文摘

小分子核糖核酸被卷入各种皮肤癌,包括黑色素瘤、鳞状细胞癌,基底细胞癌;然而,microrna的表达和他们的角色在默克尔细胞癌(MCC)还有待深入探讨。确定小分子核糖核酸特定MCC (MCC-miRs),下一代测序(门店)的小RNA在不同的组织样本库进行包括监控化学品,其他皮肤肿瘤和正常皮肤。比较的资料确定了MCC的几种小分子核糖核酸调节和表达下调。为验证,他们的表达是通过测量中存在一大群MCC和对照组non-MCC皮肤肿瘤和正常皮肤。八小分子核糖核酸在MCC调节:mir - 502 - 3 - p, miR-9, miR-7, mir - 340, mir - 182, mir - 190 b, mir - 873和mir - 183。三个microrna表达下调:mir - 3170, mir - 125 b, mir - 374 c。许多这些MCC-miRs miR-183/182/96a特别是顺反子,连接致瘤的途径与MCC发病机理。原位杂交证实MCC-miR表达的高度,mir - 182,是局部肿瘤细胞内。此外,门店和存在显示,其中的几个MCC-miRs高度patient-derived MCC细胞系中表达,MS-1。这些数据表明,我们已经识别出一组MCC-miRs MCC研究有着重要的意义。

1。介绍

默克尔细胞癌(MCC)是一种皮肤原发性神经内分泌癌不确定的来源。虽然不像其他流行的皮肤癌,MCC是咄咄逼人,死亡率高,整体五年存活率百分之六十(1]。中,没有患者的生存区域淋巴结的参与表示是13岁和40个月,分别为(2,高达百分之五十的患者最终发展系统性疾病转移到肝脏,骨骼和大脑(3]。

不幸的是,虽然MCC的发病率增加,我们对这些肿瘤的认识仍然有限。有几个因素参与其发病机理,包括紫外线辐射,一个相关的多瘤病毒(MCPyV)和免疫抑制4,5),但缺乏有效的治疗方法可供MCC反映了我们有限的知识。为了扩大我们的理解,我们关注小分子核糖核酸,小单链RNA分子参与的负调节基因表达。

平均长度约为22个核苷酸,这些分子作为指导RNA-induced沉默的复杂(RISC)。小分子核糖核酸调节基因的表达通过绑定部分互补的目标网站在mRNA转录和抑制他们的翻译6]。近年来已积累了丰富的数据暗示小分子核糖核酸基因表达的重要调节器,通过他们独特的转录后的调控作用,它们可以作为肿瘤的生长和转移的重要监管机构。

小分子核糖核酸的研究前景很大程度上改善癌症的诊断和治疗。最近的进展我们理解小分子核糖核酸的作用在肿瘤疾病兴奋。一个有效的抗病毒治疗是最近开发的基于微rna生物,和小分子核糖核酸是有前途的新工具和目标在癌症研究7]。

事实上,小分子核糖核酸已经证明其他皮肤癌的发病机制中扮演重要的角色,如鳞状细胞癌(SCC)和黑色素瘤(6]。他们也被牵连在基底细胞癌(BCC),甚至可能是受雇于准确识别癌症亚型,证明对于黑色素瘤和皮肤t细胞淋巴瘤(CTCL) [6]。然而,尽管文学的体积在皮肤癌的小分子核糖核酸,这些分子的作用还知之甚少在MCC玩。因此,我们着手缩小知识差距和定义MCC生物学所涉及的小分子核糖核酸。

2。方法

2.1。样品

各种皮肤癌的冰冻组织标本(MCC,黑色素瘤、鳞状细胞癌和BCC),正常的皮肤,从合作获得正常的淋巴结是人体组织网络(CHTN)和存储在−80°C。Formalin-fixed石蜡包埋组织样本(FFPE)各种皮肤癌(MCC,黑色素瘤、鳞状细胞癌和BCC)和正常的皮肤得到范德比尔特病理学和皮肤病理学(TN纳什维尔)。临床信息对应FFPE MCC(表提供样品1)。

2.2。细胞系

所有的细胞系和10% FCS和Pen-Strep在DMEM培养。

2.3。RNA隔离

总RNA,包括小分子核糖核酸,隔绝冰冻组织和细胞培养miRNeasy迷你工具和从FFPE组织miRNeasy FFPE工具包(试剂盒;希尔登,德国),根据制造商的协议。提取的总RNA浓度和完整性的估计量子位2.0荧光计(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和安捷伦2100生物分析仪(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA),分别。RNA的RNA样品完整号码(RIN)至少7.0或更高的价值被用于进一步的处理。

2.4。小RNA (microrna)图书馆准备和测序

大约1μ克总RNA从每个样本被带到小RNA图书馆协议使用NEBNext小核糖核酸库预备组准备Illumina公司(新英格兰生物学实验室Inc .,伊普斯维奇,妈,美国)根据制造商的协议。短暂的3′适配器被结扎总输入RNA其次是杂交的多路复用SR RT引物和结扎多路5′SR适配器。逆转录(RT)是通过使用上标三世RT(美国纽约生活技术,大岛屿)为1小时50°C。RT后立即反应,PCR扩增了15周期使用LongAmp Taq 2 x大师混合。Illumina公司索引引物被添加到唯一条形码每个样本。Post-PCR材料使用QIAquick纯化PCR净化设备(试剂盒Inc .)、瓦伦西亚、钙、美国)。Post-PCR产量和准备图书馆评估使用量子位2.0浓度荧光计1000芯片和DNA安捷伦2100生物分析仪。小RNA的大小选择140个基点的目标尺寸范围是由6%的页面上运行样品凝胶1小时在120 V。准确的量化排序应用程序都使用了qPCR-based KAPA生物系统库量化工具。每个库的最终浓度稀释12.5 nM和汇集在聚类之前克分子数相等的比率。 Cluster generation was carried out on a cBot v1.4.36.0 using Illumina’s Truseq Single Read (SR) Cluster Kit v3.0. Single End (SE) sequencing was performed to generate at least 15 million reads per sample on an Illumina HiSeq2000, running HiSeq Control Software (HCS) v1.5.15.1, using a 50-cycle TruSeq SBS HS v3 reagent kit. The clustered flowcells were sequenced for 56 cycles, consisting of a 50-cycle read, followed by a 6-cycle index read. Image analysis and base calling was performed using the standard Illumina Pipeline consisting of Real time Analysis (RTA) version v1.13 and demultiplexed using bcl2fastq converter with default settings.

2.5。处理小RNA-Seq读取

至少1500万年,50个基点,SE读取来自每个样本。下游的分析从每个样本进行测序读按我们独特的内部管道。简单、质量控制检查原始序列数据使用FastQC从每个样本将被执行(Babraham生物信息学、伦敦、英国)。生读商业数据分析平台上被进口CLCbio(美国马CLCbio)。适配器修边做了删除的结扎适配器的3′末端测序读只有一个允许不匹配;不一致的3′末端也削减了。序列短于15个核苷酸长度被排除在进一步分析。修剪读取被用于提取和计算小RNA然后注释与小分子核糖核酸miRBase释放18数据库。样本分组按类型标识符和量化的microrna的丰度。microrna的微分表达式计算的基础上他们的褶皱变化(默认截止≥±2.0)之间的映射计数观察各个组之间。

2.6。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)

验证捷数据,microrna的表达是通过定量分析实时逆转录聚合酶链反应(存在)Rotor-Gene SYBR绿色PCR工具包,miScript底漆化验,miScript通用底漆,后的总RNA逆转录miScript II RT工具包(试剂盒;希尔登,德国)。

技术复制的存在分析根据制造商的指示使用Rotor-Gene SYBR绿色PCR反应混合液(试剂盒;希尔登,德国)。包装操作软件是用于仪器控制、数据采集和原始数据分析。盘子是运行在相对量化(一式三份测量)模式。

放大曲线分析了使用打包操作软件,请检查和化验的熔化曲线。此外,只有化验检测被包含在数据分析。计算目标小分子核糖核酸的相对表达水平算法方法是利用。mir - 423 - 3 - p和mir - 423 - 5 - p是稳定表达的所有样本,因此他们的平均值在每个样本作为归一化因子。化验正常校准相同的皮肤样本。

2.7。原位杂交(ISH)

原位发现mir - 182进行了使用AccuRISH OrioR实验室的服务,LLC(马里兰州罗克维尔市)。RNAse-free组织切片环境是由治疗切片机、刀片、水浴,冰桶,钳,并与RNaseZap滑托盘,紧随其后的是RNAse-free水。每个5 -μm组织切片脱蜡、水化和demasked,和蛋白酶治疗优化为每个组织块GAPDH探针和不同浓度的蛋白酶k .治疗后肿瘤和正常组织部分是使用一个反mir - 182彩色并排寡核苷酸探针相同浓度相同的杂交和严格的清洗温度则高达55 -°C。最终颜色开发每一批的所有部分一起终止后九十分钟。所有图片都被使用一个奥林巴斯DP70数码相机使用相同的设置。

3所示。结果

3.1。基于高通量测序数据微分MicroRNA的表达

测序的小RNA为以下冷冻组织样本库进行:三个监控化学品,一个黑素瘤,鳞状细胞癌,一个* *,一个正常的皮肤。MCC和黑色素瘤淋巴结转移,而鳞状细胞癌和BCC主要皮肤病变。排序的比较资料确定的几种小分子核糖核酸调节和世纪挑战集团与其他组织(表中表达下调2)。

3.2。确认MCC-miRs通过中存在

验证下一代测序(上天)数据,几个小分子核糖核酸进行评估通过在大群FFPE组织样本中存在。MCC队列由原发性皮肤病变和转移(表1)。肿瘤组织由黑色素瘤的主要皮肤病变,鳞状细胞癌和BCC(图1)。存在结果证实upregulation MCC(≥2倍)的八个小分子核糖核酸:mir - 502 - 3 - p, miR-9, miR-7, mir - 340, mir - 182, mir - 190 b, mir - 873和mir - 183。此外,三个小分子核糖核酸是表达下调(≥2倍)在MCC: mir - 3170, mir - 125 b, mir - 374 c。数据还发现了轻微upregulation(≥1.5倍)mir - 96 a, miR-183/96/182集群的另一成员。

评估这些小分子核糖核酸是否特定的肿瘤标志物MCC,每个8 MCC-miRs的表达是通过评估中存在几个冷冻MCC淋巴结转移和比作人体组织面板组成的十二个不同器官(图2)。三个MCC-miRs证明高表达(≥2倍)MCC队列和所有其他器官:mir - 183, mir - 182, mir - 190 b。

3.3。MCC-miRs高度MCC细胞系中表达,MS-1

评估潜在的未来功能的研究,这些研究结果挥动小RNA的图书馆为病人进行派生MCPyV-positive细胞系,MS-1(表2)。几个相同的MCC-miRs组织样本中发现调节还演示了在MS-1高绝对表达式的值。因此,每个MCC-miRs的表达是通过评估中存在MS-1和比较各种non-MCC细胞系(图3)。以下MCC-miRs被证实在MS-1升高(≥2倍)和一组十六non-MCC细胞系:mir - 183, mir - 182, mir - 340,和mir - 190 b——有趣的是,同样的小分子核糖核酸是调节在MCC和组织面板。总之,这些数据表明,我们已经识别出一套高质量的MCC-miRs。

四种microrna的表达也是评估通过MCPyV-negative细胞系中存在,MCC13,但不同的结果(图3)。MS-1相比,四个小分子核糖核酸,mir - 183, mir - 182, mir - 340, miR190b证明MCC13低表达水平。这些小分子核糖核酸的水平,而不是与其他细胞系。解释这种差异提供了讨论。

3.4。原位杂交(ISH)证实了mir - 182在MCC细胞表达

支持这些小分子核糖核酸的概念在实际中发挥作用肿瘤细胞周围组织的代替,伊什进行的越高表示MCC-miRs, mir - 182, MCC的脸颊的样本和正常皮肤(图的一个示例4)。正如所料,mir - 182是本地化MCC细胞,,如预期中存在的数据,表达在周围组织和正常皮肤相比很低,在MCC细胞。

4所示。讨论

世纪挑战集团仍然是最不理解癌症的皮肤。小分子核糖核酸是一个相对年轻的生物医学研究领域,2000年出生与let-7检测的人类,与潜在的应用程序在其他疾病(6,7]。我们相信这将适用在MCC,我们已经确定了八个调节和三个表达下调小分子核糖核酸。这些MCC-miRs意义几个世纪挑战集团的未来研究。

4.1。MCC-miRs癌症:mir - 182 - 183 - 96

虽然这些MCC-miRs MCC中高度表达,其中一些已经证明其他癌症的发病机制中扮演重要的角色。特别是miR-183/96/182集群,在染色体位点7问,表达多样性的癌症和可能导致他们的发病机理,针对细胞周期的多个组件,DNA损伤反应,和同源重组途径,丰富通路与转移相关,移民和epithelial-mesenchymal过渡(8]。我们关于这个集群,在文献回顾重要的发现。

对于皮肤癌,mir - 183集群是经常在黑色素瘤。我们的工作证实了这种观察,因为mir - 182和mir - 183是调节黑色素瘤与鳞状细胞癌,BCC和正常皮肤(尽管仍然不像在MCC)高度表达。在黑素瘤,mir - 182促进生存的过度表达,迁移,通过直接抑制肿瘤和转移抑制FOXO3 microphthalmia-associated转录factor-M;和mir - 182的表达增加与发展主要转移性黑色素瘤(9]。mir - 182之间的这种相关性水平和侵略性很有趣,当注意到MCC,一般来说,被广泛认为是一个攻击性水平与黑色素瘤的肿瘤。人们很容易接受的观念,一个共同的途径也许存在于两个,更大的说,世纪挑战集团通路失调可能占其转移率高,发病率和死亡率。Downregulation福克斯转录因子是一种常见的主题的集群,作为抑制FOXO1 miR-183/96/182已经证明了在经典霍奇金淋巴瘤(10),在子宫内膜癌,导致减少G1细胞周期阻滞和细胞死亡11]。畸变的福克斯转录因子尚未评估在MCC和可能是一个值得探索的大道,考虑这个新信息。

各noncutaneous癌miR-183/96/182集群服务的基本功能,与许多研究关注它在乳腺癌中的作用,特别是入侵和转移。例如,在乳腺导管癌原位mir - 182和mir - 183已经证明目标CBX7,监管者钙粘蛋白的表达(12]。mir - 182,激活β连环蛋白,也目标基质金属蛋白酶抑制剂有关系,导致增加MMP-9活动(13),以及MIM通常抑制转移RHOA的抑制。这些通路的失调股票增加肿瘤能动性和集落形成的共同结果,事实上,mir - 182的超表达在乳腺癌细胞异种移植导致肺殖民增加了肿瘤细胞(14]。

4.2。miR-183/96/182: MCC的潜在目标基因相关

的分子途径改变MCC发病机理尚未完全的特点,但一个文献回顾显示,一些著名的肿瘤发生的连接通路。例如,多个研究小组发现mTOR / PI3K / AKT通路被激活,独立于MCPyV-status,大多数人类的监控化学品,确定这是一个潜在的新治疗目标(15,16]。有趣的是,miR-183/96/182集群已经证明加强mTOR / PI3K / AKT信号,促进成神经管细胞瘤的细胞迁移,与大多数的这种效应归因于mir - 182。击倒的完整的集群成神经管细胞瘤细胞失调的结果mTOR / PI3K / AKT信号轴和增强细胞凋亡相关的基因17];因此,集群miR-183/96/182再次出现作为一个有吸引力的目标MCC的潜在的治疗应用。

作为额外的注意,数据也表明,PTEN的失活可能在MCC发病机制中发挥作用;然而,突变和PTEN基因的纯合缺失筛查肿瘤样本显示无意义突变纯合子缺失,只有一小部分的病人(18]。这表明,替代机制可能存在导致PTEN的抑制。miR-183/96/182集群可以提供一个解释这个谜题,因为mir - 183已经证明目标肿瘤抑制基因,EGR1,并参与mir - 183 - EGR1 pten网络促进肿瘤发生和细胞迁移在滑膜肉瘤,横纹肌肉瘤,结肠癌19]。

4.3。诊断标记:mir - 190 - b, mir - 182和mir - 183

此外,这些MCC-miRs,当结合使用,在MCC的诊断可能会有用。误诊是高与癌症相关的问题;但是,与BCC,它常常会混淆20.- - - - - -22],延误诊断可能会被证明是致命的。细胞角蛋白(CK) 20展示了其实用性的免疫组织化学(包含IHC)这种癌症的诊断;然而,有报道称CK20−/ CK7 + MCC的变体23,24];因此,另一个肿瘤标记可能援助病理学家。我们已经证明,通过伊什,mir - 182的确是局部肿瘤细胞(图4)。

最近,Renwick等人证明了多色微鱼可以利用有效区分MCC和BCC FFPE组织。研究人员采用mir - 205和mir - 375,这被证明是肿瘤特异性BCC和MCC,分别为(25]。类似的方法可以应用与其他小分子核糖核酸MCC中高度表达,例如mir - 182和其他识别MCC-miRs这项工作,为了增加特异性的诊断测试。尽管mir - 375不确定在我们的研究中,我们发现MCC-miRs使用更大群MCC样品和有更大的多功能性诊断标记,因为他们以更大范围的肿瘤细胞系,正常组织。因此,他们将补充mir - 375在多色微鱼化验。

此外,我们的研究结果从组织面板证明MCC-miRs也可以有可能作为肿瘤转移(图的标记2)。自基线的这些小分子核糖核酸是相对较低的水平靶器官如肝脏,骨骼,和大脑,在其他网站的转移性参与,他们有可能作为MCC标记细胞在这些组织传播。

采用微签名作为诊断工具已成功进行其他皮肤癌。2011年,Ralfkiaer等人开发了一个qRT-PCR-based分类器组成的三个小分子核糖核酸具备区分CTCL的其他皮肤病理与精度高(26]。另外一个例子,Poliseno等人开发了一个microRNA签名,区分表面和黑色素瘤结节性传播27]。这些例子表明,microRNA分类器可以作为简单的疾病标记。也许这个概念可能实际应用在MCC的上下文中。

4.4。功能研究:MS-1

最后,我们证明了其中的几个MCC-miRs高度patient-derived MCC细胞系中表达,MS-1。相同的结果并不证明MCPyV-negative细胞系,MCC13;然而,我们不是第一次经历这样的结果。在前面提到的研究中,Renwick et al .,通过比较微聚类样本资料,发现MCPyV-positive细胞系(MS-1、MKL-1 MKL-2)聚集在中冶集团虽然MCPyV-negative细胞系(MCC13、MCC26 UISO)集群non-MCC组(25]。他们的发现,除了我们,支持了这样的观点,即内在miRNome差异之间存在两个细胞系。

这就提出了一个问题:细胞系,MS-1或MCC13,拥有更多的MCC的有效性作为一个代理在活的有机体内。为了解决这个问题,我们将最近的工作Guastafierro et al。28),这是内在的细胞,免疫组织化学,详细和病毒学MS-1和MCC13之间的差异。形态学、MS-1和其他MCPyV-positive细胞系(MKL-1 MKL-2)成长为漂浮在悬浮聚合,虽然MCC13和其他MCPyV-negative细胞系(UISO MCC26)成长为附着层的文化。免疫组织化学,传统MCC-markers MS-1是正数,CK20和synaptophysin CK7和消极,但相比之下,MCC13正好相反:阴性CK20和CK7 synaptophysin和积极的。例病毒学,MS-1港口综合病毒在其基因组序列,因此表达抗原与MCPyV-infection和肿瘤发生相关(例如,大T抗原),虽然MCC13确实没有。考虑到这些差异,Guastafierro等人提出的合法问题是否MCPyV-negative细胞系(MCC13, UISO MCC26,马蒂斯著名)甚至源于准确诊断MCC肿瘤(28]。

基于这些发现,我们相信我们的结果在MS-1 MCC13细胞系证实现有的文献表明,只有真正模仿MCC MCPyV-positive细胞系。其细胞、免疫组织化学和病毒学特征,以及其高表达的MCC-miRs,展示未来研究MS-1作为一个有吸引力的候选人。进一步评估其他MCPyV-positive miRNomes的细胞系(MKL-1 MKL-2)将宝贵的支持这一观点。

伦理批准

本研究机构审查委员会批准入会前范德比尔特大学(IRB ID 111357)。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

支持这项工作的美国皮肤学会通过医学生资助针对黑色素瘤和皮肤癌症研究。这项工作也是由Meharry-Vanderbilt-TSU支持癌症研究伙伴关系(NIH / NCI U54 CA91405-10)和CTSA目前奖。UL1TR000445国家医学转化中心。其内容是完全的责任作者,不一定代表官方观点的国家医学转化中心和美国国立卫生研究院。此外,作者感谢劳埃德·e·王博士,医学博士,Ph.D. of Vanderbilt University Medical Center, for providing them with several of the MCC samples utilized in this study. The authors also thank the Chang-Moore Laboratory at the University of Pittsburgh for providing them with the MS-1 cell line.