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t . Magcwebeba里德尔,s . Swanevelder p . Bouic p .黑黝黝的w . Gelderblom,
”<年代p一个ncl一个年代年代=”一个djust-article-svg-size">Interleukin-1
Interleukin-1
α
感应人类角质细胞(HaCaT):一个<我>在体外我>模型的化学预防皮肤
文摘
长期暴露于紫外线辐射和有毒化学物质与慢性炎症,导致皮肤癌症发展interleukin-1α(il - 1<我>α我>),结构上所产生的角化细胞,扮演一个关键作用在皮肤炎症。本研究的目的是探讨il - 1的调制<我>α我>生产HaCaT角化细胞细胞系。佛波醇12-myristate 13-acetate未能诱导il - 1<我>α我>HaCaT细胞,这可能是与特定的缺乏会影响下游MEK / ERK信号通路在这些细胞。钙离子载体、ionomycin稍有增强细胞内(icIL-1的生产<我>α我>),但这导致坏死释放浓度更高。uv - b照射显著增加icIL-1的生产<我>α我>与最大剂量依赖性的方式诱导展出24小时以最小的坏死和凋亡的影响。HaCaT细胞模型的验证表明,非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),布洛芬,和糖皮质激素地塞米松抑制icIL-1<我>α我>相关的生产,这是一个轻微的抑制细胞的可行性。角质化细胞是UV-B-induced模型提供了一个<我>在体外我>系统,除了佛波醇ester-like化合物,作为筛查试验确定利用皮肤刺激和/或治疗局部代理通过il - 1的调制<我>α我>生产。
1。介绍
炎症是一种生理反应,保护身体免受各种侮辱,如人身伤害、病原体、接触有毒化学物质,紫外线照射。急性炎症反应当治疗结果体现了很短的一段时间;然而,长期的炎症可以导致癌症发展(<一个href="#B1">1一个>- - - - - -<一个href="#B3">3一个>]。各种炎症介质被认为是发展的关键角色球员的急性和慢性反应与il - 1、TNF -<我>α我>这个过程的主要细胞因子传播(<一个href="#B4">4一个>- - - - - -<一个href="#B6">6一个>]。il - 1、TNF -<我>α我>启动信号级联,导致的基因表达和生产辅助介质,包括细胞因子和趋化因子、生长因子、粘附分子,环氧酶2型(cox - 2),诱导一氧化氮合酶(间接宾语),和其他促炎的因素。这有助于chemoattraction活性氧(ROS)的第免疫细胞在修复受损组织的援助<一个href="#B7">7一个>,<一个href="#B8">8一个>]。研究表明il - 1、TNF -的作用<我>α我>不同阶段的肿瘤发生与免疫细胞产生的活性氧主要功能化学感受器恶性转变(<一个href="#B9">9一个>,<一个href="#B10">10一个>]。的慢性激活其他继发性炎症介质功能在促进恶性肿瘤细胞的增殖和生存,也有助于他们的进展为浸润性肿瘤细胞。慢性炎症和致癌作用之间的联系表明,机遇存在调制的主要细胞因子的生产可用于开发新的抗炎药物,可以尽可能的利用化学预防剂(<一个href="#B9">9一个>,<一个href="#B11">11一个>]。
角质细胞,表皮细胞,细胞因子的生产函数作为主要因素(<一个href="#B12">12一个>]。的主要细胞因子,il - 1<我>α我>主导,因为它是既定的合成生物活性前体蛋白(proIL-1<我>α我>),而il - 1<我>β我>在不活跃的前体形式存在(<一个href="#B13">13一个>]。相比之下,TNF -<我>α我>在接触刺激诱导,在培养的角质细胞发生在非常低的水平,对炎症似乎扮演一个小角色<我>在活的有机体内我>il - 1相比,<我>α我>(<一个href="#B14">14一个>,<一个href="#B15">15一个>]。il - 1<我>α我>仍在角化细胞及其生物活性细胞相关,包括伤口愈合和白细胞招募,通过其cell-expressed表面受体调节。1型受体负责转导炎性信号,而2型抵销这些影响,常常被视为“诱饵”受体(<一个href="#B16">16一个>- - - - - -<一个href="#B19">19一个>]。il - 1<我>α我>生产的角化细胞增加了各种刺激包括佛波醇酯、uv - b照射,ionomycin [<一个href="#B20">20.一个>- - - - - -<一个href="#B23">23一个>]。由于预制il - 1<我>α我>只是被动地在细胞损伤时释放(<一个href="#B19">19一个>),各种研究利用细胞因子在炎症和致癌模型来研究分子机制参与炎症性皮肤疾病和癌症的发展推广(<一个href="#B21">21一个>,<一个href="#B24">24一个>- - - - - -<一个href="#B26">26一个>]。il - 1的调制<我>α我>也已被确认为一个有用的细胞刺激物筛查工具,和越来越多的利息这个发展的细胞因子的使用抗炎药,也可以作为chemopreventative代理(<一个href="#B27">27一个>- - - - - -<一个href="#B31">31日一个>]。
虽然il - 1的使用<我>α我>在<我>在活的有机体内我>模型更生理相关的人类,伦理问题和艰苦的过程参与使用动物看到培养角质细胞成为皮肤毒性的原型模型和化学预防研究[<一个href="#B32">32一个>- - - - - -<一个href="#B35">35一个>]。在这方面,改变了角质细胞的使用,特别是HaCaT细胞系盛行不衰,被认为是一个有效的和操作方便的替代品主要文化(<一个href="#B36">36一个>]。HaCaT细胞系已广泛应用于各种研究相关的皮肤刺激和药物开发(<一个href="#B28">28一个>,<一个href="#B29">29日一个>,<一个href="#B36">36一个>,<一个href="#B37">37一个>]。然而,最近的研究警告称,他们在药理和/或适当性毒性筛选化验,尤其是当考虑到佛波醇ester-like化合物。有人建议,这些细胞的详细描述他们的应用程序作为一个前应该进行<我>在体外我>模型(<一个href="#B38">38一个>,<一个href="#B39">39一个>]。
当前的研究寻求不同兴奋剂的适用性,包括PMA、ionomycin,钙离子载体,uv - b, il - 1<我>α我>归纳利用使之改变了keratinocytic HaCaT细胞系。的诱导il - 1<我>α我>验证了通过使用已知的抗炎药为了验证<我>在体外我>细胞模型利用作为一个筛选试验确定皮肤刺激和/或治疗局部代理。
2。材料和方法
2.1。化学药品和试剂
佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)、地塞米松、布洛芬、二甲亚砜(DMSO),牛血清白蛋白(BSA)(美国Sigma-Aldrich)。胎牛血清(的边后卫)(美国表达载体)。rpmi - 1640, Dulbeco的磷酸缓冲盐(DPBS)、谷酰胺,heat-inactivated胎牛血清,trypsin-versene,汉克的缓冲盐溶液(hbs) (Lonza、比利时)。重组人il - 1<我>α我>酶联免疫试剂盒(研发系统、美国)CytoTox 96非放射性细胞毒性试验,CellTiter-Glo发光细胞生存能力,Caspase-3/7化验(美国Promega)。Triton-x100 (BDH化工有限公司,普尔英格兰),Tween-20 (ICN生物医药公司、美国),ionomycin钙盐(Synexa、南非)。
2.2。角化细胞细胞培养
自发地在家乡的角化细胞(HaCaT)是美国人类生物学的礼物在开普敦大学,南非。rpmi - 1640细胞培养的补充与heat-inactivated胎牛血清(10%)、谷酰胺(2毫米)在湿润的气氛中5%的有限公司<年代ub>2年代ub>/ 95%空气在37°C。细胞通过每3天1:3分流比。
2.3。PMA对诱导il - 1的影响<我>α我>
2.3.1。确定最佳的细胞密度和孵化时间
HaCaT细胞被播种rpmi - 1640年媒体含有10%的边后卫(100<我>μ我>L)的密度<年代vg height="14.375" id="M2" style="vertical-align:-0.3135pt;width:54.424999px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.424999 14.375" width="54.424999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
2.3.2。细胞外(exIL-1<我>α我>)和胞内il - 1<我>α我>(icIL -<我>α我>PMA和Ionomycin)感应
细胞被播种在更高的密度(<年代vg height="14.375" id="M3" style="vertical-align:-0.3135pt;width:54.424999px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.424999 14.375" width="54.424999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
2.3.3。il - 1<我>α我>的决心
两个icIL-1<我>α我>和exIL-1<我>α我>分别在细胞溶解产物和上层清液,测定il - 1<我>α我>酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。标准准备和化验在重复五个复制每个样本的准备。吸光度测量在450 nm丹尼克斯板读者(丹尼克斯技术,美国),和数据分析使用标准曲线产生GraphPad棱镜(Windows版本5)(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。值表示为pg / mL的上层清液或细胞溶解产物。
2.3.4。细胞毒性和可行性分析(LDH释放和ATP生产)
细胞毒性测试化学品的评估通过监测LDH释放或LDH释放和ATP生产在确定PMA和ionomycin的影响,分别。LDH释放,样本分析利用比色CytoTox 96包,和吸光度测量490海里(丹尼克斯标)。LDH释放被表示为一个百分比总数的LDH释放(由一个冻融循环细胞细胞溶解)根据以下计算:<年代p一个ncl一个年代年代=”equation" id="eq1"> 决定细胞生存能力,CellTiter-Glo发光生存工具包用于监测细胞内ATP生产利用白色固体板(Porvair科学,谢伯顿,英国)。监控ATP生产、荧光素酶试剂添加和盘子旋转2分钟和孵化在黑暗中在室温下10分钟。ATP生产监控与Veritas微型板块光度计(美国Promega)。相对光的发光信号测量单元(RLU)和数据表示为一个百分比(%)控制细胞的如下:<年代p一个ncl一个年代年代=”equation" id="eq2">
2.4。UV-B-Induced il - 1<我>α我>生产、细胞毒性和细胞凋亡
细胞被播种在96孔细胞培养板的密度<年代vg height="14.375" id="M6" style="vertical-align:-0.3135pt;width:54.424999px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.424999 14.375" width="54.424999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
细胞毒性、细胞凋亡和il - 1<我>α我>确定后6、12和24小时。细胞毒性监测通过确定LDH释放如上所述。细胞凋亡,细胞与细胞裂解细胞溶解缓冲区(20<我>μ我>L)结合一个冻融循环。细胞溶解产物被转移(25<我>μ我>L)变成了一片白色的固体板和孵化与半胱天冬酶试剂(25 3/7<我>μ我>L)在室温下1 h在黑暗中。孵化后,盘子Veritas光度计板机进行分析,计算和caspase-3活动褶皱增加比控制。
2.5。炎症模型验证利用抗炎药物
细胞被播种密度<年代vg height="14.375" id="M7" style="vertical-align:-0.3135pt;width:54.424999px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.424999 14.375" width="54.424999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
2.6。统计分析
所有参数都使用Kolmogorov-Smirnof测试测试正常。集团对所有参数方差参数的均匀性进行了测试使用列文的测试。组差异对这些参数参数测试用单向方差分析在SAS (GLM)和事后图基测试,这是事后多个成对比较的所有不同的组。那些对两个或两个以上的固定参数的影响,交互条款也被调查,看看他们改进的模型适合表明主要影响的交互影响的结果。最小二乘方法(LS)被用来估计组差异,包括95%置信区间的影响和差异。Tukey-Kramer调整了自动如果数据是不平衡的。
对于非参数参数,显著组差异研究利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验,以及事后Tukey-type测试来确定不同的组。当涉及到只有两组参数比较,<年代vg height="9.125" id="M8" style="vertical-align:-0.11285pt;width:5.0124998px;" version="1.1" viewbox="0 0 5.0124998 9.125" width="5.0124998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
用SAS v9.2进行了统计分析,统计显著性被认为是5% (<年代vg height="11.25" id="M9" style="vertical-align:-0.30096pt;width:56.150002px;" version="1.1" viewbox="0 0 56.150002 11.25" width="56.150002" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
3所示。结果
3.1。il - 1<我>α我>由PMA诱导
PMA增加<我>在体外我>生产的细胞内il - 1<我>α我>在角化细胞noncytotoxic浓度(<一个href="#B21">21一个>),然而,最近的研究报道PMA-specific HaCaT缺陷细胞,但对il - 1效应还没有被证明<我>α我>生产(<一个href="#B39">39一个>,<一个href="#B40">40一个>]。目前的研究调查了调制PMA对il - 1的影响<我>α我>感应和释放,不同浓度和时间的孵化的函数。在icIL-1显著减少<我>α我>生产注意到作为时间的函数,在24小时(表记录的最低水平<一个href="//www.newsama.com/journals/jsc/2012/393681/tab1/" target="_blank">1一个>)。然而,PMA没有显著增加细胞内il - 1<我>α我>(icIL-1<我>α我>)生产的浓度和不同的时间点。PMA也不诱导细胞外il - 1<我>α我>(exIL-1<我>α我>)发布也没有表现出任何细胞毒性的影响(表<一个href="//www.newsama.com/journals/jsc/2012/393681/tab2/" target="_blank">2一个>)。
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| 细胞被播种密度的15 000个细胞/。价值观代表四个复制的平均值±标准偏差。字母上标(行)表明显著不同控制和PMA浓度;在下标字母(列)表明潜伏期显著区别。值被认为是重要的时候<年代vg height="11.25" id="M28" style="vertical-align:-0.30096pt" version="1.1" viewbox="0 0 56.150002 11.25" width="56.150002" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
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| 细胞被播种密度<年代vg height="14.375" id="M47" style="vertical-align:-0.3135pt" version="1.1" viewbox="0 0 54.424999 14.375" width="54.424999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
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3.2。Ionomycin对il - 1的影响<我>α我>生产和细胞毒性
ionomycin诱导的能力<我>新创我>合成和释放il - 1<我>α我>已经证明了在subcytotoxic浓度正常角化细胞(<一个href="#B15">15一个>]。钙离子载体促进成熟的加工和分泌il - 1<我>α我>单核细胞和巨噬细胞(<一个href="#B41">41一个>,<一个href="#B42">42一个>]。当前的研究试图描述其影响icIL-1的感应和释放<我>α我>在HaCaT细胞作为细胞生存能力的函数。Ionomycin (0.2 -10<我>μ我>增加icIL-1 g / mL)治疗<我>α我>剂量依赖性的方式增加了双重的为1.25<我>μ我>克/毫升(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jsc/2012/393681/fig1/" target="_blank">1(一)一个>)。ionomycin更高浓度(5和10<我>μ我>g / mL), exIL-1水平<我>α我>显著增加,但这是与显著相关(<年代vg height="11.25" id="M49" style="vertical-align:-0.30096pt;width:56.150002px;" version="1.1" viewbox="0 0 56.150002 11.25" width="56.150002" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
(一)年代trong>
(b)年代trong>