文摘

我们之前已经证明Rad6和β连环蛋白增强彼此的表达通过正反馈循环促进乳腺癌发展/进步。而β连环蛋白与黑色素瘤的发病机理,Rad6函数没有被调查。在这里,我们审查Rad6和之间的关系β连环蛋白在黑色素瘤的发展和进步。八十八皮肤肿瘤,30痣,原发性黑色素瘤,29日和29日转移性黑色素瘤与反应用β连环蛋白和anti-Rad6抗体。强烈的表达Rad6观察相比,只有27%的痣是100%的小学和96%的转移性黑素瘤。β连环蛋白强烈表示,97%的小学和93%的转移性黑色素瘤与Rad6不同,在93%的痣。所有的肿瘤表达了核β连环蛋白。β连环蛋白是细胞膜上的完全本地化的55%,转移性黑色素瘤的62%,只有10%的痣。胞质β连环蛋白中检测出90%的痣,主的17%,和8%的转移性黑色素瘤,而28%的小学和30%的转移性黑色素瘤展出β连环蛋白在两个位置。这些数据表明,黑色素瘤的发展和发展与Rad6 upregulation和膜的重新分配β连环蛋白,β在黑素瘤发展连环蛋白和Rad6发挥独立作用。

1。介绍

Wnt /β连环蛋白通路已经涉及到的开发和进展黑色素瘤和各种各样的癌症类型,包括结直肠癌、乳腺癌、食管癌癌和肝癌1- - - - - -3]。在正常情况下,细胞内β连环蛋白水平保持低通过multiprotein系统介导β连环蛋白降解[4]。增加某些Wnt配体的表达和绑定卷曲的受体或突变的特定组件β连环蛋白降解组装禁用这种监管机制。因此,β连环蛋白在细胞质中积累并且把原子核。核β连环蛋白刺激转录大量TCF /β连环蛋白反应基因,包括细胞周期蛋白D1、原癌基因(5,6),melanocyte-specific基因,microphthalmia-associated转录因子MITF-M [7]。因此,核的积累β连环蛋白,观察几种癌症类型被认为是一个规范化的标志Wnt /β连环蛋白途径放松管制和不利预后[3,8]。

先前的研究已经报道核之间的关联β连环蛋白积累和黑色素瘤进展和建议核β连环蛋白是预后不良的指标(1,7]。然而,最近的研究表明,乳腺癌和结肠癌相反,转移性黑色素瘤的发展是与减少核和胞质有关β连环蛋白表达(9,10]。此外,临床、遗传和组织学研究表明,核和细胞质β连环蛋白可以用作生物标记黑色素瘤预后良好的(11- - - - - -14]。

HHR6最近,人类同系物的酵母Rad6基因和DNA修复途径postreplication的主成分,已被确定为一个重要的监管机构规范Wnt /β连环蛋白信号(15,16]。以下称为Rad6 HHR6,稳定β连环蛋白polyubiquitin修改渲染β连环蛋白抗26 s蛋白酶体降解[16]。此外,Rad6转录的目标β连环蛋白(17),从而揭示之间的正反馈循环β-catenin-mediated Rad6基因表达的激活和Rad6-inducedβ连环蛋白稳定。

Rad6表达式是低在正常乳腺组织中;然而,增加Rad6检测到蛋白表达在增生性,导管癌原位(DCIS)和乳腺浸润性癌(15]。之前我们已经演示了一个角色Rad6在乳腺癌进展通过其对规范化Wnt /监管的影响β连环蛋白通路(18]。因为减少/核的损失β连环蛋白(9,10),而不是增加乳腺癌,与黑素瘤进展,目前尚不清楚Rad6和β连环蛋白协同工作,促进黑素瘤发病机制。此外,Rad6表达在皮肤上没有调查,也没有数据的角色Rad6发病机制的良性(痣)和恶性黑色素瘤melanocytic病变。为解决这个问题是很重要的知识,因为未满足的医疗需要新的antimelanoma疗法和因为Rad6和有效β连环蛋白已经被确认为治疗靶点19,20.]。

在这项研究中,我们研究了Rad6和β连环蛋白表达在串行部分的痣,主,在黑色素瘤转移性黑色素瘤,以确定潜在的角色发展和转移性进展。我们的数据表明,膜的搬迁β连环蛋白和Rad6 upregulation独立标记黑色素瘤的发展和进步。我们还提供了一个假说来解释膜的作用β连环蛋白搬迁和减少细胞质β连环蛋白在黑色素瘤的发展,这一现象,不利预后有关(9,21,22]。

2。材料和方法

2.1。病人和标本

例从文件检索的Pinkus皮肤病理学实验室(PDL),一个私人皮肤病理学实验室位于门罗,MI。保存石蜡包埋组织标本收集针对每种情况都被分配一个加入代码排除病人标识符信息。痣和初级黑色素瘤病例选择研究使用随机数生成的随机数生成器(占据/ MP 13.1)。30例的学习小组由melanocytic痣,29例原发性皮肤黑色素瘤,29例转移性皮肤的黑色素瘤。melanocytic痣和黑色素瘤亚型在表列出1。这项研究包括所有转移性皮肤黑色素瘤样本存档在2010年和2012年之间。病例数为每个痣和黑色素瘤亚型主要是决心反映病变的相对表现在上述期间PDL情况下获得的。非典型痣被克拉克和病变诊断使用标准最初提议架构所审查的罗斯et al。23]。本研究得到韦恩州立大学人类调查委员会的批准。

2.2。抗体

主要抗体用于研究如下:(i)反β连环蛋白(IS702)从Dako购买(斯特鲁普、丹麦)和使用未稀释的形式;和(2)anti-Rad6 (ab31917)从Abcam购买(Cambridge, MA)和使用1:500稀释。在人类中,酵母同源Rad6基因复制和由两个基因编码的蛋白质HHR6A(或Rad6A)和HHR6B (Rad6B)染色体Xq24-q25和5 q23-q31,分别分享95%相同的氨基酸残基24]。无论是ab31917自己Rad6抗体(15),和其他商用anti-Rad6抗体是目前能够区分Rad6A和Rad6B蛋白质。因此,而不是指Rad6A或Rad6B,我们把Rad6蛋白质检测到抗体。

2.3。免疫组织化学染色

如前所述(执行免疫组织化学25]。短暂,five-micrometer部分deparaffinized二甲苯和患者分级乙醇。为抗原检索,部分微波在柠檬酸缓冲pH值6.0(美国BioGenex,圣拉蒙,CA) 12分钟在95°C和疣状之前冷却30分钟。部分用3%的过氧化氢孵化15分钟,其次是孵化主要抗体60分钟。一个自动化的应用(i6000;BioGenex)是用于后续孵化步骤:部分在多链路孵化生物素化的anti-IgG 20分钟,辣根过氧化物酶共轭二次抗体为20分钟,其次是发展与3-amino-9-ethyl-carbazole 10分钟(BioGenex)。部分被苏木精复染色。孵化的步骤都是在室温下进行,部分之间用Tris-buffered盐水洗净孵化项目。

2.4。控制

肺癌和结肠癌组织包括积极控制与反疣状β连环蛋白抗体,和乳腺癌组织包括积极控制与anti-Rad6抗体染色。组织部分没有孵化主要抗体作为消极的控制。

2.5。细胞枚举

彩色部分是由两个独立的枚举(d·r·麦赫尔干节和m . Campbell)合著者,他们对病人医疗记录针对每种情况也不清楚。蒙蔽枚举在400 x光显微镜下进行放大,和一个目镜网格组成的一个简单的100平方晶格的测试点是利用计算数量的积极的和消极的彩色黑色素瘤或痣细胞为每个部分。每节中,积极的和消极的总数染色细胞数的三个连续的水平。三个字段的值被用来估计的相对密度细胞标本。提高评估的准确性,所有积极的和消极的彩色黑色素瘤或痣细胞在一个视野是单独计算而不是被分级为范围的百分比。综述了枚举数据独立,每一个评估者。当独立阅读积极染色细胞20%对于一个给定的不同部分,两个评价者回顾了部分一起阅读建立共识。标本被认为是负面的,如果不到4%的细胞为Rad6或应用β连环蛋白。肿瘤被认为是沾染了高强度如果> 50%的细胞标本Rad6或表达β连环蛋白,类似于Mineta等所使用的标准。26]。

2.6。统计分析

克鲁斯卡尔-沃利斯测试被用于比较组的基础上连续变量如年龄和阳性细胞百分比。卡方测试的不同比例的基础上被用来比较组分类变量,如性别和β连环蛋白本地化。斯皮尔曼等级相关是用来评估成对年龄和Rad6积极和百分比之间的联系β连环蛋白阳性细胞。多项式回归是用来评估与诊断集团同时Rad6协会和年龄。调整为多个比较使用Wilcoxon等级和测试与Bonferroni调整成对比较。

3所示。结果

我们的分析包括30个人被诊断为痣,29原发性黑色素瘤,并与转移性黑色素瘤(表291)。这些团体略对不同性别(在年龄(显著),)。个人之间显著的年龄差异观察痣和那些原发性黑色素瘤()或转移性黑色素瘤()。相比之下,个人之间没有年龄的区别是观察原发性和转移性黑色素瘤()。之间的显著差异的年龄也观察到组织所定义的β连环蛋白定位()。的人β连环蛋白定位在细胞质中明显小于个人β连环蛋白定位在细胞膜(),略小于个人β连环蛋白定位在细胞质和细胞膜()。当年龄是归类为< 50岁,50 - 60,> 60年,有在统计上有显著差异的Rad6表达式之间的组(),虽然有实质性的变化(表2)。Rad6大于中位数大于60岁的一群人相比,50 - 60岁组()和< 50岁组()。20%,两者之间差异的积极染色细胞观察评价者在不到5%的情况下,这些病例评价阅读一起建立共识。

3.1。β连环蛋白免疫染色

黑色素瘤相关的开发和进展不明显标本的百分比表达的变化β连环蛋白。β连环蛋白染色观察在97%的痣和所有小学和转移性黑素瘤。而且,痣的百分比(93%)、原发性黑色素瘤(97%)、转移性黑色素瘤(93%)表示β连环蛋白在50%以上的细胞(数据之间没有显著性差异1,2,3)。然而,百分比之间的显著差异观察痣(59%)、原发性黑色素瘤(90%),和转移性黑色素瘤(56%)表示β连环蛋白在90%以上的细胞(;图2)。这些差异都很大程度上影响原发性黑色素瘤的比例(48%)表示β连环蛋白在细胞的100%,大约是两倍高于痣的百分比(21%)或转移性黑色素瘤(26%)(数据未显示)。

3.2。细胞内定位β连环蛋白

没有一个痣和黑色素瘤的表达β连环蛋白在细胞核(图1)。肿瘤的百分比表示膜β从痣连环蛋白显著增加(10%)主要和转移性黑色素瘤(83%和93%,分别地;;图4)。与此同时增加,胞质表达的肿瘤的比例β连环蛋白从痣下降(90%)主要和转移性黑色素瘤(45%和38%,分别地;;图4)。相比之下,没有观察到显著差异百分比原发性和转移性黑色素瘤之间的表达β连环蛋白在膜(83%和93%,分别地;)或细胞质(45%和38%,分别地;;图4)。在所有四个痣类型(交界、皮内注射、复合、非典型)表达β连环蛋白在细胞质中,只有交界和非典型痣表达β连环蛋白在质膜。而不是痣类型,三种类型的原发性黑色素瘤检查(表面扩散、结节和雀斑maligna)没有差别β连环蛋白定位在β连环蛋白定位在质膜,在细胞质中,或在两个(图4)。

3.3。Rad6疣状

大多数痣(63%)没有表达Rad6。相反,所有原发性黑色素瘤(100%)和转移性黑色素瘤的大部分(96%)表现出大于50% Rad6表达式。肿瘤人群的增加表达Rad6从痣的37%到100%的小学和转移性黑色素瘤是重要的(;数据1,2,3)。黑色素瘤进展从初级到转移性疾病与变化无关(i)比例的黑色素瘤表达Rad6(小学和转移性黑色素瘤的100%),或(ii)黑色素瘤的比例在50%以上的肿瘤细胞表达Rad6(小学和转移性黑色素瘤的100%和96%,分别地)。肿瘤的比例的增加人口,50%以上的细胞中表达Rad6原发性黑色素瘤(67%)和转移性黑色素瘤(79%)不显著(;图2)。这项研究并不是用来测试是否分布的肿瘤细胞阳性Rad6痣亚型之间的相同。然而,百分比之间的良性肿瘤,缺乏Rad6相似的非典型痣(62%)和其他三种痣的组(59%)。

3.4。Rad6作为区分痣与黑色素瘤的公认的生物标志物

有趣的是,只有一个30痣(非典型痣,3%)表示Rad6 > 80%的细胞,和所有的小学和转移性黑色素瘤表示Rad6 < 40%的细胞(图2)。这些结果促使我们检查是否Rad6表达式可以作为标记黑色素瘤的组织学诊断。使用多个逻辑回归模型,我们发现的力量Rad6表达式是黑色素瘤的重要因素()即使年龄组()、性别(包括在模型中。每增加1%的模型预测Rad6表达式结果的概率增加9%黑色素瘤病变。如果我们假设预测> 0.5的概率表明黑色素瘤,这个模型只有Rad6敏感性为93%,特异性为80%。这些结果非常鼓舞人心;然而,他们需要在一个更大的研究进行验证。

3.5。之间的相关性β连环蛋白和Rad6

的表达谱β连环蛋白和Rad6痣显著不同。大约有93%的痣表达β连环蛋白在50%以上的细胞,而只有27%的人口的痣表示Rad6(图2)。β在痣连环蛋白和Rad6表情没有显著相关(;)。有2.7倍的原发性黑色素瘤(100%)的比例差异表达Rad6痣相比(37%),几乎没有差异β连环蛋白表达主要与转移性黑色素瘤(100%)。因此,Rad6和β连环蛋白表达在初级黑色素瘤(没有联系,)。Rad6和之间的显著相关性β连环蛋白阳性细胞在转移性黑色素瘤(,)。然而,这种关联减弱(,)排除后两个观测不成比例地影响(一个积极Rad6 < 50%,一个积极的< 50%β连环蛋白)。

4所示。讨论

这是第一个研究描述Rad6表达在皮肤的良性和恶性melanocytic肿瘤。在这项研究中,我们调查了Rad6和之间的联系β连环蛋白表达在melanocytic良、恶性肿瘤,以确定Rad6在配合工作β连环蛋白影响黑色素瘤的发展和进步。Rad6和β连环蛋白积极调节彼此在乳腺癌(15,18]。然而,尽管β连环蛋白与黑色素瘤的发病机制和其他癌症类型,数据Rad6癌症发病机制的作用大多局限于乳腺癌。大约有30%的黑色素瘤在既存的良性发展melanocytic肿瘤(痣)[27]。因此,我们假设Rad6和比较β连环蛋白表达在相同的痣和黑色素瘤肿瘤将有助于确定这两个信号合作促进黑色素瘤的发展和进步在乳腺癌(15,28]。

4.1。样本的百分比表示β连环蛋白同样高痣和黑色素瘤和不支持的核心作用β黑色素瘤连环蛋白水平起始和进展

积累的核和细胞质β连环蛋白已经涉及到驱动的开发和发展多种癌症类型(例如,结肠癌和卵巢癌)[29日- - - - - -31日]。然而,我们的结果表明,该表达的水平β连环蛋白发生和发展不会导致黑色素瘤因为没有区别β连环蛋白水平被发现之间的痣,主黑色素瘤和转移性黑色素瘤(93% -97%的样品表示β连环蛋白在肿瘤细胞> 50%)。的高表达水平β连环蛋白的至关重要的作用β连环蛋白在正常的黑色素细胞的分化和增殖和转移性黑色素瘤细胞(32]。此外,我们的研究结果是积极的与之前的报道相一致β连环蛋白染色的痣(100%)和原发性黑色素瘤(95%、94%),但高于报告转移性黑色素瘤(75%,68%)9,21]。表达的变化β连环蛋白水平转移性黑色素瘤研究之间的差异可以归因于转移组织的类型。虽然我们只研究了皮肤黑色素瘤转移,其他研究也获得了58%的标本淋巴结、扁桃体、肝脏或不确定的解剖部位转移(9,21]。此外,不同解剖站点可以调节不同的抗原表达在转移源自相同的主要肿瘤患者(33,34]。

4.2。核β连环蛋白是缺席所有痣和黑色素瘤,表明低实用性在黑色素瘤预后标记

先前的研究显示更高比例的核β痣的连环蛋白比黑素瘤(84%和33%,44%和15%)(9,22]。这些观察目前的基础概念,提供核和细胞质的损失β连环蛋白建议不良预后,降低黑色素瘤患者的总生存期12,22]。根据这些数据,没有核β连环蛋白在所有的痣和黑色素瘤分析在我们的研究是令人惊讶的。使用不同的反β连环蛋白抗体可以解释部分核的差异β连环蛋白表达之间的观察研究。然而,我们的研究结果是一致的缺乏核β连环蛋白在四个研究报告由57个痣,超过55原发性黑色素瘤,20转移性黑色素瘤21,35- - - - - -37]。此外,核β连环蛋白不存在痣部分或15的黑色素瘤部分皮肤病变和没有额外的42个原发性黑色素瘤(38]。70年另一项研究原发性黑色素瘤,核β连环蛋白在只有6.4%的黑色素瘤(39]。最后,在230年的一项研究主要和转移性黑色素瘤,核β连环蛋白在只有13例(5.6%),因此这种情况下被排除在分析(21]。综上所述,核的缺席或微不足道β连环蛋白在上述研究发现以及我们的建议可能的核外的角色β连环蛋白在痣和黑色素瘤。这个概念是由细胞质的角色β连环蛋白执行函数,不需要核易位(例如,激活MAP激酶p38和NF-kB) (37,40]。

4.3。痣,黑色素瘤进展与细胞质膜易位β连环蛋白

本研究的主要发现黑色素瘤之间的关系发展和细胞内的重新分配β连环蛋白。情况下的百分比表示β连环蛋白在细胞膜上急剧增加从痣的10%在小学和转移性黑色素瘤的83%和93%,分别。同时,胞质表达的情况下β连环蛋白在痣从90%下降到45%和39%在初选和转移性黑色素瘤,分别(图4)。我们假设的搬迁β连环蛋白从细胞质到细胞膜可能作为一种机制规范Wnt /才会安静下来β连环蛋白信号,产生的胞质减少β连环蛋白水平可能导致的恶性转变melanocytic痣。提出的假说是由以下的观察:(i)在我们的研究中,巴赫曼等人也报道之间的关联痣黑色素瘤的发展和转移β连环蛋白细胞膜(22]。然而,这项研究的作者没有提供一个解释的观测;(2)我们的数据分析Kagashita等人β连环蛋白减少细胞质和细胞膜,增加这些变化β连环蛋白分布与恶性转变的痣9];(3)Wnt4信号已被确认为一种机制,可以开车β连环蛋白搬迁从细胞质、细胞膜(41];和(四)β连环蛋白搬迁从细胞质、细胞膜被阻止β连环蛋白信号在人类胚胎肾(HEK293)细胞株41]。值得注意的是,这一假说可以解释为什么尽管丰富β连环蛋白表达在黑色素瘤(1,7),胞质β连环蛋白选择性地降低,这种现象与不利的黑色素瘤预后有关(9,21,22]。我们现在的努力是指向确定增加膜β连环蛋白中观察到小学和转移性黑色素瘤由于细胞质中的迁移现有的分子或新生成的沉积β连环蛋白在膜性网站。

4.4。Rad6在黑色素瘤的发展和发展中所起的作用,但不是痣形成

Rad6以来一直参与乳腺癌早期发育的增加Rad6水平观察到腺病和良性增生与正常组织相比15]。相比之下,我们的发现并不支持Rad6扮演相同角色在痣形成良性乳腺肿瘤,因为63%的痣是对Rad6不利。Rad6也被卷入乳腺癌进展因为Rad6水平增加性导管癌的进展原位入侵主要癌和转移性癌症15,28]。依照upregulation Rad6在乳腺癌的早期发展与良性增生(15,17),我们观察到显著增加Rad6表达式原发性黑色素瘤相比,痣。尽管所有原发性黑色素瘤显示强劲Rad6染色(> 50%的肿瘤细胞),Rad6是负63%的痣。这些发现表明,Rad6可能发挥作用在乳腺癌恶性转化的痣。发展主要的黑色素瘤转移性疾病没有明显与进一步的改变在肿瘤的比例表达Rad6或Rad表达强度> 50%的肿瘤细胞染色积极在100%和96%的原发性黑色素瘤和转移性黑色素瘤,分别。这些发现表明,Rad6可能持续作用在黑色素瘤转移与黑色素瘤的发展。

4.5。之间的相关性β连环蛋白和Rad6

在良性和恶性乳腺肿瘤,Rad6稳定β反过来,连环蛋白,β积极连环蛋白上调Rad6转录(15- - - - - -17]。然而,这之间的直接正相关β连环蛋白和Rad6表达似乎没有保存在黑色素瘤的表达谱β连环蛋白和Rad6痣显著不同。大约有93%的痣表达β连环蛋白相比,只有27%的痣,表示Rad6 50%以上的细胞(图2)。这些观察表明,高β连环蛋白表达Rad6以外的痣可能由监管机构。乍一看,似乎β连环蛋白和Rad6表达式相关原发性黑色素瘤,因为这些蛋白质coexpressed大约所有原发性黑色素瘤。此外,这些发现Rad6之间的相关性和对应于80%β连环蛋白表达在原发性乳腺癌17]。然而,不太可能的高Rad6表达式是由原发性黑色素瘤并发高β连环蛋白表达,因为低表达Rad6痣尽管高细胞质的存在β连环蛋白表达与原发性黑色素瘤。也证实了这种观点缺乏Rad6和之间的统计相关性β连环蛋白表达在原发性黑色素瘤。βRad6连环蛋白并不是唯一的活化剂;例如,Rad6神经生长因子被激活的神经组织(42]。因此,可想而知,在原发性黑色素瘤,Rad6表达式是由身份不明的活化剂。我们还表明,进一步的进展主要的黑色素瘤转移性疾病之间没有关联的关联β连环蛋白和Rad6表达式。综上所述,我们的研究不支持直接积极的互动β连环蛋白和Rad6良性或恶性melanocytic肿瘤。

5。结论

我们第一次特征Rad6表达皮melanocytic良、恶性肿瘤。我们展示的一个显著upregulation Rad6从负面表达在大多数良性melanocytic肿瘤主要和转移性黑色素瘤的100%。这些发现强烈建议的角色Rad6在原发性黑色素瘤和转移性疾病的发展。我们表明,Rad6相比,β连环蛋白表达在超过50%的肿瘤细胞中几乎所有的痣和黑色素瘤肿瘤。综上所述,Rad6相反β在乳腺癌[连环蛋白积极关系15- - - - - -17),我们的研究不支持类似的积极互动β连环蛋白和Rad6良性或恶性melanocytic肿瘤。最后,我们发现一个角色为细胞质膜易位β连环蛋白在原发性黑色素瘤的发展。未来的研究将确定是否新生成的β连环蛋白膜现场配合β连环蛋白从细胞质易位。

缩写

HHR6:	人类酵母Rad6的同系物
DCIS:	性导管癌原位
PDL:	Pinkus皮肤病理学实验室。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的启动资金从韦恩州立大学国立卫生研究院的资助(R21CA178117-01)。生物统计学的核心支持,部分由国家卫生研究院中心授予相关P30的CA022453韦恩州立大学癌症研究所。