文摘

KSHV的病原体是卡波济氏肉瘤(KS),肿瘤表现最积极,多病灶的病变在部分人类皮肤炎性反应的倾向。然而,控制机制的进化从良性增生KS组织学上复杂的皮肤病变仍然未知。在这项研究中,我们发现KSHV诱导蛋白质组学和形态学变化在黑色素细胞和melanoma-derived细胞系,伴随着放松管制的内源性抗炎反应MC1-R /锚定α-MSH信号轴。我们还发现了两个烹饪和细胞系,显示不同的能力支持长期的KSHV感染和映射这种二分法的差异(一)NF -κB激活状态,(B)的处理和表达KSHV latency-associated核抗原亚型推定地与病毒裂解周期有关,和(c)易感性占据关键抗炎反应基因的表达变化,对抗NF -κB,包括MC1-R POMC TRP-1, xCT。病毒subversion的分子控制之间的平衡延迟和溶解性复制代表一个小说在皮肤和关联的KSHV发病机理和取向强调的潜在好处利用内源性抗炎过程作为衰减的治疗选择皮肤的KS和其他炎性KSHV感染高危个体的结果。

1。介绍

卡波济氏肉瘤(KS)是一个高度angioproliferative肿瘤病因与感染卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)也正式被称为人类疱疹病毒8 (HHV-8) [1,2]。四个流行病学的形式描述了KS和杰出的基于年龄、性别、地理位置、社会经济地位,先前的寄生虫感染,与艾滋病毒合并感染,医源性的器官transplant-associated免疫抑制的程度(3- - - - - -5]。尽管准确触发(s)为KS目前不清楚,各种形式的病变显示组织病理学特征与慢性炎症的共享要求一致,导致先前存在的概念或病毒诱导的炎症状态是至关重要的用于创建所需的生理条件KS的开发和发展。的确,在补丁早期阶段,损伤产生和/或paracrinally响应促炎细胞因子和生长因子包括干扰素-γ(IFN -γ)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)、2、il - 6 (6- - - - - -9]的支持表达粘附分子和趋化因子调解招聘循环单核细胞的病变。相关的早期阶段也分泌protumorigenic介质如血管内皮生长因子(VEGF)驱动hyperproliferating梭形细胞血管生成增加,进而形成红细胞外渗的基本slit-like框架,新血管形成,和浆细胞浸润;在一起,这些生物过程被认为有助于复杂的细胞结构中发现的KS病变(6,7,10- - - - - -14]。

一般来说,内炎性蛋白的表达和KS病变,主要是由核控制的因素κ- b (NF -κB)转录因子,诱导基因表达的一个重要中介在细胞增长,免疫反应和病理炎症(15]。尽管分子组成的列表的NF -κB信号轴是迅速扩大16),古典transactivating NF -的形式κB是comprisesd RelA (p65) / p50形成,如果细胞,隐藏在一个不活跃的形式在细胞质中通过物理协会的抑制剂之一,指定的我κB (15]。在细胞外刺激信号转导事件迅速导致我的激活κB激酶(IKK)两个催化亚基(IKK组成的复杂α和β)和NF -监管”κB基本调制单元”(NEMO)。激活IKK(主要是IKKβ)磷酸化我κBα,引发其polyubiquitination和蛋白酶体降解;这释放积极的NF -κB homo -或形成,随后把细胞核转录NF -开车κB-responsive基因(15]。

NF -的作用κB在KSHV发病机理成为关注焦点,持续的观察,病毒诱导激活NF -κB感染后不仅对建立和维护需要延迟的17,18)也为致癌的转换(19,20.]。因此,KSHV提交大部分对NF -其编码潜力κ病毒的激活,主要通过功能FADD-like interleukin-1 -β转换酶(FLICE / caspase-8)抑制蛋白(vFLIP) [21),病毒G-protein-coupled受体(vGPCR) [22,23],K1 [24],K13 [25],K15 [26),病毒被膜蛋白由开放阅读框编码- 75 (25),以及一组小分子核糖核酸,其中许多都与调节免疫反应,细胞生存,KSHV的致瘤的潜力(27- - - - - -29日]。具有讽刺意味的是,NF -κB激活与病毒有关的延迟,而其抑制导致病毒进入裂解周期(17,18]。这是最近报道,例如,NF -κB不仅激活KSHV潜在的基因的表达,包括拉娜v-FLIP, v-Cyclin,还负调节的transactivating势KSHV主要裂解开关调节器,等(17,30.,31日]。NF -κB抑制等招聘与RBP-J病毒性促进剂通过直接竞争κ(合作增强等transactivation通过绑定DNA毗邻低亲和力RTA-binding网站内RTA-responsive基因(32- - - - - -34从RBP-J])或隔离等κ,这两个被证明的相对数量和激活状态取决于NF -κB (35]。

显然,促炎NF -的函数κB病毒潜伏期控制之间的平衡调节的可访问性和溶解性复制的KSHV基因组transactivating因素,因此是一个基本的行列式KS皮肤和其他目标网站的发展。鉴于这种监管控制,它是有趣的,主机通常抗炎机制激活减弱皮肤不知何故未能控制疾病的炎症诱导靶器官。探索这个矛盾结果的分子基础,我们测试的假设KSHV感染皮肤细胞和颠覆了局部抗炎过程使他们无法克服病毒诱导支持KS组织发生的炎性反应。我们现在存在的第一个证据,黑色素细胞可以感染KSHV,反过来可能会选择作为一种重要的细胞行列式KSHV发病机理的皮肤。重要的是,我们发现了两个细胞系,显示两个属性对他们的能力来支持KSHV延迟程序和这些细胞学的属性映射到(a)的差异NF -占据的状态κB激活后原发感染和延迟,(B)表达独特的拉娜亚型与溶解性复制,和(c)易受病毒的持续感染细胞损伤的关键组件的内源性抗炎反应通路。在一起,我们的发现代表第一个描述的重要作用,皮肤细胞可能在KSHV发病机理和揭示病毒的细胞相关维修延迟和KSHV和宿主之间的相互作用的本质抗炎轴可以作为皮肤的KS预测标记。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

维洛细胞(写明ATCC;马纳萨斯,弗吉尼亚州)和rKSHV。219-infected Vero cells (a kind gift from Jeffrey Vieira, University of Washington, Seattle, WA) were cultured in DMEM (Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; HyClone Laboratories, Logan, UT) and puromycin (10 μg / mL;Calbiochem, EMD化学品公司,Gibbstown NJ)。如前所述(36),rKSHV。219expresses enhanced green fluorescent protein (GFP) under the control of the strong cellular elongation factor 1-α启动子和Ds-red荧光蛋白(RFP) KSHV裂解腺苷核(PAN) RNA启动子,除了维护嘌呤霉素抗性选择标记基因的病毒在rKSHV游离基因。219 -感染细胞(36]。正常成人主要表皮黑色素细胞(NHEM-Ad;Walkersville Lonza Walkersville, Inc ., MD)在254年培养cf媒体与0.1毫米CaCl补充₂和人类的黑素细胞增长补充PMA(级联生物制剂,表达载体,卡尔斯巴德,CA)。MeWo, highly-pigmented细胞系来源于一个结节性淋巴结转移患者恶性黑色素瘤(37),从写明ATCC获得和培养EMEM(质量生物,Inc .)补充10%的边后卫。Mel1700良性人类melanoma-derived细胞系,由莫里斯Zauderer (Vaccinex, Inc .,罗切斯特,纽约)和培养rpmi - 1640(质量生物,Inc .)补充20%的边后卫。rKSHV。219-infected MeWo and Mel1700 cells were derived in our laboratory and maintained under selection with puromycin at concentrations of 0.5 μ克/毫升,1μ分别g / mL。人类角化细胞永生化细胞系,HaCat [38),在DMEM培养补充10%的边后卫。rKSHV。219-infected HaCat cells were also maintained in DMEM supplemented with 10% FBS and puromycin (0.5 μg / mL)。BCBL-1身体cavity-based淋巴瘤细胞株,持续感染KSHV,得到从迈克尔·麦格拉思和Ganem通过美国国立卫生研究院艾滋病研究和参考试剂项目分工艾滋病(NIAID NIH,马里兰州贝塞斯达),并培养rpmi - 1640年补充10%的边后卫。

2.2。病毒感染

rKSHV感染研究文化。219-infected Vero cells were induced with 6 mM sodiumn丁酸(NaB;σ,圣路易斯,密苏里州)和监控RFP的表达式。感应四天后,细胞被刮,resuspended花了媒体,并通过离心收集在4°C,如前所述[36]。包含集中KSHV的上层清液颗粒保持在冰而细胞颗粒resuspended 2毫升DMEM和冷冻和解冻两次释放细胞相关病毒颗粒。由此产生的溶解产物在2500转离心10分钟4°C清除残骸和澄清上层清液结合原文化上层清液,通过0.45 sterile-filteredμm膜过滤,储存在−80°C。未受感染的维洛细胞接受6毫米NaB和并行收获用于模拟感染。

生成长期rKSHV。219-infected cells, uninfected cells were plated in T-25 flasks in their respective growth media supplemented with 10% FBS. At 70% confluency, media were removed from each flask and 2 mLs of the Vero-derived rKSHV.219 supernatant was added. After one hour of incubation at 37°C, 3 mLs of media (with 5% FBS) was added and further incubated at 37°C and monitored for the expression of GFP. Subsequently, a progressively increasing concentration (0.1–10 μg)嘌呤霉素/毫升加入rKSHV文化以丰富。219 -感染细胞。模拟感染进行并行使用未受感染的维洛细胞上清液和细胞收获时进一步分析嘌呤霉素rKSHV之外。219 -感染细胞。HaCat感染的细胞,rKSHV的t - 75瓶。219-infected Mel1700 cells was induced with 6 mM NaB for two days to achieve optimal amounts of RFP positive cells (reactivation conditions were determined empirically). Cell supernatants containing reactivated KSHV were collected, spun at 2500 rpm for 10 minutes at 4°C to remove floating cells and other debris, sterile-filtered through a 0.45 μm膜过滤器,添加到HaCat细胞无毒性。HaCat细胞感染Mel1700-derived rKSHV。219were monitored for the appearance of GFP and selected with puromycin (0.5 μg / mL从第三天开始postinfection)。

2.3。抗体和试剂

下面的抗体购自圣克鲁斯生物技术,Inc .(圣克鲁斯,CA):多克隆anti-GAPDH (L-20)单克隆anti-TRP-1 (h - 90), anti-Melan (fl - 118), anti-MC1R(可)和HRP-labeled山羊anti-rat二级抗体。老鼠anti-LANA单克隆抗体LN35购买从Abcam (Cambridge, MA)。alexafluor - 647标记鸡anti-rat免疫球蛋白二次抗体(猫没有。A21472)和alexafluor - 568标记山羊anti-rat免疫球蛋白二次抗体(猫没有。A11077)购买的分子探针(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。除非另有说明,所有兔单克隆抗体的关键组件NF -κB通路以及磷酸化NF -兔多克隆抗体κB p65,购买从细胞信号技术(丹弗斯,MA)。额外的抗体总NF -κB p65从Biosource购买国际(贝CA)和用于免疫印迹分析HRP-labeled羊anti-mouse (Amersham生物科学,通用电气医疗集团生命科学,皮斯卡塔韦,NJ)或HRP-labeled驴anti-rabbit (Chemicon、微孔Billerica, MA)二级抗体,分别。免疫印迹分析或人类xCT使用先前描述的兔多克隆抗体人类SLC7A11的氨基端肽(xCT) [39),或与多克隆抗体anti-xCT nb300 - 318从罗福斯生物制品,(利特尔顿有限公司)。重组alpha-MSH购买从EMD-Calbiochem(加州La Jolla)。

2.4。显微镜

图像捕获使用AxioCam MRm数码相机(卡尔蔡司,Inc .)附加到蔡司Axio观察者。A1倒置荧光显微镜(卡尔蔡司,Inc .)。伪彩色和其他图像分析使用AxioVision 4.6版本软件。

2.5。流式细胞术

细胞被洗,使胰蛋白酶化,resuspended流式细胞仪缓冲区(无菌过滤1%的边后卫在PBS Ca^{2 +}或毫克^{2 +}),并统计。细胞被固定为2%多聚甲醛(电子显微镜科学、华盛顿堡、PA)和转入流式细胞仪管(猎鹰,# 352063)通过流式细胞术分析。细胞测量获得使用BD生物科学LSRII细胞分析仪和FACSDiva软件。数据分析使用FlowJo软件(版本8.7.3)。

2.6。PCR扩增

总DNA提取rKSHV。219-infected or uninfected cells using the DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA), and PCR amplification was performed with Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen), as recommended by the manufacturer. For detection of viral DNA by PCR, the KS330 primer pair derived from KSHV ORF26 (Table S1) was used to amplify a 232 bp (nt 987–1218) fragment using the following conditions: 94°C for two minutes, then 35 cycles of 94°C for one minute, 58°C for one minute, and 72°C for one minute, followed by 72°C for five minutes, as previously described [1]。分析了样本在2%琼脂糖凝胶电泳凝胶与溴化乙锭染色。

2.7。rt - pcr

总RNA提取细胞颗粒使用试剂盒试剂(表达载体),消化与RNase-free DNase组(试剂盒)和量化使用相关软件支持的nd - 1000 NanoDrop分光光度计,3.1.2版本。rt - pcr进行0.5μg DNase-digested RNA使用上标一步法rt - pcr和铂Taq工具包(英杰公司)与引物组特定病毒或细胞基因(表S1)。分析了放大产品在1%琼脂糖凝胶电泳凝胶与溴化乙锭染色。

2.8。免疫荧光

细胞被播种在eight-well室幻灯片(Lab-Tek室滑动系统,Nalge Nunc)的浓度细胞每一夜之间好,允许遵循37°C。直接免疫荧光,第二天细胞被固定在2%多聚甲醛(电子显微镜科学、华盛顿堡、PA)在PBS 30分钟然后在2%多聚甲醛和0.1% permeabilized Triton x - 100 (Calbiochem拉霍亚,CA)在PBS额外30分钟。固定后,细胞被洗一次PBS和孵化阻断缓冲区(2%的边后卫在PBS)一小时37°C。阻断缓冲区被移除和细胞进一步孵化anti-LANA主要抗体在新鲜阻断缓冲区一小时37°C。细胞被洗五次PBS然后孵化与荧光标记二次抗体一小时37°C。与PBS五洗后去除游离抗体,盖玻片被安装到幻灯片使用Vectashield安装介质与DAPI荧光(向量实验室,伯林盖姆,CA),并使用荧光显微镜细胞被可视化。

2.9。免疫印迹

细胞颗粒(每个颗粒细胞)细胞溶解在缓冲区里帕(NP-40 0.1% SDS, 1%, 150毫米氯化钠,1毫米EDTA, 50 mM Tris-HCl pH值7.5,0.5%脱氧胆酸盐,50μg / mL BSA)和减少条件下电泳NuPAGE 4 - 12% Bis-Tris凝胶与MES SDS运行缓冲(表达载体)。解决蛋白质从凝胶转移到一个PVDF膜(表达载体)和阻塞在PBS Tween-20包含脱脂奶粉5%和0.1%。主要和次要的抗体都稀释在阻断缓冲区和孵化墨迹一小时,在室温下摇晃。墨迹洗了三次(PBS NP-40 0.05%), 15分钟后孵化与西方每个抗体和使用SuperSignal开发毫微微衬底(热科学,罗克福德,IL)。

3所示。结果

3.1。人类黑色素细胞可以通过KSHV被感染

我们决心的敏感性皮肤细胞KSHV innoculating主要成人黑色素细胞(NHEM-Ad)和两个melanoma-derived rKSHV细胞株(MeWo和Mel1700)。219和then analyzed: (i) postentry expression of virus-encoded GFP, (ii) viral genome content by PCR, (iii) viral gene expression by RT-PCR, and (iv) productive release of infectious virus upon lytic reactivation. Compared to controls, infected melanocytes (NHEM-Ad) and MeWo cells lost their elongated morphology and acquired a stubby, dedifferentiated phenotype (Figures1 (b)和1 (c))。持续感染MeWo细胞也大,形成多核多核体(数字1 (c)和S1A;黄色星号),可能引起病毒性glycoprotein-mediated细胞融合(40]。另一方面,持续感染Mel1700细胞并没有成为粗短,而是表达了细长的树突棘(数字的发展结果1 (d)就是S1C;箭头)。这些形态变化与subskin neuroendocrine-like特性的典型相关病变(41- - - - - -43迄今未开拓的),可能是第一个迹象方面的病毒-宿主相互作用导致皮肤病理。经过一系列的感染细胞的选择性通过嘌呤霉素的存在,我们能够产生长期文化持续感染的感染率(100%)KSHV-infected细胞(参见图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/246076),允许我们进一步描述KSHV感染的病毒的结果在这些细胞。

3.2。微分的感应KSHV皮肤细胞裂解周期表明细胞Line-Specific相关的病毒取向

证实了长期感染皮肤细胞PCR扩增病毒DNA分离细胞的处理越来越多的n丁酸(NaB),组蛋白脱乙酰酶抑制剂诱导病毒复活(44]。如图2,模板从uninduced Mel1700-KSHV细胞产生了更强烈的病毒DNA的产品相比,目标模板从uninduced MeWo-KSHV细胞(数字2(一个)和2 (b);比较巷2在每种情况下),这意味着Mel1700-KSHV细胞可能港比MeWo-KSHV细胞病毒基因组复制,我们证实了dilutional分析对预设的标准从KSHV病毒DNA⁺BCBL-1细胞之前决定包含大约100个基因组复制每个细胞(45]。确定假定的病毒基因组的差异内容反映了不同病毒的复制的潜力在这些细胞中,我们使用了这项分析自发或NaB-induced病毒激活基于RFP的表达,这是转录严格潘裂解病毒启动子的控制下(36]。如图2 (c)RFP未经处理的MeWo-KSHV细胞中几乎检测不到,但在治疗后略微增加2毫米逮捕。相比之下,已经高水平的自发RFP Mel1700-KSHV细胞表达进一步增加了NaB(图2 (d)),进一步表明Mel1700细胞可能有更高的倾向支持病毒裂解复活。然而,我们注意到,细胞密度的差异也会影响的时间和/或鲁棒性病毒复活在感染细胞融合性的文化,所以我们用流式细胞术更准确地量化时间增加RFP NaB后+细胞治疗。如图S2A,大约0.9%的未经处理的MeWo-KSHV细胞RFP +,而只有7.9%的未经处理的Mel1700-KSHV。NaB治疗后在每个时间点,MeWo和Mel1700细胞的RFP +细胞数量增加到大约30%和36%后1天,2天后,41%和45%,分别为46%和57%后2天。这个时态变化RFP表达式也说明在各种格式(数字S2B-S2D),所有这些都表明,Mel1700细胞支持更高级别的自发的和/或药物引起KSHV比MeWo细胞活化。此外,病毒粒子高度诱导Mel1700-KSHV细胞被感染的人类HaCat角质细胞,随后保持GFP表达(图S3A)和病毒DNA持续超过48天后文化在嘌呤霉素的存在(图S3B)。此外,感染HaCat-KSHV病毒裂解细胞也可以支持复制,就是明证疫源地RFP-expressing细胞在低剂量治疗NaB(图S3C)。

3.3。KSHV-Infected皮肤细胞病毒基因表达的全面支持

确定不同的病毒裂解复制在MeWo和Mel1700细胞(图2)也反映出的病毒基因表达模式在这些细胞中,我们分析了选择病毒基因的转录资料属于每个之前描述的三个类的病毒转录KSHV-infected细胞(46- - - - - -48]。v-FLIP,因此,类我基因包括拉娜和v-Cyclin持续表达,而二类基因包括立即早期总开关调节器的KSHV病毒裂解周期等,以及Orf74 (v-GPCR)和K2 (v-IL-6)既定的表达但高度诱导病毒基因表达宿主微环境的监管机构。另一方面,第三类基因包括严格裂解基因如gB, gH, K8.1编码病毒结构蛋白。病毒基因转录是由半定量rt - pcr进行评估;所有RNA样本处理DNase我之前rt - pcr反应,因此没有放大产品中检测出pre-RT-PCR控制实验逆转录酶从反应(RT)省略(图S4A)。此外,没有检测到病毒DNA DNase我对RNA样本(图S4B),确认我们已经成功删除污染病毒DNA。如图3,所有的基因测试都表达了在这两种细胞系,尤其是NaB后治疗。然而,一个重要的区别是明显的表达stage-specific复制的关键标志,尤其是早期等,早/晚vGPCR,严格K8.1末。虽然这些成绩单只表示NaB-treated(但不是uninduced) MeWo-KSHV细胞,他们未经处理的Mel1700-KSHV细胞(图中大量表达3,比较通道2和5)。鉴于等transactivates几个裂解KSHV基因的启动子包括自己的(46- - - - - -48)等表达的差异缺乏药物诱导可以解释更高层次的自发的病毒感染Mel1700-KSHV细胞活化和病毒粒子输出而MeWo-KSHV同行。

3.4。拉娜的微分表达式KSHV-Infected细胞突出扩散核拉娜表达式作为一个标记的病毒裂解复制

病毒潜伏期KSHV拉娜保持部分拘束游离DNA的宿主染色体和抑制RTA-controlled裂解基因(49]。符合这个函数,拉娜经常被发现是点状的核斑点描述离散疫源地LANA-mediated拘束的病毒宿主DNA(游离体49]。根据我们的发现等强劲Mel1700-KSHV细胞表达即使没有药物诱导,我们推测管制拉娜的表情可能缓解等压迫,导致Mel1700相对更高级别的病毒复活,但不是在MeWo细胞。与预测一致,所有感染MeWo-KSHV细胞表现出点状的核羊毛染色,也通常出现在latently-infected内皮细胞和PEL-derived细胞株(49),而羊毛染色主要是“扩散”Mel1700-KSHV细胞(图4和补充图S5)。“点状的”与“扩散”的区别并不是由于抗体大或工件与IFA,因为类似的结果在一个平行实验,我们使用一个山羊anti-rat二级免疫球蛋白结合到一个不同的荧光团(图S6)。此外,没有背景荧光被认为在控制实验中只有一级或二级抗体(图七),使用,在这种情况下,RFP信号是NaB治疗的结果,导致更高层次的RFP Mel1700-KSHV细胞中表达而MeWo-KSHV细胞(如图2)。

确认是否扩散羊毛染色直接与溶解性复制,我们对待MeWo-KSHV和Mel1700-KSHV细胞NaB然后试图同时捕获点状的(unreactivated)和扩散(激活)拉娜图像相同的细胞群。图S8是一组代表性的RFP, GFP, DAPI和拉娜图像从两个独立的视觉领域I和II(面板,MeWo-KSHV)和III和IV (Mel1700-KSHV面板B)。MeWo-KSHV细胞,分散拉娜染色检测只能在重新激活(RFP +)细胞nos.10, 11日和12日包围显然nonreactivated (RFP−)细胞nos.1-9拉娜确实是点状的(图S8A)。另一方面,细胞nos.1-6 Mel1700-KSHV领域似乎重新激活,并相应地表现出扩散羊毛染色(图S8B),确认扩散核羊毛染色可能溶解性复制的标志,虽然有小点的拉娜表达式可能反映了病毒基因组在潜在的占主导地位的国家。令人惊讶的是,我们也发现少量激活细胞胞质羊毛染色(例如,MeWo-KSHV细胞# 10 - 12)和Mel1700-KSHV细胞(# 1和3)。尽管核外拉娜染色在重新激活细胞的分子基础是未知的,它揭示了重要的新视角对小说迄今为止未被监管职能拉娜亚型可能控制时间、健壮性和分子阈值机制,控制病毒再活化。

3.5。微分KSHV拉娜揭示小说的处理和表达调控机制的病毒在烹饪和细胞裂解周期

自拉娜genome-tethering函数取决于其宿主DNA结合的能力,因为进入病毒裂解周期可能会扰乱这些交互的方式,从理论上讲,导致离域(扩散)羊毛染色,我们测试的假设扩散羊毛染色在裂解复制反映了不成比例的c端截断积累拉娜亚型DNA结合,缺乏能力,因此,广泛地表达可能在细胞核和细胞质中。有趣的是,KSHV拉娜(1162 aa)预测分子量135 kDa,然而各种研究经常检测蛋白质的紧身上衣大约220 - 230 kDa除了两NaB-inducible 150 - 180 kDa和130 kDa乐队(49),强调潜在的多个转录后的调控。在当前的研究中,我们也发现了220 kDa乐队uninduced MeWo-KSHV溶解产物(图5(一个)巷1),除了130 kDa乐队被逮捕(图诱导5(一个)巷2),但变得清晰可见uninduced MeWo-KSHV样品后30分钟。曝光(图5 (b)巷1)。Mel1700-KSHV细胞也含有~ 220和130 kDa乐队除了三个乐队在~ 180,160和90 kDa(图5(一个)巷3),表现在缺乏NaB的感应。虽然β肌动蛋白控制乐队表明少总蛋白可能是加载MeWo样本,额外的重复和长时间曝光证实MeWo样本表达了~ 180,160,或90 kDa乐队只有NaB治疗后(图5 (b),比较通道1和2),相比之下Mel1700-KSHV细胞,他们显然是目前即使在缺乏NaB的感应,给我们理由相信,180年~ 160年和90年kDa拉娜带可能是唯一与溶解性复制。我们注意到减少LANA-specific乐队在NaB-treated Mel1700-KSHV细胞(图5(一个),莱茵4)可能是由于NaB细胞毒性或细胞溶菌作用可能与传染性病毒释放。另一个深刻的发现是,拉娜MeWo感染细胞中表达的模式是类似于BCBL-1细胞拉娜经常被发现是点状的斑点(49),一个更显而易见的事实在西方并排墨迹(图S9A)和拉娜IFA图像(图S9B)。在一起,这些结果暗示点状的羊毛染色是强大的延迟,而转向分散染色可能代表进入病毒裂解阶段。

3.6。NF -κB激活和感染细胞的整体炎症状态调节KSHV延迟皮肤细胞

大量的研究表明,先前存在的炎症或直接KSHV-mediated激活的NF -κB途径早期感染后可能是必要的成功建立病毒潜伏期(50,51]。检查这个概念在皮肤细胞,我们分析了关键部件的激活状态的古典NF -κB通路与内在细胞属性,支持特定病毒在两个结果新创(或急性)和持续或慢性感染。类似于先前的报道,KSHV迅速的磷酸化NF -κB p65 IkBα在20分钟的感染(数字6(一)和6(b)),影响与变化相关的表达NF -κB-controlled细胞粘附分子1 (ICAM-1) [52]。有趣的是,尽管磷酸化p65好几小时postinfection MeWos保持相对不变,它是短暂的,事实上在一小时内开始下降postinfection Mel1700细胞(图6(c))。自NF -κB激活压制等而抑制解除等镇压[17,18),NF -这一事实κB激活是限制在KSHV-infected Mel1700细胞意味着Mel1700细胞可能表达内源性机制函数自适应地减弱NF -κ活动,这一过程可以解释的倾向较高病毒激活这些细胞。符合这一观点,我们发现,经过几天的选择性通道的嘌呤霉素(旨在维护稳定持续感染细胞中复制的病毒基因组),关键部件的NF -κB信号轴受病毒影响有差异,即使MeWo和Mel1700细胞保留他们的黑色素瘤表型,如持续表达Melan-A(图所示6(d))。例如,尽管磷酸化p65, IkBα、IKKβ在持续感染MeWos升高,磷酸化水平p65大幅减少,和磷酸化IkB相对增加的吗α和IKKβ也更温和长期文化感染Mel1700细胞(图6(d),比较通道2和4,职责)。因此,我们发现,MeWo细胞相比,Mel1700细胞(a)支持一个更健壮的病毒裂解复制程序(图2),(b)表达高水平的区域贸易协定(图3),(c)显示扩散核染色(图拉娜4 (b))与stage-specific表达特定的拉娜亚型包括180 kDa乐队与溶解性相关联复制(图5),(e)减少了NF -κB激活(图6)。这两个属性是一致的模型,持续激活NF -κB(如MeWo细胞)与维修相关的延迟而减少激活NF -κB p65(如Mel1700)与更高的病毒复活倾向,发现支持的模式在其他细胞类型17,18,50,51]。

3.7。KSHV块表达抗炎反应蛋白质来维持一个潜伏状态MeWo细胞,但不能这样做在Mel1700健壮的裂解细胞,支持复制

皮肤的表皮内的炎症控制单元是由抗炎反应主要由策划alpha-melanocortin刺激激素(α-MSH),一个强有力的肽来源于pro-opiomelanocortin (POMC)转译后的蛋白水解处理(53]。的影响α-MSH通过肾上腺受体转导(MC1-R) [54),这是表达的skin-resident黑色素细胞,角质细胞、微血管内皮细胞,以及其他单核细胞的浸润[54]。在绑定MC1-R,α-MSH触发信号级联,有效地缓解炎症反应通过阻止激活NF -κB和相关的促炎细胞因子和粘附分子的表达,调节炎性细胞的渗透到血管内皮环境(53,55- - - - - -57]。α-MSH也调节色素生产和沉积通过激活酪氨酸酶,这种酶催化合成dopaquinone,杀菌作用的第一步(58];反过来,dopaquinone与胞内反应胱氨酸(由胱氨酸/谷氨酸转运体,xCT)产生cysteinyl-dopa,病原反应一步合成素在炎症的59]。自从建立持久状态是由整体炎症感染细胞的状态,我们是否建立强大的KSHV延迟(在MeWo而不是Mel1700)由微分控制放松管制的内源性抗炎介质,否则被表达,以防止在这些细胞建立延迟。我们测量了NF -时间变化κB激活与抗炎的关键组件α-MSH / MC1-R信号轴,第一个1小时内,发现感染KSHV磷酸化NF -诱导迅速增加κ(图B p65 MeWo细胞7(一))。这是与Mel1700 NF -细胞的增加κB激活才发生至少3小时postinfection(见图7 (b)和ImageJ定量的磷酸化p65乐队强度图7 (c))。在NF -快速增加κB MeWos细胞激活,MC1-R并不表示虽然是一个逐步废除内生tyrosinase-related蛋白1 (TRP-1),这是参与色素合成和沉积在炎症(图7(一))。相比之下,MC1-R蛋白质诱导Mel1700细胞在感染后几乎立即,但没有明显的影响已经TRP-1的高基线水平(图7 (b));相反,有一个信使rna病毒诱导增加MC1-R, POMC(的前体α-MSH), xCT (SLC7A11基因名字)(图7 (d))。这种效应与病毒的数量,标记的相应病毒GPCR的表达存在剂量依赖的相关性,拉娜,vFLIP(图7 (e))。

当感染监测在更长一段时间,很明显,磷酸化p65 MeWos仍然很高,而在Mel1700细胞持续很久以后发现(图S10A)。此外,磷酸化p65动力学两个细胞系xCT的重叠与表达(图S10B),它不仅形成了复杂的受体,介导KSHV条目(39),还供应胱氨酸生产谷胱甘肽(GSH),一个强有力的抗炎介质(60]。有趣的是,我们最近发现KSHV microrna目标xCT的转录抑制感染细胞,表面上是为了促进病毒传播,而防止感染细胞炎性应激(61年]。因此,NF的动力学——这一事实κB激活重叠与xCT表达KSHV-infected皮肤细胞是一致的细胞诱导抗炎反应的适应性反应在潜在的炎症状态。按照这个链接,我们检测到一个xCT的表达水平明显降低,MC1-R,和TRP-1 MeWos持续感染,但在Mel1700细胞表达MC1-R和TRP-1持续成办xCT的增加(图7 (f))。在一起,这些发现表明,微分的影响KSHV MeWo和Mel1700我们观察后新创感染后也保持着建立延迟。

3.8。KSHV延迟与损伤的整体抗炎反应被感染的皮肤细胞

确定的生物意义的影响KSHV内生melanogenic反应介质,我们治疗感染和KSHV-infected MeWo或Mel1700α-MSH TRP-1评估细胞的再分配,一个已知的下游MC1-R活动的效应函数的标志。TRP-1表达只在黑素体在黑素体结构的维护过程中发挥作用。如图8,未经处理的MeWo细胞表达弱,但可检测水平的TRP-1主要与ER /高尔基网络(图有关8(一个)左上的象限)。然而,治疗α-MSH导致轻微变化的分布TRP-1从专门与ER /高尔基细胞(图的其他方面8(一个)左下角的图片),这表明这些细胞能够应对的抗炎作用α-MSH。然而,在KSHV-infected MeWos,基底表达式TRP-1废除(图8(一个)右上的形象)与免疫印迹图中的数据一致7(一)。值得注意的是,治疗KSHV-infected MeWo-KSHV细胞α-MSH恢复TRP-1表达水平(图类似于那些未感染的样本8(一个)白色箭头),揭示KSHV MC1-R /的直接影响α在这些细胞-MSH轴。另一方面,我们发现,与MeWo和感染的同行中,并不是所有的细胞表达TRP-1, Mel1700细胞高表达水平基底TRP-1(图8 (b),左上的图像),在这种情况下KSHV实际上并没有废除,而是诱导TRP-1表达明显增加(图8 (b)右上的形象;也看到TRP-1污点在图7 (b))。此外,α-MSH Mel1700-KSHV细胞治疗导致大幅改变TRP-1表达式从主要的核上的ER /高尔基网络出现,高倍镜下,像melanogenic囊泡树突棘(数字排列8 (b)和S11B,绿色箭头,和额外的数据未显示)。在功能层面上,它是合理的结论,在MeWos未能表达必要的抗炎介质的环境感染,病毒延迟更可能的结果,而表达的快速增长MC1-R和其他抗炎分子感染Mel1700 NF -细胞块κB (53,55- - - - - -57),因此限制建立潜伏状态和/或导致更倾向Mel1700细胞裂解复制的支持。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了传染性KSHV的过程在烹饪和细胞为了确定致病的主题背后的能力KSHV诱导皮肤KS病变皮肤,内源性抗炎过程的高度专业化的网站可能无法克服这种病理结果。使用主黑色素细胞以及建立melanoma-derived细胞,我们检查关键标记的病毒/主机交互控制KSHV取向和发病机理在皮肤和识别重要的相关链接的KSHV复制程序底层炎症感染细胞的状态。具体来说,我们确定了两个细胞lines-MeWo Mel1700-that始终显示(a)易感性的差异生产感染,(b)时机和鲁棒性的病毒复制,(c)的表达KSHV latency-associated核抗原,拉娜,(d)复制阶段特定的病毒基因的表达,和(e)易受扰动占据抗炎melanogenic响应。我们发现这些差异的基础运作的特异性标记的KSHV交互与宿主基因组,其中最主要的是KSHV拉娜的微分表达式。

拉娜认为病毒潜伏期的拘束游离病毒DNA的宿主染色体和阻塞等表达(49]。我们发现扩散核拉娜染色与溶解性复制,而点状的染色标记的延迟,导致我们假设扩散羊毛染色反映“天马行空”拉娜亚型的积累无法阻止等。符合这一观点,NaB感应开关从点状的漫射羊毛染色;此外,等表达高自发激活Mel1700-KSHV羊毛染色的细胞扩散,与MeWo-KSHV的细胞等表达只有NaB治疗后,进一步支持我们的假设。

虽然控制核的机制,拉娜的表情在病毒生命周期的不同阶段,目前还不完全清楚,最近观察到当的N - c终端拉娜(包含核的定位信号,NLS)表示单独KSHV-infected细胞糖基(KSHV DNA末端结合重复)形成离散核斑点,而N端(结合宿主染色体)表现出扩散核染色(62年- - - - - -64年]。然而,当完整拉娜表达本身的细胞无毒性,它表现出扩散核染色成为斑点包含KSHV的细菌人工染色体末端重复地区介绍了(65年]。此外,天然羊毛同种型(76 c端端氨基酸截断)中检测出KSHV-infected主要积液淋巴瘤细胞系(像素),BCP-1 BC-3,但这种同种型无法绑定到KSHV游离体,因此表现出扩散核染色(66年]。在一起,这些发现支持这样的结论,分散拉娜染色反映了拉娜的积累亚型,可能仍然是与主机染色质但不拴在病毒基因组大概处于溶解状态复制。令人惊讶的是,我们也发现弥漫性拉娜的细胞质染色几激活Mel1700-KSHV细胞,尽管目前还没有发表的证据质核穿梭KSHV-infected细胞功能拉娜的一项研究表明,拉娜氨基酸1 - 323地区,缺乏NLS,保留在细胞质中67年]。这短形式的拉娜是否生成和穿梭在一些lytically复制细胞细胞质仍有待确定。

各种研究一致表明,根据病毒再活化的细胞类型和状态,在LANA-specific LN35抗体用于这项研究可以发现至少五个不同的拉娜乐队大约在220年,180年,160年,130年和90 kDa,所产生的潜在替代启动(68年],截断[66年),或转录后修饰69年- - - - - -71年]。因为LN35尚未识别的抗原决定基映射,身份和氨基酸序列(s)的每一个乐队需要系统的蛋白质组学分析超出了当前的研究的范围。尽管如此,我们和其他人已经表明的~ 180,130和90 kDa LANA-specific乐队与溶解性复制(72年,73年),这让我们相信~ 220 kDa乐队可能对应于长篇拉娜,尽管~ 180 kDa乐队可能与扩散相关的c端截短形式拉娜染色(66年因为它只存在在lytically复制细胞。从这些发现一个预测是,180 kDa的比例相对于完整拉娜从潜在的调节开关裂解阶段。有趣的是,最近Toptan等人描述复杂拉娜亚型类似于那些我们已经发现和提出,这些乐队可能源于不在经典里的翻译起始(68年]。虽然这些独立的发现揭示了一种新视角拉娜函数(s)的复杂性,他们也带来一些新的问题。(a)什么因素引发非规范翻译起始和/或微分处理拉娜的产品可能是细胞质中穿梭吗?(b)细胞如Mel1700显示更高的倾向支持裂解复制表达宿主限制因素诱发的生成细胞质拉娜亚型无法调解的主机病毒基因组染色体拘束?(c)监管机制控制特定的拉娜亚型的积累与全长拉娜?显然,这些管理主题的发病的影响不能被忽视,但是他们不是gammaherpesviruses中前所未有的。例如,在eb病毒(EBV)感染KSHV gammaherpesvirus密切相关,至少八个不同的成绩单EBV latency-associated核抗原(即。EBNA-1 2 3 3 b, c 3, 4, 5, 6),表达控制EBV延迟项目的各种状态(74年]。由于EBNA KSHV拉娜的功能相同器官,可想而知,拉娜类似物的各种EBNA亚型KSHV也可能表示在特定阶段的生命周期,虽然需要进一步调查以隔离复制阶段特定蛋白质的功能在一个给定的细胞环境。

我们的研究还揭示了NF -之间的直接联系κB激活状态和病毒再活化,与先前的调查结果,NF -一致κB激活后早期KSHV感染是建立和维护所需的延迟(17,18]和[致癌性转化19,20.]。有趣的是,KSHV延迟项目MeWo细胞伴随着持续激活NF -κB,减少表达与内源性抗炎反应的关键标志。相反,在Mel1700病毒容易发生自发溶解性复制,磷酸化NF -κB p65仍低,伴随持续的抗炎蛋白的表达,引导我们得出KSHV可能会持续在皮肤细胞通过调节其复制的项目通过激活NF -κB,同时施加subversion占据抗炎的轴。因此,它是合理的推测,为了KSHV持续,导致皮肤的皮肤疾病,它必须感染,然后直接或paracrinally克服skin-resident细胞的内源性抗炎反应的条件,支持KS的发展。事实上,我们发现KSHV确实可以感染和诱导细胞重编程在黑色素细胞,炎症损伤皮肤细胞传感器的关键。

在这项研究之前,黑色素细胞不知道目标KSHV感染,这可能会导致一些人质疑他们的相关性在KSHV发病机理。然而,可以说,黑色素细胞的解剖位置和功能的哨兵微生物进攻和宿主免疫炎症的接口(58,75年)支持期望这些细胞可能在皮肤调节KSHV发病机理。为了应对感染和其他炎性提示,黑色素细胞表达多种信号肽等α-MSH。在绑定MC1-R,α-MSH能传感信号,防止NF -激活κB和相关的促炎细胞因子的表达,肿瘤生长因子和粘附分子,调解轮回通过血管壁炎症细胞在血管生成新血管形成(56,58]。鉴于KSHV病理炎症的基本作用,和这一事实α-MSH对抗NF -κB (56,58),KSHV感染黑色素细胞的能力可能在皮肤KS发展产生深远的影响。如果减值准备的表达抗炎分子(如MC1-R TRP-1, xCT)代表的重要病毒关联建立KSHV延迟在皮肤细胞中,很可能设置的持续炎症不能克服将支持病毒相关疾病,而方法(例如,通过增强抗炎反应αNF - -MSH-dependent中断κB激活(76年])可能不赞成病毒在皮肤和持久性,因此,开发潜在的新选项的临床管理皮肤KS或其他皮肤状况,可能取决于慢性炎症(占据77年]。具体地说,皮肤的慢性炎症可能会导致血管通透性增加,对血管内皮调节酶分子的表达,chemokine-mediated招聘网站从底层KSHV-infected细胞血管炎症,播种的KS可能发生(图9),以及单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞激活的大部分炎性浸润通常出现在皮肤的KS病变(6,7支持这种模式。此外,我们发现有效的遗传性Mel1700-derived角质细胞的病毒粒子在体外强调了高概率的病理生理的框架,病毒传播的皮肤,这是合理的考虑到近距离和动态通信网络在人类表皮黑素细胞与角质形成细胞直接接触自然之间存在单位(75年]。具有讽刺意味的是,这种框架可以被病毒利用自抗炎melanogenic黑色素细胞的过程,通常诱导适应性反应病毒感染病毒粒子可以被转移。这种现象被称为“黑素体劫持”,已经被描述为水痘一带状疱疹病毒,另一个显示取向对人类皮肤疱疹病毒(78年]。

5。结论

本质上持续的病毒如KSHV必须操纵感染宿主细胞的支持机制,有利于长期感染靶器官内或诱导生产溶菌性复制,促进病毒传播到其他主机的宽容方面。因此,理解机制,控制病毒复制延迟和溶解性之间的平衡是一个重要的目标,应该指导发展的策略限制KS和其他病毒相关疾病的发病机理,在持久状态出现。在这里,我们发现潜在的炎症和溶解性复制之间的平衡是一个基本的关联KSHV延迟,推而广之,KSHV-associated病理学。尽管特定的细胞和分子的决定因素,控制某些细胞类型的内在能力支持KSHV延迟不是完全定义,我们的研究是一个重要的第一步,我们理解的性质和生物影响KSHV-mediated损伤皮肤细胞的抗炎作用,与皮肤的KS等对病理结果的影响,其发展依赖于炎症反应。不幸的是,我们不能完全解释为什么细胞株用于这项研究显示这样的深刻差异KSHV感染的结果。一条线索可能揭示了这样的事实,不像Mel1700, MeWo highly-pigmented细胞系有高水平的潜在的炎症(37),这是符合他们支持一个强大的延迟计划的能力。另一个理解(或者说另外),有可能是病毒再活化,如病毒诱导细胞凋亡的机制(79年,80年)可能是表达Mel1700细胞而不是MeWo细胞,一个有趣的概念,应该是后续的重点研究超出了当前的研究的范围。此外,隔离和表征的相关控制的时机和侵略性,KS人口水平可能提供的预测能力对分层损伤的高危个体发展基于微分接触炎性代数余子式,引发炎症,包括毒素、紫外线辐射、过敏原,创伤,或持续感染(81年]。例如,我们注意到,在KSHV /艾滋病毒合并感染的人通常的风险更大,发展中最激进的KS,艾滋病毒作为辅因子为KS不仅通过建立免疫抑制的环境,而且通过upregulation KSHV受体,xCT [82年),促进KSHV传播。有趣的是,还需要NF -艾滋病毒复制κB活动(83年),而抗炎活性xCT直接与NF -之间的平衡有关κB和α-MSH / MC1-R信号通路,这项研究揭示了重要的KSHV生命周期(84年]。因此,KSHV克服的能力α-MSH-mediated抑制NF -κB活动MeWos(病毒建立强大的延迟),不仅会促进HIV复制(85年),但也可以建立支持皮肤的KS发展的条件。未来的评估这些指标在高危患者KS相比那些KSHV血清反应阳性的但从未开发KS可能提供洞察细胞动力学使个体易患皮肤的KS,宿主对感染的反应可以被用来帮助防止lesional组织发生。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者表示特别感谢杰夫博士维埃拉rKSHV提供重组病毒。219和to current and past members of the Kaleeba laboratory for helpful discussions, technical assistance, and critical reading of the paper. Financial support was obtained from the intramural award program of the Uniformed Services University of the Health Sciences. The content of this paper is the sole responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the University or the Department of Defense.

补充材料