H3K79me3T80ph是一种新型的组蛋白双重改性和黑色素瘤的有丝分裂指示器

文摘

当前的研究特征mitosis-associated组蛋白双重修饰组蛋白H3的核心:trimethylation的组蛋白H3赖氨酸79年和80年同时H3磷酸化的苏氨酸(H3K79me3T80ph)。通过使用蛋白质和microscopy-based技术,我们发现H3K79me3T80ph股票类似的空间和时间监管H3S10ph但另外需要甲基转移酶的活动。此外,我们发现极光激酶活性的催化H3K79me3T80ph是必要的在活的有机体内。最后,我们使用组织微阵列分析H3K79me3T80ph表明H3K79me3T80ph标志的一个子集主要皮肤黑色素瘤转移性潜在表明H3K79me3T80ph可能识别侵入性黑色素瘤的一个子集更积极的临床行为。

1。介绍

核小体是染色质的基本单位;它由核心组蛋白八聚物的蛋白质(2分子的H3, H4, H2A、H2B) DNA包装。核心组织蛋白的特点是一个非结构化的氨基端尾组蛋白折叠图案。赖氨酸残基上可以mono -组蛋白H3, di -或trimethylated (me1 me2, me3 resp),与大多数的H3甲基化标记驻留在n端尾H3 (1]。然而,赖氨酸甲基化也可以发生在一个暴露的区域组蛋白H3核心赖氨酸79 (H3K79) [2]。DOT1 H3K79甲基化是催化,已经涉及到在酵母和哺乳动物细胞循环调节(2- - - - - -5]。H3的尾巴,三个methylatable赖氨酸谎言毗邻残留物被发现是磷酸化在有丝分裂期间,T3 / K4、K9 / S10和K27 / S28 [6- - - - - -8]。然而,目前尚不清楚在什么能力赖氨酸甲基化和邻近的磷酸化发生一起在有丝分裂或这些methyl-phospho修改的角色是什么。

组蛋白H3的核心,methylatable K79谎言毗邻苏氨酸80年被发现,在一个质谱仪屏幕,磷酸化(H3T80ph)在成年小鼠大脑的分析(9]。据我们所知没有直接报道报道H3T80磷酸化(有或没有邻近的K79甲基化),这第一个考试的组蛋白组成的双重改性H3K79 trimethylation和H3T80磷酸化(H3K79me3T80ph)在染色质环境中。使用单克隆抗体识别H3K79me3T80ph推定地,我们发现H3K79me3T80ph主要是与有丝分裂染色体相关联。然而与H3S10ph H3T80ph似乎没有催化的极光。最后,用一个组织微阵列我们发现H3K79me3T80ph标签的一个子集主要皮肤黑色素瘤转移性的潜力。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

培养UCD-Mel-N和IIB-Mel-N细胞已经先前描述的10]。海拉细胞生长与10%胎牛血清的DMEM补充。细胞同步化实验,细胞治疗0.1μ克/毫升的秋水仙胺(罗氏)16小时和10μM MG132过去3小时的治疗。有丝分裂细胞然后由有丝分裂摆脱孤立。ZM评选447439(恩佐生命科学)为0.5,1和2μm . ZM447439与秋水仙胺结合使用时,添加治疗同时孵化了16个小时。

2.2。组蛋白纯化

组蛋白被酸提取分离(如前所述)(11]。

2.3。抗体

Antitrimethyl (K79)磷(T80)组蛋白H3,克隆MC491(微孔)称为H3K79me3T80ph;anti-H3S10ph (Abcam);anti-Histone H3 (Abcam);anti-H3K79me3 (Abcam);anti-H3K79me2 (Abcam);anti-Tubulin (Abcam);anti-Cyclin B1 (Abcam);anti-Actin (Abcam)。

2.4。肽

生物素化的肽氨基酸序列同源性组蛋白H3 71 - 88生成,和肽序列如下:Biotin-Val-Arg-Glu-Ile-Ala-Gln-Asp-Phe-Lys-Thr-Asp-Leu-Arg-Phe-Gln-Ser-Ser / Ala-Ala-OH。修改的,K79T80ph K79me2T80, K79me2T80ph肽是由Genemed合成。K79me1T80、K79me3T80 K79me3T80ph被凯克生成生物资源实验室,耶鲁大学。H3(21)和生物素化的H3(21)磷的(S10)商用(Anaspec)。

2.5。西方墨点法

西方墨点法进行如前所述[12]。

2.6。免疫荧光

如前所述(执行免疫荧光12]。荧光图像获得使用Axio成像仪M1显微镜和AxioCam MRm相机利用AxioVision Rel。4.6.3软件(卡尔蔡司,Inc .)。

2.7。肽的竞争

25μ克acid-extracted组蛋白sds - page和被分级分离转移到硝酸纤维素(Bio-Rad)。15μ每个肽与H3K79me3T80ph preincubated M抗体1小时。膜被孵化与抗体/肽混合物1小时,和西方墨点法完成使用标准协议。

2.8。肽点污点

越来越多的肽(50、100、150、200和250 nmol)被转移到PVDF膜(通用电气医疗集团生命科学)点状仪器的使用。H3K79me3T80ph西方墨点法完成使用标准的方法。证明平等肽发现,膜与Avidin-HRP孵化,广泛地洗,发现使用ECL检测设备(Denville科学)。

2.9。流式细胞术

海拉细胞被孤立为每个流式细胞术的反应。细胞被固定在1%甲醛和用PBS洗净,并存储在70%乙醇−20°C 24小时。固定细胞permeabilized triton - x - 100为0.1%与3% BSA在PBS PBS和阻塞。主要抗体是孵化1小时在1% BSA,后跟一个30分钟的孵化和Alexa萤石- 488二级BSA抗体(英杰公司)的1%。为propidium碘染色细胞孵化10分钟和0.1毫克/毫升核糖核酸酶沾10μ克/毫升propidium碘。所有的反应都是悬浮在分析前1毫升的水。

细胞分析血细胞计数和细胞排序核心(贝勒医学院),使用LSRFortessa (BD生物科学)。数据从20000年事件进行了分析使用FloJo软件(树明星Inc .)。数据酒吧代表均值(±S.E.M),。使用学生的统计分析以及;结果被认为是重要的如果。

2.10。在体外激酶化验

6 ng Aurora B / INCENP(微孔)添加到反应缓冲区(20毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,1毫米EGTA, 10毫米MgCl,氟化钠1毫米,0.1毫米Na₃签证官₄1毫米德勤,50μ与30 M ATP)μM肽和5μCi的γ- - - - - -³²P-ATP (2500 Ci /更易与特定的活动;珀金埃尔默),然后孵化为30分钟30°C。反应停在3%磷酸的加入,和产品被抓获P81硝基过滤器(微孔)。P81过滤器在0.75%磷酸和甲醇洗和随后的化验³²P闪烁计数。

2.11。黑色素瘤组织样本和数组

机构审查委员会批准后的人类课题研究,formalin-fixed石蜡包埋组织获得的档案病理学系的部分皮肤病理学在德克萨斯大学MD安德森癌症中心。87年melanocytic病变包括获得良性的痣(10病变),主要皮肤黑色素瘤没有转移(25个病灶)和原发性皮肤的黑色素瘤和转移(19个病灶)和转移性黑色素瘤(33病变)。所有原发性黑色素瘤的组织微阵列分析(TMA)分别从区域从原来的病变,因此没有局部复发。所有诊断都由dermatopathologist呈现。如前所述(执行组织阵列结构13]。

2.12。免疫组织化学

进行了免疫组织化学研究(如前所述)(12]。H3K79me3T80ph抗体使用1:100稀释。

2.13。统计分析黑色素瘤组织的数组

anti-H3K79me3T80ph阳性细胞的数量(mitotically活跃细胞和细胞斑点核模式)每黑色素瘤组织中的大功率字段数组被两个dermatopathologists得分(j . l .咖喱c . Torres-Cabala)。标签被列为没有标签,强度弱,温和的和强大的。H3K79me3T80ph阳性细胞的平均数量之间的关联和分类变量检查使用方差分析(JMP软件,卡里)。结果被认为是重要的如果。重要性水平没有调整的多重比较。

3所示。结果与讨论

3.1。H3K79me3T80ph专门承认Trimethylated赖氨酸和苏氨酸磷酸化抗体

尽管双重改性H3K79meT80ph已经提出,这一修改的抗体是商业上可用的,据我们所知没有研究已经报道了这一修改(14]。因此,我们开始实验,旨在确定抗体的特异性。代表18种氨基酸,生物素化的多肽的H3(残留71 - 88)和包含不同等级的赖氨酸甲基化赖氨酸79 (H3K79)的存在和没有在80苏氨酸磷酸化生成(H3T80)(图1(一))。的肽进行了竞争分析H3K79me3T80ph抗体是未经处理的(没有肽)或preincubated H3肽包含修改K79me3T80ph, T80ph或S10ph。抗体/肽混合物被用来执行提取组蛋白免疫印迹。完全丧失在观察信号肽包含K79me3和相邻T80ph表明抗体是双重H3K79me3T80ph非常具体的修改(图1 (b))。H3T80ph肽抗体绑定成功竞争,表明抗体也可以识别H3T80ph(图1 (b))。看到H3T80ph孤独的存在可以防止组蛋白的抗体识别,我们接下来研究的程度H3K79me3T80ph抗体与肽反应包含不同层次的K79甲基化与磷酸化T80毗邻。包含T80ph单独增加摩尔量的肽,结合mono - di -或trimethylated K79 (K79me1T80ph、K79me2T80ph K79me3T80ph resp),被发现在硝基和受到H3K79me3T80ph西方墨点法。H3K79me3T80ph抗体与K79me3T80ph肽(图有最强的免疫反应性1 (c))。此外,H3K79me3T80ph抗体反应更强烈的K79me3T80ph比T80ph肽肽,这表明竞争看到T80ph肽的肽竞争可能在免疫印迹试验敏感性下降的结果。确保H3K79me3T80ph抗体不承认赖氨酸甲基化在缺乏相邻T80磷酸化,重复点污点分析比较K79me3T80ph肽单独含甲基化K79(图1 (d))。H3K79me3T80ph抗体再次显示了一个非常具体的与K79me3T80ph肽免疫反应性,没有对肽只包含甲基化K79反应。

3.2。H3K79me3T80ph主要发生在增殖细胞

相比我们接下来H3K79甲基化H3K79me3T80ph模式在不同的人类黑色素瘤细胞系:衰老黑色素细胞。免疫印迹分析H3K79me2和H3K79me3确定细胞系H3K79甲基化(图的具体模式2(一个))。这种分析还透露,H3K79me3和H3K79me3T80ph不分享类似的模式出现,表明这些修改是不同监管(图2(一个))。类似的模式在正常的人类黑色素细胞(NHMs),在H3K79me3被发现出现在增殖和衰老NHMs而H3K79me3T80ph只是检测在增殖NHMs(图2 (b))。这个数据显示H3K79me3T80ph与细胞增殖有关;然而,H3K79me3T80ph A375察觉,SK梅尔93.3,黑色素瘤细胞系SK梅尔110年,UCD-Mel-N搭配H3T80ph [15,16]。

3.3。H3K79me3T80ph是细胞周期调控

鉴于H3K79me3T80ph只检测到在增殖细胞中,我们试图确定是否细胞循环H3K79me3T80ph监管。海拉和人类黑色素瘤细胞系UCD-Mel-N IIB-Mel-N同步在有丝分裂和秋水仙胺或车辆治疗(17,18]。证实了同步整个细胞的细胞周期蛋白B1免疫印迹提取(图2 (c))。H3K79me3T80ph水平被免疫印迹检测不到异步人群但与秋水仙胺在有丝分裂同步显著增加,表明H3K79me3T80ph确实是监管cell-cycle-dependent方式(图2 (c))。

期间的动力学H3K79me3T80ph通过流式细胞仪分析细胞周期。H3K79me3T80ph海拉细胞被间接染色,propidium碘是用来确定DNA含量。细胞循环阶段的基于他们的DNA含量,和H3K79me3T80ph-positive细胞的比例确定。流式细胞仪分析显示和年代阶段基本检测不到H3K79me3T80ph-positive细胞水平(0.03%和0.06%,分别地。),而H3K79me3T80ph-positive细胞的数量明显增加到7.6% (= 0.0014,= 0.0016;数据3(一个),3 (b))。验证有丝分裂同步与秋水仙胺H3K79me3T80ph-positive细胞的数量增加,流式细胞术在异步和反复比较H3K79me3T80ph直方图秋水仙胺治疗人群。H3K79me3T80ph-positive细胞的比例人口增加与秋水仙胺在有丝分裂同步,导致积极的转变H3K79me3T80ph直方图(数据没有显示)。

3.4。H3K79me3T80ph主要是与有丝分裂染色体相关联

建立了H3K79me3T80ph相关的,我们接下来检查它的本地化在体外。细胞免疫荧光的H3K79me3T80ph UCD-Mel-N表明H3K79me3T80ph主要是在有丝分裂(图与染色质3 (c))。点状的H3K79me3T80ph染色也观察到细胞不凝结的DNA(图3 (c)第一个面板)。

H3S10ph组蛋白的化学修饰是一个被充分研究过的有丝分裂,似乎类似动态H3K79me3T80ph坚持直到后期染色体(7]。来洞察H3K79me3T80ph的规定,我们比较了时空的监管H3K79me3T80ph H3S10ph。Coimmunofluorescence UCD-Mel-N细胞表明H3K79me3T80ph和H3S10ph colocalize完全在有丝分裂(图3 (d))。这个colocalization也发生染色体缩合之前,表明,像H3S10ph H3K79me3T80ph出现在晚了(7]。

3.5。Aurora B H3K79me3T80ph的催化作用是必要的

Aurora B是一个很好的描述有丝分裂激酶催化氨基端H3有丝分裂磷酸化在H3S10ph H3S28ph [7]。看到,H3K79me3T80ph似乎H3S10ph共享相同的监管模式,我们检查了如果Aurora B参与H3K79me3T80ph监管,培养在秋水仙胺和ZM447439海拉细胞,一个强有力的Aurora B抑制剂(19]。秋水仙胺治疗仅导致一个健壮的H3K79me3T80ph信号;然而,这种检测是ZM447439的存在(图4(一))。据报道之前,尽管ZM447439抑制Aurora B细胞治疗仍然可以退出有丝分裂与正常动力学(19]。细胞周期蛋白B1整个细胞从细胞中提取的蛋白质印迹对待秋水仙胺和ZM447439治疗验证细胞在有丝分裂被捕;因此,H3K79me3T80ph损失不是由于有丝分裂退出(图4(一))。

直接解决Aurora B是否能使磷酸化H3T80,在体外激酶试验进行了使用重组人类Aurora B和INCENP蛋白质重要刺激B极光激酶活性(20.]。Aurora B / INCENP孵化与生物素化的H3肽(H3 (71 - 88), H3 (71 - 88) K79me3,和H3(21))的存在³²P-ATP。的水平³²P公司是由闪烁计数,相比与冷磷酸肽孵化(H3 (71 - 88) T80ph, H3 (71 - 88) K79me3T80ph,和H3 S10ph (21)。重组Aurora B / INCENP强劲的H3磷酸化肽(21),大概在S10,但无法使磷酸化H3(71 - 88)肽程度不尽相同,肽是否修改的或trimethylated(图4 (b))。这些结果表明,极光B / INCENP T80磷酸化是必要的在活的有机体内,但不足以H3T80磷酸化的在体外缩氨酸激酶试验。Aurora B属于几个蛋白复合物和可能需要额外的蛋白质对H3T80的活动目标在活的有机体内。然而,这里使用的H3(71 - 88)肽来源于H3的核心领域,在体外,不可能拥有适当的T80磷酸化的结构或足够的残留,与H3(21)肽可能存在于一个无序的状态在体外H3的尾巴在活的有机体内使它适合Aurora B活动。

先前的报道表明,磷酸化的H3T3 Haspin大大增加对H3S10和H3S28 Aurora B活动。类似于H3T80, H3T3谎言相邻的一个很好的描述在H3K4甲基化标记;因此,我们想确定Haspin磷酸化的H3T80的能力。在体外激酶化验使用重组Haspin和生物素化的H3(21)和H3(71 - 88)进行的³²P-ATP。符合发表报告,Haspin磷酸化的H3(21)肽的能力。然而,Haspin无法使磷酸化肽H3(71 - 88),证明Haspin,像Aurora B,是不够的磷酸化H3T80(数据没有显示)。

3.6。H3K79me3T80ph是肿瘤扩散和有丝分裂的一个指标在活的有机体内

我们下一个试图确定H3K79me3T80ph染色是人类黑色素瘤样本能够检测增殖的差异使用组织微阵列。组成的数组包括87病变良性melanocytic痣,主皮肤的黑色素瘤和没有已知的转移,转移性黑素瘤。H3K79me3T80ph数组是彩色,阳性细胞/高功率计算。H3K79me3T80ph主要是观察斑点核模式和染色体mitotically活跃的细胞内的黑色素瘤部分但不是melanocytic探测的痣(数字5(一),5(b)5(c))。进一步分析表明,H3K79me3T80ph-positive细胞/高性能领域的平均数量明显高于所有子类的黑色素瘤相比,良性melanocytic痣(图5(f),)。尤其是H3K79me3T80ph-positive皮肤原发性黑色素瘤细胞的转移明显高于原发性黑色素瘤相比没有转移(图5(g),)。H3K79me3T80phpositive细胞数量之间类似的原发性黑色素瘤转移和转移性黑素瘤。分析H3K79me3T80ph转移性黑色素瘤的类别包括病例临床和组织学上代表转移和局部复发。然而,肿瘤或肿瘤复发后再次手术切除可能在某些临床情况代表转移。因为没有差别的标签H3K79me3T80ph原发性肿瘤与已知从转移性黑色素瘤转移,可以推测,主要与已知的肿瘤转移和复发肿瘤”可能会证明等量H3K79me3T80ph-positive细胞;然而,需要进一步的研究证实。的强度没有显著差异H3K79me3T80ph标签之间的黑色素瘤类别。

4所示。结论

组蛋白修饰之间的相互作用是组蛋白的基础代码假设[21]。通过使用细胞同步实验,流式细胞术、免疫荧光的研究,我们发现H3K79me3T80ph小说组蛋白双重修饰组蛋白H3的核心。H3K79me3T80ph变得发病前可见明显的染色体缩合。因此,很可能出现在双修改。这是进一步支持我们的免疫荧光研究表明H3K79me3T80p股H3S10ph一样的时间规定,这是众所周知的,在后期出现(7]。然而,我们的调查H3K79me3T80ph透露的规定,与N组蛋白H3的终点站,催化H3T80ph Aurora B是不够的在体外虽然极光激酶活性需要H3K79me3T80ph的催化作用。考虑到有许多有丝分裂激酶,H3T80磷酸化可能被一个不明身份的激酶催化,可能需要Aurora B的激活,这可以解释为什么极光激酶活性的抑制通过ZM447439治疗结果H3K79me3T80ph的损失。然而,这也是合理推测Aurora B在活的有机体内可以使磷酸化H3T80但是需要额外向H3T80目标B极光激酶活性的蛋白质。类似的实例已经观察到H3S10ph和存活素。生存素属于染色体乘客与Aurora B和INCEP复杂,和磷酸化的H3T3存活素指导Aurora B活动向H3S10ph [22,23]。然而,即使没有存活素对H3S10 Aurora B显示了活动,这对于H3T80并非如此。此外,序列周围H3K79 / T80和F78-K79-T80, Aurora B共识序列不匹配(R / K-X-S / T),这意味着Aurora B不是预测T80激酶但可能位于上游的H3T80激酶(24]。

此外,H3K79me3T80ph似乎确定皮肤原发性黑色素瘤转移性潜在的一个子集。黑色素瘤是最致命的皮肤癌,正确诊断和危险分层对治疗和预后很重要。有丝分裂率主要皮肤黑色素瘤被确定为第二个预测生存最有力的因素,肿瘤后立即(‘)厚度25]。辅助包含IHC研究H3S10ph (PHH3)已被证明是一个额外的临床工具来评估在黑色素瘤(有丝分裂26]。组蛋白H3的氨基端修改侵入性黑色素瘤的预后标志物在临床设置是新兴的;然而,特定的增殖标记作为预后指标的效用依赖上下文。例如,Ladstein等人的一项研究调查了H3S10ph (PHH3)结节性侵入性黑素瘤,发现尽管H3S10ph有丝分裂标记,它并没有证明为结节性黑色素瘤预后价值(27]。我们发现H3K79me3T80ph原发性皮肤黑色素瘤,似乎鉴别原发性和转移性黑色素瘤的一个子集的潜力。可能需要额外的研究在不同的组来确定可能的临床应用,但我们的研究结果揭示了可能使用H3K79me3T80ph作为生物标志物的鉴定主要以更为积极的临床皮肤黑色素瘤的行为。

确认

作者感谢Nikolaj季姆琴科和劳伦斯Donehower批判性阅读这手稿和提交他们的帮助。他们也感谢Denae纳什和斯科特•布林克利实验室的Slattery金伯利互联网Yu-Lee实验室的技术援助和材料。这个工作是由国立卫生研究院R01AG032135,贝勒/ MD安德森多学科研究项目(EEM), NIH T32 AG000183 (DRM),和NIH NCRR S10RR024574, NIAID AI036211和NCI P30CA125123 (BCM血细胞计数和细胞分类的核心)。

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