描述体外扩大肿瘤浸润淋巴细胞恶性黑色素瘤患者的临床应用

文摘

过继转移的临床试验的自体肿瘤浸润淋巴细胞(尖)表现出了晚期恶性黑色素瘤患者的结果与客观的临床反应,50%的病人治疗。为了启动在黑色素瘤的临床试验,我们已经建立了一个方法,扩大尖临床相关数量在8周的两个步骤。进一步扩大尖的描述揭示一个寡克隆组成的t细胞表型效应记忆。自体肿瘤可用时,尖显示特定的活动在所有患者进行测试。直到文化包含对肿瘤细胞特异性以及肽来源于肿瘤相关抗原(taa)在扩张过程中。

1。介绍

恶性黑色素瘤的发病率正在增加在世界范围内,和在传播的预后很差1]。只有两个系统性治疗批准传播疾病和包含基础- 2免疫疗法(16%的反应率和6%完成响应)(2)和达卡巴嗪(6% -15%的反应率没有改善生存)(3]。然而,TIL-based免疫疗法的临床试验的结果进行的两个中心显示晚期疾病患者反应率50%,和响应是长久的4,5]。尖被CD8报道为主⁺t细胞和调解杀死特定的自体肿瘤在大多数病人(6]。信息在直到TAA-derived肽特异性主要显示偶尔大MART-1频率和gp100特定的t细胞的数量。另一方面,结果clonotypic和表型成分是稀缺的;显示混合克隆一个出版物的内容直到通过流式细胞仪分析(7),最近的两项研究报告表面标记相同的记忆像效应t细胞从病人材料有限8,9]。

在我们的研究中,我们分析了直到来自17个黑色素瘤患者的特点,五所经历lymphodepletion与低剂量- 2 TIL-based法案。

2。材料和方法

2.1。病人

病人手术主要或复发阶段iii iv恶性黑色素瘤研究都有资格。这项协议是经当地伦理委员会批准,所有患者包括签订知情同意后。肿瘤材料从患者经手术切除肿瘤手术后30分钟内。

2.2。直到大部分文化和快速扩张

直到培养方法是改编自达德利et al。10)构成一个两步扩张过程:(I)发起批量文化和(2)选定的大部分文化的迅速扩张与增殖的潜力。手术切除后肿瘤组织MM患者肿瘤样本的片段切成1 - 2毫米。碎片随后被单独放置在24-well文化板块(Nunc、丹麦)和维护2毫升的培养基(CM)包含RPMI1640(英杰公司)、青霉素、链霉素、二性霉素b(百时美施贵宝),10%的人类血清(σ)和7300或6000国际单位/毫升- 2 (Aldesleukin,诺华公司)。每个片段启动一个单独的直到文化分别保持在随后的扩张和激活。

大部分文化显示被选为进一步扩张迅速扩张协议(代表)。直到与辐照(40 Gy)同种异体cocultured PBMCs作为馈线细胞比率1:200年1:1厘米和AIM-V HS(表达载体)最初10%,并含有30 ng / mL OKT-3 (Cilag AG)、瑞士)和7300或6000国际单位/毫升(Aldesleukin,诺华公司)- 2 T-flasks正直的人。代表通常用于临床前被启动直到每个瓶直到使用/瓶在临床规模众议员5天,一半的媒介被新的取代中包含AIM-V厘米HS - 2和7300国际单位/毫升的10%。从那里,直到浓度维持在通过添加AIM-V补充细胞/毫升二性霉素b和7300或6000国际单位/毫升- 2。一半的病人直到培养在7300国际单位/毫升- 2,而另一半培养期间收到了6000国际单位/毫升- 2。

2.3。生存能力

细胞计数和生存能力测试是由显微镜。细胞和锥虫蓝染色后通过计算生活和死细胞的血球计。

2.4。不育性测试

散装和代表文化间歇采样进行微生物检测真菌和细菌污染。

2.5。肽

我们使用以下hla a2限制性肽:SUR1M2 (LMLGEFLKL) HTERT P540 (ILAKFLHWL), 204 (ILIDWLVQV)细胞周期蛋白B1, MART-1 27-35 (AAGIGILTV)和NY-ESO 1 157 - 165 (SLLMWITQC)。

2.6。细胞系

自体肿瘤细胞系建立了从肿瘤碎片产物在24或6孔板(Nunc)介质组成的RPMI1640(英杰公司)、青霉素、链霉素、二性霉素b, 10%胎牛血清(表达载体),和SoluCortef(辉瑞)。

肿瘤细胞冻存的90% FCS和10% DMSO(医院药房,RegionH,哥本哈根,丹麦)和存储在−140°C。

2.7。流式细胞术

表现型进行使用与天后FACS-Aria软件(BD)和荧光共轭对CD3单克隆抗体(mAb) APC-Cy7, APC CD4、CD8 PerCP, CD25 PE、CD27 PE、CD45RA FITC, CD45RO PE、CD56 PE (BD), CCR7 FITC(研发系统),CD16 FITC (Dako), CD28 FITC (Immunotech) CD62Ligand PE (BD Pharmingen), CD57 FITC (BD Pharmingen)以及相应的同形像。

2.8。t细胞受体(TCR) Clonotype映射通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)

使用NucleoSpin RNA RNA提取二世(Macherey-Nagel,德国)。互补脱氧核糖核酸的合成和定量cDNA在每个样本进行了如前所述[11]。

对TCR clonotype映射,互补是放大使用底漆面板覆盖24 BV地区TCR的家庭。结果PCR产品适合DGGE [12,13]。放大进行了45的总量μL包含1 xpcr缓冲区(50毫米氯化钾,20毫米三pH值8.4,2.0毫米MgCl₂、0.2毫米甲酚红、12%蔗糖、0.005% (wt / v) BSA (Boehringer-Mannheim,曼海姆,德国)),每个引物2.5 pmol, 40毫米核苷酸(Pharmacia LKB,乌普萨拉,瑞典)和1.25单位AmpliTaq聚合酶(珀金埃尔默鲸鱼座公司,维尔,加州,美国。参数和条件用于放大是30秒94°C。,60°C,持续60秒。,和72°C for 60 sec., as described, in [11,12]。

DGGE 10μL整除被加载到一个变性梯度凝胶含有6%聚丙烯酰胺和尿素和甲酰胺梯度从20%到80%不等。凝胶运行在1 160 V 4.5 h x TAE缓冲保持在一个恒定的温度56°C。经过电泳,凝胶沾SYBR绿色我(美国俄勒冈州分子探针)和可视化使用佛罗里达州- 3000荧光检测系统(富士胶片,科学成像斯堪的纳维亚半岛,瑞典)。

2.9。Elispot正γ测量

抗肿瘤活性有关酶联免疫斑点正与评估γ如前所述(量化14]。总之,硝基触底96孔板(多屏幕MAIP N45;微孔、丹麦)被涂上一层正无穷γ捕获抗体(1-DIK;瑞典Mabtech RPMI 1640)和进一步的清洗和阻塞。最多每口井的效应细胞要么是单独添加肽刺激时,或在coculture与靶细胞(自体肿瘤细胞组成的细胞每)。四个小时或隔夜潜伏期后,介质被丢弃,井洗其次是应用二次生物素化的抗体(7-B6-1-Biotin;Mabtech)。盘子一小时孵化,进一步洗,avidin-enzyme(链霉亲和素;Mabtech)共轭,被添加到每个小时在室温下孵化紧随其后。成功,井清洗和酶底物电视台/ BCIP(硝基蓝四唑/ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl磷酸盐;Mabtech)被添加到每个。板块在室温下孵化2到10分钟,而新兴的紫色斑点。反应终止了自来水。斑点数2.0 ImmunoSpot系列分析仪(CTL分析仪)和肿瘤特定的频率直到可以从现货的数量计算形成细胞。 The assays were preferably done in triplets or in duplicates in case of low cell numbers.

2.10。Cr释放试验

一个标准的Cr⁵¹释放试验被用来量化的具体细胞毒性的能力选择直到文化。简而言之,Cr⁵¹标记肿瘤细胞(副本或一式三份)和胡麻cocultured(最大E T比100:1和滴定)RPMI中含10% FCS潜伏期为4小时。此后,Cr⁵¹释放测量和计算的百分比肿瘤溶解(#计数−分钟数)/(最大计数−最小数)×100%。

2.11。统计分析

我们利用Graphpad棱镜统计软件分析统计差异,使用成对双尾t测试。P值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。病人

肿瘤得到了材料从17例局部晚期或先进的疾病转移局部淋巴结(多数标本)或皮下注射。1厘米的最低要求³肿瘤是需要确保足够的材料直到扩张。的平均年龄是62岁的平等的性别分布。12的病人只有治疗手术前包容,而五个病人包括在我们最近建立了临床试验试验之前收到2和/或DC疫苗基础免疫疗法。患者显示下面的抗原类型分布:一个HLA-A1 +两个HLA-A1 / A3 +一个HLA-A3 +两个HLA-A3 / A11 +一个HLA-A11 +一个HLA-A3 + / A2 +四个hla A2 +,一个HLA-A2/24 +,四个non-HLA-A1 / A2和A3 / A11 / A24。

3.2。直到膨胀动力学

淋巴细胞迁移的碎片和扩展为2至5天内汇合的层分裂前井。每个好启动一个单独的大部分文化和保持与其他文化。至少直到大部分文化扩展到细胞被认为是足够的扩张。这是获得15的17例(88%)6%到100%的大部分文化3 - 5周内(平均58%)。我们甚至发现增长率显著不同的文化之间的相同的病人,和没有区别成功直到增长率从LN或SC肿瘤物质,也没有之间的浓度- 2(数据没有显示)。

我们下一个测试了一系列的增殖潜能的大部分文化从12 15足够增长直到患者。这个快速扩张过程(代表)包括细胞的同种异体馈线和CD3抗体显示增加直到利率大幅扩张,在先前报告在黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌。再次,动力学可以从同一患者不同文化;然而,过程可以有效地扩大直到大部分文化在超过一半的1000倍(图2周的文化1)。

3.3。表型和克隆成分

直到在显微镜下,可视化显示了形态学相关积极将铺设作为单个细胞或淋巴细胞集群/克隆。

在收购细胞流式细胞仪,控制可行的细胞进行的基础上向前和侧散射点的情节。t细胞(CD3⁺)成为主流文化,而NK细胞(CD16/56⁺)(图2)都缺席。在大部分文化中,我们观察到一个异构CD4细胞⁺和CD8⁺文化国际米兰- t细胞分布和个体内的。然而,全面向CD8扭曲⁺(意味着= 74%±24%,范围30% - -94%)与CD4 t细胞优势⁺t细胞(意味着= 19.5%±23.5%,范围1% - -64%)。接下来,我们调查了发生表面标记识别t细胞记忆子集,或者,一个分化的效应细胞,在整个CD3⁺人口,CD4之一⁺和CD8⁺t细胞亚群相比,直到两周后的代表(图2)。总的来说,CD45RO的有一个明显的优势⁺和CCR-7^{Lo /−}前后T细胞的数量代表识别当T细胞记忆效应。

直到进一步的特点是表面标记根据效应CD8的模型⁺t细胞分化阶段由Gattinoni et al。15]。表达的淋巴归航CD62L标志代表的CD3后显著降低⁺人口和CD8⁺子集和CD4之间保持不变⁺子集。关于costimulatory标记物的表达,我们观察到的表达显著高于CD27 CD8之一⁺大部分直到CD4相比⁺细胞,而CD4⁺散装细胞持续高于CD28表达文化和众议员后虽然有一个相对较高的CD27/28双阳性细胞百分比几大部分直到,众议员最后他们表达下调后,有一个显著增加的高亲和性受体- 2 (CD25)后CD4的代表⁺人口。总之,CD8⁺人口表达表面标记(CD45RO⁺,CCR-7^罗、CD62L^罗,CD27^罗CD28^罗,CD57^罗)类似中间晚期效应细胞据其他团体(8,9,16]。

选择扩展分析了文化的存在无性繁殖系地扩大T细胞通过rt - pcr / DGGE-based TCR clonotype映射。分析发现的存在至少有10个不同的t细胞clonotypes散装文化以及迅速扩大文化(数据未显示)。结果支持我们的以前的研究扩展到从头部和颈部癌症患者,扩张的高剂量和CD3抗体- 2似乎支持大量t细胞克隆的持续扩张。

3.4。持续的功能在扩张能力

直到文化从八个病人选择散装检查特定的t细胞数量的存在文化和众议员后肽来源于过度表达(端粒酶,生存素和细胞周期蛋白B1),分化(MART-1)和癌症睾丸抗原(NY-ESO-1)作为目标,而自体肿瘤细胞系提供一组未知的抗原特异性。Elispot检测正γ释放在抗原刺激后持续的功能直到众议员透露由于高灵敏度的测定,我们可以遵循的存在和损失低频single-peptide-specific t细胞数量(图3(一个),因此发生在细胞数量的增加或减少某一特定的细胞群,在未指明的扩张和anti-CD3 - 2提供的程序。自体肿瘤细胞系中可用四个病人,和所有病人包含直到有关酶联免疫斑点(图中显示抗癌活性3 (b)和数据未显示)。抗自体肿瘤特异性t细胞种群的存在更多的是在代表和显示持续的功能能力。尽管T-cell-specific抗癌活性直到心态占据主导地位时,我们观察到LAK / NK细胞活性在几个文化(图3 (b))未指明的细胞株K562和Daudi。最后,我们证实了代表(图后持续直到杀肿瘤的能力3 (c))表明直到扩展到临床相关数据(2400 - 4000倍)可以参与并杀死自体肿瘤。

4所示。结论

我们能够建立足够扩大直到大部分文化在五周的多数包括黑色素瘤患者。进一步扩大1400年代表平均扩张产生褶皱在两周内,确保可行性及临床相关临床测试的数量。基于早期研究t细胞治疗黑色素瘤的患者低注入MART-1-specific CD8细胞含有30%⁺t细胞介导的一个完整的临床反应(17),我们估计最少细胞需要获得治疗效果。细胞分析显示一个寡克隆T效应记忆细胞组成,由CD8成为主流⁺后后期分化细胞显示一个中间众议员直到保留功能性能力衡量正无穷γ释放对自体肿瘤和溶解性活动。值得注意的是,我们并没有发现差异两剂2直到培养期间使用,甚至进一步降低剂量3000国际单位/毫升- 2现在使用的标准直到扩张在其他中心。最后,直到没有显著影响膨胀动力学或表型预处理、年龄或性能状态的病人。

5。视角

在最近发起TIL-based法的临床试验,低剂量- 2,lymphodepletion预处理,五个治疗黑色素瘤患者取得了一个正在进行的部分响应(+ 13个月)。我们正在筛选直到文化发生的肿瘤相关抗原(TAA)特异性通过测量正无穷γ有关酶联免疫斑点。在这使我们能够识别的特定组合TAA每个病人特异性,期间可以发现潜在的免疫监测病人的样本。此外,我们正在建立和验证流cytometry-based方法识别TAA-specific t细胞数量和获取信息的t细胞记忆和动力学效应阶段之前和之后的治疗。信息提供更多的洞察过继转移的预后价值直到。

利益冲突

作者没有潜在的利益冲突。

确认

作者感谢Kirsten Nikolajsen,蒂娜Seremet Mette Noe维特,和夏洛特Vajhoej细胞分析和培养优秀的技术援助。

引用

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