实蛋白质水平的增加。在早期的研究中,88 - 100%的MCC呈阳性KRT20 [33,39]。特别是KRT20是用来标记区分MCC从肺小细胞癌(33,40]。Micrometastatic焦点在前哨淋巴结活检彩色强烈KRT20 [41]。蛋白质含量与KRT20的积极成果,KIF3A和MUC1没有显示积极的协会与基因表达的结果。尽管表达基因表达微阵列的证据表明健壮在预测组,KIF3A和MUC1蛋白都只有1样本中检测到。同样,KIT蛋白水平没有对应预后集团尽管67% (10 15)MCC样本染色阳性。然而,这的确验证之前的一项研究发现,65%的MCC工具包是积极的(42]。虽然有有限的基因和蛋白质表达数据之间的协议,在文献中有大量的证据表明有显著的调节蛋白mRNA转录后水平,因此允许不同的结果当比较基因表达和蛋白表达(43]。
这项研究的结果进一步发展最近出版的基因表达分析的危害等。44]。当我们比较MCC患者基于预后,他们比较在MCC积极或消极的默克尔细胞多瘤病毒,鳞状细胞癌(SCC),和正常皮肤。有趣的是,结果比较MCC和鳞状细胞癌和正常皮肤导致类似的研究结果。短笛(PCLO),KRT20,工具包调节在MCC鳞状细胞癌相比,就像这三个基因调节不良预后患者样本相比,患者预后良好样本。此外,功能类之间的发现改变了MCC和鳞状细胞癌包括类别如神经系统发育、神经发展,神经元投影形态发生类似发现在桌子上2。在MCC的比较正常的皮肤,NEFM被发现在MCC高度调节,而我们的研究结果表明,NEFM调节超过4倍的不良预后患者样本。
5。结论
近年来,生物特征识别的研究都取得了长足进步,默克尔细胞癌;然而,MCC代表了一个相当大的挑战由于其相对罕见。虽然多个研究已经确定了一些生物标记物,这些生物标记物的预后价值尚未确定。本研究首先使用LCM-captured MCC细胞来研究特定基因表达的变化与肿瘤的预后有关。这里介绍的几个基因表达变化在MCC进一步暗示的作用。基因表达的KRT20,工具包,MUC1,NEFM在MCC早些时候的研究中已被确认。此外,一些新的潜在生物标记物被确定。基因如TPD52,HOXB1,KIF3A与其他癌症和MCC-associated信号连接。此外,KRT20证明病人预后不良样品中蛋白质含量升高。这个补充的危害等人结果显示高KRT20蛋白质与鳞状细胞癌相比,MCC。从这些结果,我们得出这样的结论:基因等工具包,HOXB1,KIF3A可以提供宝贵的见解MCC的生物学和新颖的治疗方法可能发现的可能性仍然持续的理解这些生物标志物。此外,蛋白表达水平的KRT20将在评估MCC的预后的重要性。鉴于这个试点研究的样本数量有限,我们的目标是通过与其他机构的合作扩大这项研究。正在进行的研究,包括数据较长的病人后续进一步分析和评估的影响多瘤病毒在这些患者中,有必要为了阐明这些新的生物标记的最终潜力。
利益冲突
作者没有利益冲突。
确认
作者要感谢美国为他们的帮助与肿瘤病理解剖病理学。这项工作是由博蒙特研究所支持。
补充材料
表S1:列出的191个基因差异表达与患者预后良好与不良预后(p≤0.05和1.5倍截止)。基因选择后续蛋白免疫组织化学的分析指出。