全基因组分析发育异常的痣细胞的基因和蛋白质表达

文摘

皮肤的黑色素瘤,一种皮肤肿瘤源自黑色素细胞,经常从癌变前的发展naevoid病变通过逐步转换过程由的积累(epi)基因病变。这些结构不良痣显示改变形态和经常黑色素细胞的增殖。此外,在发育异常的黑色素细胞痣显示线粒体结构和melanosomal改变,高活性氧(ROS)水平。在这项研究中我们进行全基因组表达和蛋白质组分析,从发育异常的黑色素细胞痣(DNMC)和邻近正常皮肤(MC)从18岁的病人。DNMC和MC的全基因组表达谱比较统计分析每个病人受到GO-based产生了显著差异表达去类包括“organellar核糖体,”“线粒体核糖体,”“氢离子转运体活动”和“prefoldin复杂。“从这些顶级5基因的验证类显示一个异构的微分表达式模式。蛋白质组学分析表明在DNMC差异表达蛋白,参与细胞的新陈代谢,排毒,和细胞骨架组织流程,如GTP-binding Rho-like CDC42蛋白,glutathione-S-transferaseω₁和prolyl 4-hydroxylase。集体这些结果指向放松管制的细胞过程,如代谢和蛋白质合成,符合DNMC中观察到的氧化应激水平升高可能导致氧化在这些细胞DNA损伤。

1。介绍

皮肤的黑色素瘤是一种恶性肿瘤,来源于黑色素细胞,皮肤色素产生细胞。黑色素瘤的发展是一个多步过程由收购遗传和表观遗传异常。虽然在正常皮肤黑色素瘤的一个子集发展新创,在许多情况下癌变前的naevoid色素病变可以看出在黑色素瘤的形成。大约三分之一的黑色素瘤发展从痣的前体,它是最常见的发育异常的(1]。一致,个体发育异常的痣患黑色素瘤的风险增加(2]。

发育异常的痣可以进展成径向和随后垂直增长阶段黑色素瘤(3,4]。黑色素瘤的复杂多级开发过程的特点是各种形态、细胞和生化改变。组织病理学发育异常的痣显示特征形态改变,包括扩散和可变表皮黑色素细胞的异型性,形成不规则的细胞巢在表皮和基底膜带,这些巢穴的互连和层(桥接)。在发育异常的黑色素细胞痣(DNMC)此外展览在黑素体形态变化和线粒体,在黑素瘤细胞(类似5]。之前我们已经表明,DNMC与正常的黑色素细胞表现出更高的素相比,铁,钙含量导致升高活性氧(ROS)水平(6,7]。减少DNMC的抗氧化酶水平进一步提高ROS水平和加强慢性氧化应激在这些细胞(8,9]。

在目前的研究中我们比较基因表达和蛋白表达模式的发育异常的黑色素细胞痣和正常皮肤的18个人。从手术切除发育异常的痣,邻近正常皮肤,分离并简要培养黑色素细胞基因表达分析使用全基因组表达的数组和蛋白质组分析肽质量指纹图谱。基因-基因表达分析和蛋白表达分析显示差异表达途径参与细胞新陈代谢,排毒,组织细胞形状。这些发现似乎意味着放松管制的过程,一起可能导致增加活性氧的水平和氧化应激,是经常在DNMC观察。合成氧化DNA损伤是一种内源性诱变力可能导致黑色素瘤的发展。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

医疗审查委员会批准后的莱顿大学医学中心和病人同意,18临床非典型痣切除来自18个不同的病人。所有18个样本病理学家检查后证实发育异常的痣。发育异常的痣的椭圆形切口由中部和正常皮肤的技巧。确保单独隔离的发育异常的黑色素细胞痣和从邻近正常皮肤,每个手术标本的中央部分,提示进一步处理之前第一次分裂。从发育异常的黑色素细胞痣的隔离和正常皮肤表皮隔间里,我们使用一个既定协议前面描述的(6,7]。短暂,清除皮下脂肪后,表皮与真皮分离通过隔夜孵化dispase二级(勃林格曼海姆公司,印第安纳波利斯)。表皮是使胰蛋白酶化获取单个细胞悬液用0.25%胰蛋白酶。这个单一细胞悬液中的细胞都被镀在火腿的F10黑素细胞中补充了青霉素(100 U /毫升),链霉素(100 U /毫升)、谷酰胺(表达载体、布雷达,荷兰),1% Ultroser G (BioSepra, Fremont, CA), Endothelin-1 (5 ng / mL), basic-FGF (5 ng / mL),霍乱毒素(30μg / mL), IBMX (33μ米)和TPA(8纳米,Sigma-Aldrich Zwijndrecht,荷兰)。这黑素细胞中含有有毒成分,角质细胞在表皮细胞悬液。在这些条件下纯黑素细胞培养得到10天后开始的文化。纯度的黑素细胞培养证实了显微镜检查的细胞培养板表面的形态由顺时针方向的评估;10天后所有细胞总是树突,星形或spindle-like黑色素细胞的形态学和细胞与上皮样的形态出现在培养皿中。额外的染色法代表与melanocytic黑素细胞细胞培养细胞HMB45标记和Melan-A证实这些黑素细胞的纯度的文化。黑色素细胞与发育异常的痣(DNMC)和正常皮肤(MC)培养最多6通道,确保对数增长和保持文化的时间尽可能短。最小化的变异细胞培养在基因和蛋白质表达,所有的MC和DNMC患者样本进行了相同的处理文化和收获在同一通道数量相同的收获方法。

2.2。样品制备微阵列和肽质量指纹图谱

从黑色素细胞RNA分离RNeasy迷你包(试剂盒、Venlo、荷兰)。反义RNA放大(aRNA)生成MessageAMP II aRNA工具包(Ambion、奥斯汀、TX)杂交的人类基因组U133 + 2.0数组(Affymetrix,圣克拉拉,CA)制造商的协议。和RNA RNA浓度测定nanodrop测量质量控制进行杂交之前被称为"安捷伦的生物分析仪。RNA质量进一步证实了posthybridization质量控制测量作为Affymetrix微阵列的一部分进行分析,包括归一化比例因子在微阵列和cRNA记录完整评估3′,5′探针信号强度比值,经常在莱顿基因组技术中心执行。蛋白质与黑素细胞细胞颗粒使用试剂盒试剂(表达载体);蛋白质浓度测定的皮尔斯BCA蛋白质化验设备。蛋白质样品(10μg)与1000年被贴上pmol荧光amine-reactive花青染料二维差异凝胶电泳(2 d消化)遵循制造商的协议(Amersham-Pharmacia生物技术)。

2.3。基因表达数据的统计分析

探头设置信号强度来自微阵列扫描受到强劲multiarray平均(RMA)算法如前所述10]。这个算法导致background-corrected,分位数规范化和日志(base2)转换最终探针强度作为基因表达的措施;这个对数尺度衡量表达式将进一步被称为“(基因)表达的价值。“识别差异表达的基因DNMC MC相比,统计分析方法(随机方差模型(RVM)的t以及)适合检测基因表达微阵列实验组成的差异相对较小的样本大小(使用11控制的数量和比例,而错误的发现与多元排列测试如前所述12]。根据欧氏距离进行额外层次聚类;使用计算集群再现性进行评估(再现性)和(差异)指数13]。

2.4。功能类得分基于基因本体论注释

基因本体论注释都是通过http://www.geneontology.org/。基因本体论(去)类少于5和超过100个基因表示数组中的数据不被认为是为了排除非常小和非常大的类。DNMC样本的个体病人与MC配对样本,以评估是否去类的微分表达式存在在所有成对的黑素细胞样本集之间的微阵列。功能类得分,执行semisupervised基因表达数据分析的基础上,根据统计方法如前所述[14]。该方法不需要事先选择和基因值被分配根据去审问基因类。

2.5。2 d消化和质谱分析

如前所述(执行2 d消化15]。染料交换实验进行检查标签Cy3和Cy5之间的差异。凝胶扫描在low-fluorescent玻璃板台风9400扫描仪(英国通用电气医疗有限公司,白金汉郡,英国)。与Delta2D v3.4 TIFF的凝胶图像分析软件(Dodecon,格赖夫斯瓦尔德,德国)。点是量化和正常化基于现货总额的凝胶。匹配的现货成交量随后正常化整个组凝胶和正常化现货成交量相比。图像之间的统计显著差异正常化使用Welch-modified学生的现货量测定t以及和降压威斯特法和年轻的错误发现率的校正方法。感兴趣的蛋白质斑点是切除MALDI-TOF / TOF凝胶的分析仪器(Ultraflex、力量、德国)。所有质量指纹和MS / MS数据都对人类蛋白质数据库搜索与吉祥物程序(矩阵科学,波士顿,MA)。

2.6。定量实时聚合酶链反应

互补脱氧核糖核酸是来自DNase-treated RNA (1μg)与iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(BioRad大力神,CA)。执行中存在与智商SYBR绿色Supermix MyiQ实时PCR检测系统(BioRad)。RPS11作为参考基因实验。中存在表达数据表示为两个测量的意思。

3所示。结果

3.1。微阵列分析从发育异常的黑色素细胞痣和正常皮肤

以前这是表明,黑色素细胞与发育异常的痣(DNMC)在形态上有所不同,色素沉着,和增长能力相比,黑色素细胞与正常皮肤隔离(MC)在文化7]。在这项研究中配对DNMC和MC获得发育异常的痣和18例正常皮肤。同样我们发现发育异常的痣细胞不同的文化形态与正常的黑色素细胞;图1(一)显示一个代表从黑素细胞文化来源于正常皮肤(左,MC)或者发育异常的痣(对,DNMC),表明MC有更多equally-shaped树突和DNMC一直显示不同的拉伸和稀释剂,树突形态。微阵列基因表达分析上执行这些18配对melanocytic细胞集来洞察这些黑素细胞样品组之间的差异在分子水平上。分析Affymetrix U133 + 2.0微阵列数据显示,从发育异常的黑色素细胞痣和正常皮肤表示45%的审问基因在可测量的水平。图1 (b)描绘了一个散点图的表达率的一组代表性的DNMC和MC绘制一个病人,表明基因表达差异DNMC和MC相同的病人通常是温和的。除了两个样品,层次聚类的微阵列数据显示DNMC样本类似自体正常同行更紧密地比他们就像另一个人的DNMC(图1 (c))。值得注意的是,样本0310 b和0223 b分开集群剩余的样品;这种区别并不反映在不同形态的细胞样本,从细胞形态在18 DNMC样品是均匀的样品没有明显的区别。此外,所有发育异常的痣也包含在本研究组织病理学非常相似,0310年和0223年在这方面的样品没有明显不同于其他患者样本。

(一)

(b)

(c)

图1

(一)照片(4 x放大)从文化的黑色素细胞来源于正常皮肤(左,MC)和发育异常的痣(对,DNMC) MC和DNMC文化代表的所有18岁患者的每一个黑素细胞文化是派生的。(b)散点图与average-log表达率在一个DNMC样本策划反对average-log比率的MC配对样本中的一个代表病人样本集,每个点代表一个审讯probeset。图的对角线是离群值线表明患病率的差异之间的几何平均数的表达比DNMC和MC样本。(c)集群系统树图表达式的值的黑素细胞样本。纵轴显示的欧几里得距离完成连杆作为衡量样本之间的相似程度。水平轴包含所有样本;标签样本数据,黑色素细胞来源于正常皮肤;B-labeled样本数据,来自发育异常的黑色素细胞痣。计算指数(0.997)指数(0.02)表明,集群是高度可再生的。

我们考虑的可能性在我们的黑素细胞样本集,小但平行影响组或组基因之间可能存在内共同行动的途径。这样我们就不会那么多识别个人DNMC标记基因差异表达,而是获得一个生物过程在DNMC特异表达的印象。我们旨在揭示基因是高度相关的,当放置在一个大的基因相互作用网络,即使单独显示小的微分表达式。我们继续分析为每一对DNMC和MC从一个病人,官能团的基因差异表达。顶部去类被功能类评分的差异表达DNMCs MCs相比,表中列出1(a)。在前代表去类“organellar核糖体,”“线粒体核糖体,”“氢离子转运体活动,”“prefoldin复杂,”和“cAMP-dependent蛋白激酶调节活动。”表1(b)礼物前5的细节去类18套DNMCs和MCs之间的差异表达。基因在每个类都有一个值< 0.05。额外的比较之间的基因表达数据统计分析整个组18 DNMCs和18名正常MCs没有产生明显差异表达基因(数据未显示)。

(一)


	去类¹	去的术语²	去描述	数量的基因	LS排列	KS排列
	去类¹	去的术语²	去描述	数量的基因	价值³	价值⁴

1	313年	CC	Organellar核糖体	30.		0.0120303
2	5761年	CC	线粒体核糖体	30.		0.0120303
3	15078年	曼氏金融	氢离子转运体活动	94年
4	16272年	CC	Prefoldin复杂	13	0.0003082	0.001475
5	8603年	曼氏金融	cAMP-dependent蛋白激酶调节活动	9	0.0006046	0.0080679
6	4164年	曼氏金融	Diphthine合酶活性	5	0.0006262
7	8629年	英国石油公司	诱导细胞凋亡的细胞内信号	17	0.0006292	0.0060299
8	79年	英国石油公司	调节细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶活性	30.	0.0009682	0.0006918
9	8022年	曼氏金融	蛋白质糖基绑定	28	0.0010178	0.0332401
10	30274年	曼氏金融	LIM域绑定	5	0.0027241	0.0278159
11	17182年	英国石油公司	Peptidyl-diphthamide新陈代谢	8	0.0031029	0.001998
12	17183年	英国石油公司	从peptidyl-histidine Peptidyl-diphthamide生物合成	8	0.0031029	0.001998
13	18202年	英国石油公司	Peptidyl-histidine修改	8	0.0031029	0.001998
14	8428年	曼氏金融	核糖核酸酶抑制剂活性	5	0.0031816	0.0130247
15	45815年	英国石油公司	积极的调控基因表达,表观遗传	7	0.0032192	0.0187543
16	43028年	曼氏金融	半胱天冬酶调节活动	5	0.0035432	0.3403788
17	31202年	曼氏金融	RNA剪接因子活动,酯交换机制	23	0.0042451	0.0013586
18	8757年	曼氏金融	S-adenosylmethionine-dependent甲基转移酶活性	76年	0.0044728	0.0618698
19	7021年	英国石油公司	微管蛋白折叠	5	0.0046218	0.0028239
20.	8013年	曼氏金融	β-连环蛋白绑定	7	0.0048826	0.0031594
21	118年	CC	组蛋白脱乙酰酶复杂	38	0.0080248	0.0020909
22	9897年	CC	质膜外的一面	9	0.0085632	0.0021181
23	45736年	英国石油公司	负调控细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶活性	5	0.0182021	0.0028634
24	3747年	曼氏金融	翻译释放因子活动	8	0.045947	0.0046691
25	8079年	曼氏金融	翻译终止因子活动	8	0.045947	0.0046691
26	42393年	曼氏金融	组蛋白绑定	18	0.172388	0.0043185

¹26去类别发现重要的名义0.005的水平LS排列测试或KS排列测试(按LS的值排列测试)。为每个类别,下表列出了一些独特的标识符,在项目的基因数量基因列表,属于一类,和LS和KS值。
介绍了类别是有序的LS的价值测试(最小)。
²Goterm: CC:蜂窝组件,英国石油(BP):生物过程,和MF:分子功能。
³费雪(LS)统计的定义是指的是负面的自然对数适当的单基因的值单变量检验。
⁴Kolmogorov-Smirnov (KS)如果数据用于测试值是均匀分布的。

(b)


	去的术语¹ 参数	去描述	Probeset	描述²	基因符号	参数值

1	CC	Organellar核糖体	219220 _x_at	线粒体核糖体蛋白S22	MRPS22	0.0001097
2	CC	Organellar核糖体	223480 _s_at	线粒体核糖体蛋白力争	MRPL47	0.000131
3	CC	Organellar核糖体	218558 _s_at	线粒体核糖体蛋白L39	MRPL39	0.006304
4	CC	Organellar核糖体	224869 _s_at	线粒体核糖体蛋白S25	MRPS25	0.0151834
5	CC	Organellar核糖体	222775 _s_at	线粒体核糖体蛋白胶卷	MRPL35	0.0171902
6	CC	线粒体核糖体	219220 _x_at	线粒体核糖体蛋白S16	MRPS16	0.0005530
7	CC	线粒体核糖体	223480 _s_at	线粒体核糖体蛋白L44	MRPL44	0.000131
8	CC	线粒体核糖体	219819 _s_at	线粒体核糖体蛋白S28	MRPS28	0.0029398
9	CC	线粒体核糖体	217919 _s_at	线粒体核糖体蛋白L42	MRPL42	0.0303516
10	CC	线粒体核糖体	222993 _at	线粒体核糖体蛋白S37	MRPL37	0.003539
11	曼氏金融	氢离子转运体活动	213846 _at	细胞色素c氧化酶亚基VIIc	COX7C	0.0020774
19	曼氏金融	氢离子转运体活动	218484 _at	NADH脱氢酶(辅酶q) 1	NDUFA4L2	0.00585351
12	曼氏金融	氢离子转运体活动	238765 _at	腺苷三磷酸酶,H⁺运输、溶酶体13 kDa, V1亚基G1	ATP6V1G1	0.0059421
13	曼氏金融	氢离子转运体活动	209065 _at	Ubiquinol-cytochrome c reductase-binding蛋白	UQCRB	0.0171665
14	曼氏金融	氢离子转运体活动	231487 _at	细胞色素c氧化酶亚基8 c	COX8C	0.021483
15	曼氏金融	氢离子转运体活动	1552286 _at	腺苷三磷酸酶,H⁺运输、溶酶体31 kDa, V1亚基E2	ATP6V1E2	0.0279023
16	曼氏金融	氢离子转运体活动	202698 _x_at	细胞色素c氧化酶亚基IV同种型1	COX4I1	0.0380242
17	曼氏金融	氢离子转运体活动	228142 _at	Ubiquinol-cytochrome c还原酶复合体(7.2 kD)	UCRC	0.0389511
18	曼氏金融	氢离子转运体活动	220834 _at	Membrane-spanning 4-domains,亚,12	MS4A12	0.0460068
20.	CC	Prefoldin复杂	207132 _x_at	Prefoldin单元5	PFDN5	0.0086113
21	CC	Prefoldin复杂	218336 _at	Prefoldin亚基2	PFDN2	0.0225808
22	CC	Prefoldin复杂	222019 _at	Prefoldin单元6	PFDN6	0.0326926
23	CC	Prefoldin复杂	201472 _at	冯Hippel-Lindau结合蛋白1	VBP1	0.0345687
25	CC	Prefoldin复杂	205963 _s_at	DnaJ同族体,亚科,成员3	DNAJA3	0.04568034
26	曼氏金融	氧化还原酶活性	207843 _x_at	细胞色素b5型	CYB5A	0.01245134
27	曼氏金融	氧化还原酶活性	1560609 _at	晶状体蛋白泽塔(醌还原酶)——1	CRYZL1	0.0496658

¹不同GOterms: CC:蜂窝组件;MF:分子功能;英国石油(BP):生物过程。
²发现差异表达基因参数值小于0.05的前5名的类别。
他们命令的参数与去类别为每个类相关联的值。

3.2。验证基因的差异表达类

并不是所有的基因属于一定阶级一定会去展览DNMC和MC样本之间的微分表达式。随后验证和评估个体基因是否确定去类差异表达在DNMC MC相比,我们选择了14个基因在前4类,分析qPCR表达水平的样本组。表2概述的14所选基因进行验证和相应的qPCR引物序列。图2显示了5 qPCR结果的验证基因(MRPL42,PSMD10,HSPD1,MRPL47,MRSP22)表达式描述为基因表达的比率在MC DNMC相应的表达式(垂直轴)策划/样本为所有18个样本(水平轴)。似乎每个病人不同,基因差异表达基因表达是增加或减少在DNMC相比MC为所有审讯搭配黑素细胞样本集;这种模式是观察到的所有5个不等的基因。一些特定的患者样本显示增加表达高于其他样本集,也显示增加表达式(样本8018;表达式PSMD10和MRPL47),但一个一致的微分表达式模式类似的所有五个基因没有被观察到单个样本。这种异构的微分表达式模式DNMC MC在18个样品相比,似乎符合微阵列表达的观察分析。


	基因	去描述	正向引物(5′3′)	反向引物(5′3′)

1	MRPS22	Organellar核糖体	GAACTGAAGCCACCAACCTATAAG	GCTGCCTCAACTGCCTGTC
2	MRPL42	Organellar核糖体	TCCAGTCCAAAATGGAGCTT	CCACAGAAGGGTGGTAGCAT
3	MRPL47	Organellar核糖体	ACCTGGTGCTTGGAGAAGAGAC	CACATAAGGCAAGGCAAAGAATCG
4	MRPL21	Organellar核糖体	GAGCCGAGATAGCTTCCTGA	CTCCTTCCCATTGGTTCTCA
5	MRPL7	Organellar核糖体	ACGCTTTGATTGCTCGATCT	TTGCCTCTTTGAAGCGTTTT
6	MRPL10	Organellar核糖体	GCAGAACAAGGAGCATGTGA	TTTCAGCCACCATGTCTTCA
7	MRPL17	Organellar核糖体	CACTCGTGAAACTGCTCAGG	CGTCGGAATGGTACACACTG
8	NDUFS1	氢离子转运体活动	TGCCCTAACCTCTAAGCCCTATG	ACTTCCAACCGCATCCATTACATC
9	NOX1	氢离子转运体活动	GCCTCCATTCTCTCCAGCCTATC	CACATACTCCACTGTCGTGTTTCG
10	ACADM	线粒体	AGCCTTTACTGGATTCATTGTGG	ATTCCTCTAGTATCTGAACATCGC
11	HSPD1	Prefoldin复杂	TACTGGCTCCTCATCTCACTCG	TGCTCAATAATCACTGTTCTTCCC
12	PSMF1	Prefoldin复杂	AACACCTGGGTGACTTCCAC	CCCACTGCTCATGGATAGGT
13	PSMB9	Prefoldin复杂	CGGGCGGGAGCACCAACC	GCAGACACTCGGGAATCAGAACC
14	PSMD10	Prefoldin复杂	AGGTGCTCAAGTGAATGCTGTC	TGTAGCCTCATAATGGTCCTTAGC

3.3。蛋白质组的分析从发育异常的黑色素细胞痣和正常皮肤

18与黑素细胞样本集,来源于发育异常的痣或正常皮肤,另外进行质谱分析来评估是否黑素细胞样本群体间存在蛋白表达差异。图3显示了一个代表性的例子表达的蛋白质的MC(可视化为绿色signal-Cy3)和相应的蛋白表达在DNMC (signal-Cy5可视化为红色)。染料交换实验控制染料标记效率上执行各种样本表明,没有大效率存在差异两种染料(数据未显示)。每一个2 d消化凝胶包含平均2205点,90%的这些斑点是可再生的凝胶至少15集。蛋白质斑点()之间的差异表达正常和非典型黑色素细胞在凝胶至少15集由统计分析被切除,随后MALDI TOF / TOF分析。数据库挖掘导致70年的注释蛋白质(参见表1可作为补充材料在网上http://dx.doi.org/10.1155/2012/981308)。额外的统计分析了16个最差异表达蛋白(≥2,叠化表达区别DNMC和MC)(表3)。


Swiss-prot id	蛋白质的名字	Mol.质量计算(Da)¹	奥林匹克广播服务公司。²	钙。³	% Pept。报道⁴	比 (DNMC / MC)⁵	价值	通用函数

Q9Y2R9	核糖体蛋白S7	22113年	10.09	10	43	0.1310	0.010946	平移伸长

P32969	核糖体蛋白L9	21964年	9.96	9.96	29日	0.22334	0.016167	平移伸长

P78417	谷胱甘肽S-transferaseω1 - 1	27833年	6.23	6.24	21	0.23627	0.013815	展品glutathione-dependent硫醇转移酶和dehydroascorbate还原酶的活动

P62753	核糖体蛋白S6	28842年	10.9	10.85	23	0.31890	0.012139	控制细胞生长和增殖的选择性翻译特定类的信使rna

O75947	ATP合酶H⁺运输、线粒体F0复杂,亚基d	18537年	5.21	5.21	41	0.32135	0.027965	从ADP线粒体膜ATP合酶产生ATP

P04792	热休克蛋白27	22427年	7.83	5.98	57	0.36622	0.023047	参与组织压力阻力和肌动蛋白

P02794	铁蛋白重链	21252年	5.3	5.08	46	0.40067	0.006873	商店在可溶性铁,无毒,现成的形式。重要的铁内稳态

Q59EQ2	蛋白质酪氨酸3-monooxy-genase /色氨酸5-monooxygenase激活	28179年	4.76	4.73	26	0.41836	0.012436	氧化还原酶

P08670	波形蛋白	53710年	5.06	5.06	43	0.4478	0.023374	波形蛋白是第三类中间丝

P07355	膜联蛋白A2	36631年	8.32	7.56	53	0.47142	0.00642	可能参与热应力反应

P47985	细胞色素单元Rieske b-c1复杂	29934年	8.55	6.3	5	0.47725	0.008578	组件的ubiquinol-cytochrome c还原酶复杂

Q5U0F4	真核翻译起始因子3	36878年	5.38	5.38	32	3.2155	0.018194	蛋白质合成

O94844	GTP-binding Rho-like cdc42蛋白	20123年	5.25	4.83	55	2.88699	0.017896	蛋白质可能在小GTPase-mediated信号转导中发挥作用和肌动蛋白丝的组织系统

P07237	Prolyl 4-hydroxylase	57480年	4.76	4.69	46	2.79651	0.009987	这个多功能蛋白质催化形成、破损和重排的二硫键

Q6IBR6	acetylhydrolase Platelet-activating因素	25569年	5.57	5.57		2.46963	0.008975	脂质代谢过程

Q9UBS4	DnaJ (Hsp40)同族体亚B	40774年	5.81	5.81	30.	2.33737	0.011076	结合直接展开为ERAD蛋白质基质和展开新生肽链

¹计算蛋白质的分子质量道尔顿(Da)。
²等电点(在这项研究中观察到。
³ 计算根据吉祥物数据库。
⁴肽百分比覆盖率。
⁵蛋白质比从发育异常的黑色素细胞痣(DNMC) /正常皮肤中的黑色素细胞(MC)。

其中16个蛋白质,波形蛋白的表达降低,增加GTP-binding Rho-like DNMC CDC42蛋白表达;这些蛋白参与调控细胞的形状和形态。此外,glutathione-S-transferaseω和酪氨酸3-monooxygenase、蛋白质参与细胞解毒过程,发现在较低水平表达比MC DNMC。蛋白质,参与蛋白质代谢(prolyl 4-hydroxylase,真核翻译起始因子3)我们发现在DNMC高表达。

蛋白表达数据之间的评估是否存在重叠和RNA表达数据,我们问了16个最相似的表达模式存在差异表达蛋白质在mRNA水平。对于每一个成对样本组DNMC和MC,相应的基因表达叠化计算。叠化的表达式值< 1.5为所有探针集和一个一致的模式在基因表达的增加或减少特定基因在所有样本不能观察(数据未显示)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们比较了全基因组基因表达和蛋白质的表达模式源自发育异常的黑色素细胞痣(DNMC)和来自邻近正常皮肤黑色素细胞(MC)从18岁的病人。我们旨在发现基因和蛋白表达的改变通知我们关于生物过程底层黑色素瘤的最早阶段发展。我们的研究结果表明,使用微阵列基因表达差异来衡量之间的黑色素细胞来源于正常皮肤和发育异常的痣都很小。公正的基因表达数据的本体分析发育异常的痣和正常的黑色素细胞从一个病人使我们去揭示差异表达类;其中包括“organellar核糖体”、“线粒体核糖体,”“氢离子转运体活动,”“prefoldin复杂,”和“cAMP-dependent蛋白激酶调节活动。“这些类反映管制DNMC的代谢活动和增长与MC相比,一个因素可以导致细胞活性氧的积累水平。

我们也旨在确定DNMC蛋白质表达差异,黑色素细胞来源于正常皮肤。比较两个黑素细胞样品组之间的蛋白质概要文件导致16显著差异表达的蛋白质。低表达的细胞骨架蛋白在观察DNMC波形蛋白和膜联蛋白等,这可能是与形态学改变DNMC观察到文化相比,黑色素细胞来源于正常皮肤(7]。蛋白高表达DNMC包括真核翻译起始因子3,GTP-binding Rho-like CDC42蛋白,prolyl 4-hydroxylase, acetylhydrolase platelet-activating因素,和DnaJ同族体亚这些蛋白参与蛋白质合成,蛋白质折叠、代谢以及脂质代谢和细胞形状组织(16,17]。

我们没有观察到一个重叠的16个差异表达蛋白质微阵列基因表达数据,一个清晰的模式在mRNA表达所有18个样本集不存在。这可能与整个小微阵列数据中发现的基因表达差异。信使rna和蛋白质丰度之间的不同被发现在许多基因组和蛋白质组学研究相结合。尽管如此,在差异表达蛋白质有几个参与翻译和增长,一个功能类的蛋白质基因表达分析中还发现了。

在这项研究中,黑色素细胞分离得到病人活检样本和扩大在文化获得足够的材料基因表达和蛋白质组分析。细胞培养,虽然短,但在这些细胞信使rna和蛋白质含量的影响。然而,相对数量的黑色素细胞在表皮会太小,变量在痣和正常皮肤样品允许类似的整个组织样本的比较分析。显微解剖的发育异常的痣和正常皮肤活检样本之前RNA和蛋白质分离将确保孤立的黑素细胞的数量,但这并不会产生足够的材料类型的芯片和蛋白质组分析进行描述研究。技术孤立单一melanocytic细胞并执行全转录组和蛋白质组分析还没有提供给我们,如果目前可行的。显然,先前存在的生物的一个子集之间的转录组和蛋白质组的差异DNMC和MC可能无法发现在这项研究中,使用的方法培养的影响可能淹没在表达更微妙的差别。然而,任何基因和蛋白质表达差异可能引起的培养,将可比MC和相同的文化程序以来DNMC随访所有DNMC和MC文化除了收获的文化在同一通道数字相同的收获方法。此外,相比我们有DNMC和MC来自同一病人从单一损伤和身体网站最大化可比性。尽管短期文化的影响这两种类型的细胞,这些细胞之间的比较可能会因此产生有意义的结果。

对于许多基因和蛋白表达分析研究建立肿瘤细胞系和良性的主要细胞往往比较分析。在这项研究中early-passage文化使用和比较与良性细胞相同的病人进行隔离的附近lesional发育异常的细胞。这种方法,结合这一事实表达发育异常的模式,而不是恶性细胞良性细胞相比,可能也提供了一个解释的相对有限范围表达式,我们观察到的差异。

黑素细胞的文化中,我们做了额外的观察代表MC和DNMC文化为了找出两者之间的差异是否存在黑素细胞组。后直接电镀的表皮单一细胞悬浊液,从发育异常的黑色素细胞痣不显示细胞死亡速率的差异或板坚持比正常皮肤中的黑色素细胞。此外,DNMC和MC没有显示显著差异在播种时增殖率等于密度在6通道4 w盘子和每天数为7天。然而,DNMC文化接受衰老后长时间在正常的文化MC文化继续增殖。除了温和但一致的细胞形态学差异DNMC MC观察,尤其是与树突的形状有关。一起这些发现与先前的电子显微镜研究揭示协议DNMC线粒体膨胀而不是在MC以及高架ROS水平测量DNMC MC(相比6,7]。

直到现在,比较基因表达和蛋白表达的研究很少关注发育异常的痣。通常,发育不良痣或正常皮肤中的黑色素细胞都包含在大型表达研究针对黑色素瘤发展的后期,包括黑色素瘤样本(18- - - - - -20.]。在一个全面的基因表达研究,包括活检从正常皮肤和发育异常的痣,除了径向和垂直增长阶段黑色素瘤和黑色素瘤转移,这是发现发育异常的痣不是从正常的痣不同在很大程度上基于基因表达谱(21]。尽管发育异常的痣显示高扩散基因的表达与正常的痣和黑色素瘤显示类似的分子特性垂直增长阶段,他们在基因表达谱显示显著的异质性。现在我们的研究结果表明,差异从发育异常的黑色素细胞痣与黑色素细胞从正常皮肤也温和。

蛋白表达的研究类似的程度通常旨在识别变化发生在晚期黑色素瘤发展阶段;最近,发现6.1%的发育异常的痣核与正常的1.2%,良性的痣细胞核染色阳性minichromosome维护(MCM)蛋白2、多肽属于MCM的蛋白质家族参与DNA复制和被认为是影响预后的有用的细胞增殖标记类似ki - 67 (22]。相比之下,49.1%的核主要皮肤黑色素瘤染色阳性。此外,早期研究发现积极的细胞周期蛋白D1-nuclei染色在0.34%,5%,和7.75%,阳性细胞周期蛋白D3-nuclei染色在1.8%,6.4%,17.8%,正常的痣,分别发育不良痣和黑色素瘤活检部分(23]。这些观测表明,蛋白质的表达差异,增殖细胞也可能限制DNMC MC相比,而最重要的蛋白质表达的差异仍比较发育异常的痣与黑色素瘤的主要阶段。

然而,最近的一项研究发现,HLA类我重链β2 m和HLA II级β链表示在8.6%的正常调查,良性的痣和72%的非典型melanocytic病变,在表达水平与程度的细胞异型性和形态障碍(24]。进一步验证所选的目标从我们的列表中差异表达的蛋白质可能会进一步确认是否特定的蛋白质也显示显著差异表达DNMC相比正常皮肤中的黑色素细胞。

因为一些发育异常的痣承担更多的分子相似性正常同行,而其他发育异常的痣更像是更高级的原发性黑色素瘤基因表达的模式(21),这可能是不足为奇的整体表达模式DNMC是异构的。DNMC之间发生分歧和黑色素细胞从正常皮肤组织可能是特定的,只有一个子集的独家发育异常的痣和潜在的相关等级的异型性。这种表达差异的发生也可能部分取决于历史的生成原始的良性的痣;从发育异常的黑色素细胞痣,容易发展到黑色素瘤可能是更“影射”转换之前最初的痣形成阶段相比,黑色素细胞,这可能显示发育异常的特点,但更限制他们可能发展为恶性肿瘤。这将是一个挑战,设计实验方法,可以更准确地描述基因表达改变典型的发育异常的痣,鉴于细胞组成的异质性和基因表达模式。小说单细胞测序方法或测序microdissected病变可能部分地解决其中的一些挑战。

Melanocytic细胞特别容易氧化DNA损伤导致细胞代谢过程,如黑色素生物合成特定于这些细胞暴露于UVA辐射。管制的表达蛋白质参与至关重要的氧化应激管理途径在发育异常的黑色素细胞痣可以是有害的,可能导致对恶性肿瘤的进一步发展。最近外显子组黑色素瘤的分析表明,大约有9%的司机突变是G > T颠换反映氧化DNA损伤的相关性作为诱变力在黑色素瘤的发展25]。通过蛋白质组学方法,我们发现了几个蛋白质差异表达从发育异常的黑色素细胞痣与黑色素细胞从正常皮肤。值得注意的是,蛋白质参与整个线粒体呼吸电子传递链和氧化磷酸化过程显示,DNMC表达减少。参与氧化还原蛋白质的表达减少,细胞骨架组织和蛋白质折叠也观察到。一些蛋白质显示显著更高层次的表达DNMC参与蛋白质代谢,脂质氧化,积极调节炎症反应、蛋白质重折叠。差异蛋白表达的模式比较分析取得了,可能表明DNMC确实是暴露于高浓度的氧化应激由于自己的放松管制的细胞代谢过程,特别是线粒体氧化磷酸化,另外因蛋白质错误折叠,和细胞骨架组织。是哪个(epi)基因改变引起的氧化应激在发育异常的发生在黑色素细胞痣以及这些集合的改变是否可以识别发育异常的痣细胞是重要的问题仍有待阐明。

5。结论

全基因组表达分析来自发育异常的黑色素细胞痣(DNMC)和正常皮肤中的黑色素细胞(MC)导致显著差异表达“organellar核糖体,”“线粒体核糖体,”“氢离子转运体活动”和“prefoldin情结”基因本体类、整体基因表达两种黑素细胞组之间的区别是相对较小。MRPL42、PSMD10 HSPD1 MRPL47,MRSP22是顶级类;验证这些基因显示一个异构的微分表达式模式在DNMC和MC样本。蛋白质组学分析显示差异表达蛋白质相比,DNMC MC与一个角色在细胞新陈代谢,排毒,细胞骨架组织流程。这些结果表明可能的放松管制的过程,如代谢和蛋白质合成的黑色素细胞发育异常的痣;这是符合观察氧化应激水平升高,可能会导致这些细胞DNA氧化损伤。还需要进一步的研究来验证识别差异表达蛋白质。此外,调查这组(epi)基因改变下管制的细胞过程,导致oxidiatve压力,以及这些畸变能具体地识别是否发育不良的痣细胞是必要的。

作者的贡献

l·高和f·a·范Nieuwpoort贡献同样这项工作。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢Pieter van der Velden和Remco Dijkman整个研究富有成果的讨论。教授w . j .魔椅(病理学系,免费大学医学中心,阿姆斯特丹,荷兰)被公认为切除的组织病理学分析痣。f . a . v . Nieuwpoort支持荷兰科学研究组织(批准号015.001.060)和由荷兰癌症协会(批准号rul2003 - 2805)。n . a . Gruis是收件人的荷兰阿斯帕西娅联谊组织科学研究。

补充材料

来自发育异常的黑色素细胞痣(DNMC)和正常相邻皮肤(MC)的18个不同的患者进行质谱分析,以找到与两黑素细胞样本之间的差异表达蛋白质组。质量指纹和MS / MS数据对人类蛋白质数据库搜索,导致70年的注释蛋白质。

补充表

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