文摘

存在技术是现在的一个常用的方法来研究基因表达水平。准确的选择参考基因检测基因表达分析前是一个重要的工作。在当前的研究中,8候选人内部控制基因(GAPDH肌动蛋白,大号,UBC、MUB TIP41, APX型,和卡帕)被选中,和四个统计算法被用来评估他们的稳定性在不同激素治疗。结果证实,当使用一个内部控制基因,大号成为第一个排名内部控制基因在所有实验小组。当使用两个内部控制基因,大号和MUB,是最可接受的赤霉素处理集团内部控制的基因;大号和GAPDH被认定为内部控制基因在IAA治疗组;大号和肌动蛋白是最可靠的ZT型和ABA实验团体组合;大号和TIP41推荐最合适的控制基因控制。此外,内部控制的可靠性进一步验证了呕吐的表达的基因,基因的发展有关五味子属对。结束这项工作将有利于后续研究基因表达分析五味子属对。

1。介绍

实时定量PCR(存在)已成为最常见的化验记录和基因表达水平由于其特异性,准确性,效率,和高灵敏度1,2]。存在结果需要规范化的数据可靠的内部控制基因(3,4]。内部控制基因,理想的稳定表达的所有组织,和他们的表达与环境因素无关,实验条件,或其他因素5]。但是,先前的报告显示,没有这样的内部控制基因,可应用于所有植物和各种实验设计(6]。例如,不同的内部控制基因在不同实验条件下使用椰子L。(椰子)7),苦瓜(8),Bixa奥雷利亚纳l . (9),柳树matsudana(10),而Taihangia rupestris(11]。可靠的和精确的存在的结果,因此,重要的是评估和选择受益人内部控制基因在不同实验条件下(12]。

五味子属对(美国对)是一种雌雄同株的藤本植物的家庭木兰科。它生长在俄罗斯东部的大部分地区,千岛群岛,库页岛南部,韩国、日本和中国东北[13]。的干燥成熟果实美国对是一个中国传统草药,用于补气,促进体液,滋养肾脏,其镇静和收敛性14,15]。因为男性和女性的花朵美国对生长在同一个工厂,雌花的数量和质量决定的产量美国对。因此,提高雌花的分化率是提高产量具有重要意义对。

许多研究表明外源激素对植物花有监管影响发展(16,17]。然而,研究激素调节花如何开发不够深,不能完全解释其监管机制。在这项研究中,外源激素的影响在雌花的分化美国对被喷洒不同浓度的外源激素进行调查。但它似乎没有一个统一的内部控制基因,将适合美国对据我们所知。出于这个原因,重要的是选择正确的解释RT-qPCR结果时内部控制基因。我们选择八个候选人内部控制基因(肌动蛋白,大号,MUB,哥伦比亚大学,GAPDH,地对空导弹,TIP41,和APX型)的转录组数据,及其稳定性评价。此外,我们使用geNorm [18],NormFinde [19],BestKeeper [20.],和综合排序软件RefFinder [21]分析潜在的看家基因的稳定性和可变性精确数据标准化中存在的结果(22]。

2。材料和方法

2.1。美国对外源激素治疗

来自实验材料美国对吉林农业大学的基础。五岁的美国对植物( )无病虫害被选为实验材料,每一个都是一群人,三个复制。水作为对照组,四种激素(GA3、IAA、ABA和ZT型)应用通过喷雾瓶美国对植物在特定浓度见表7月5日1。为了确保足够的激素的吸收,喷涂然后重复7月10日和7月20日采集标本。收集样本立即处理液态氮,随后储存在-80°C,以防止信使rna降解。信使rna降解是一个极为重要的机制来控制细菌细胞的基因表达情况。电池的过程包括结构化和命令作用的内切酶和核酸外切酶,和其他各种通用和现有特定物种的孤独。

2.2。总RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的合成

根据设备指令,我们从植物中提取RNA使用频谱植物总RNA工具包(σ)。合格的RNA质量被NanoDrop 2000 c分光光度计检测。进一步验证使用1.5%的RNA进行了完整性( )琼脂糖凝胶电泳。互补脱氧核糖核酸合成RNA逆转录的光学密度(OD) 260 / OD280比率在1.8和2.1之间。的DNA合成RNA模板生成互补DNA(互补)。这可以作为模板各下游应用程序进行RNA研究尤其是在基因表达。因此,互补脱氧核糖核酸合成充当各种分子生物学技术的第一步。逆转录酶(RT)使用RNA模板和互补的引物的3RNA指导合成第一链cDNA。2执行反转录反应μ总RNA的L '脚本中根据给定的程序™RT(豆类、日本)工具包。互补脱氧核糖核酸样本用于后续的实验都是存储在一个冰箱-80°C。

2.3。候选人内部控制基因和引物的设计

存在底漆对八参考基因候选人和目标基因(GAG)被设计使用引物5软件使用以下参数:扩增子大小是140至261个基点,引物长度是18到22 bp,扩增效率(E %) 109%到91不等之间线性相关系数( )0.982到0.998。表明的效率与PCR反应和匹配度标准曲线很好(23,24),确保在后续实验中存在数据的准确性。引物信息表中描述2和图1。

2.4。存在分析

存在化验qTOWER 3.0热循环仪进行使用(德国耶拿分析仪器公司、德国)96 -孔板。互补脱氧核糖核酸样本解冻和稀释4倍。每个反应的总量是20μL,由10μL SYBR预混料ExTaq II工具包(豆类、日本),2μL稀释cDNA、1μL的底漆(正向和反向),和6μL RNase-free水。在95°C初始变性后30年代,40放大周期在95°C 5秒,30秒57°C,分别和30秒72°C。排除引物二聚体的形成,融化曲线分析的温差60°C和95°C。三个技术复制用于每个样本,使用同一批次的cDNA整个实验。

2.5。数据分析

为每个候选人的Ct值测定中存在内部控制基因。此外,候选人内部控制基因的稳定性分析是评估和排名使用四个统计软件包:NormFinder, BestKeeper geNorm, RefFinder。NormFinder是一个算法,用于确定最优正常化基因从一组候选基因。BestKeeper算法有助于识别最好的规范标准的基因数据。geNorm算法有助于识别最稳定的参考基因从一组测试候选人参考基因。RefFinder是一个全面的工具,用于评估和筛选参考基因广泛从大型数据集。

2.6。正常化呕吐

AG)属于C功能基因在ABCD模型和中起着重要的监管作用植物分生组织发展的终止的规定,以及花器官的决心雄蕊和雌蕊之间(25,26]。下半年的花朵个体发生,它调节的发展风格与心皮和终止花发展(27]。进一步验证看家基因的可信度推荐在这个工作中,内部控制的不同组合基因用于检测GAG基因的表达在女性和男性的花。

3所示。结果

3.1。中存在的结果

一般来说,初步确定内部控制基因的丰度可以通过循环阈值(Ct)值,在较低的基因转录丰度较高的Ct值代表那些[28]。合格看家基因应该有温和的表达水平及以上,及其CT值应该是 (29日]。摘要八个候选基因高或温和的表达水平,用Ct值的18.44(肌动蛋白)到27.9(地对空导弹)。其中,肌动蛋白的Ct值,范围从18.44到21.44,变化最小。相反,为地对空导弹高度不同的Ct值,从22.5到27.9(图2)。

3.2。geNorm分析

geNorm软件评估内部控制基因的稳定排名和数量计算”值”,( )价值。其中,越大价值,越稳定。如果基因的价值大于1.5,基因的候选资格应该被取消。geNorm分析后表明,值8摘要候选基因内部控制都小于1.5;这是解释说,他们的表达稳定满足实验分析(图的要求3)。成对的默认阈值变化( )是0.15。计算变异小于0.15,选择内部控制基因的数量( )适用于分析。计算成对变异大于0.15, 内部控制基因是必需的。本文所有候选基因的两两变化值在所有组织激素治疗都是小于0.15(图4),表明在所有治疗条件下,两个内部控制基因满足标准化的基因表达数据。的评价结果geNorm软件如下:候选基因肌动蛋白和MUB赤霉素处理(图下的稳定值最低3(一个))。在IAA处理下,GAPDH和大号是最好的(图3 (b))。在治疗和ZT型或ABA,最优组合是肌动蛋白和大号(数字3 (c)和3 (d))。的肌动蛋白和大号的价值是最小和最稳定的对照组(图3 (e))。

3.3。NormFinder分析

类似geNorm NormFinder的程序计算,排名内部控制基因通过评估其稳定值在不同的实验设计(M)。NormFinder工具是用于分析和驴的稳定表达的参考基因中存在数据规范化。算法确定最优正常化基因从一组候选人。这项研究在30.)检查6个候选人参考基因在叶、节点,节间,根、卷心菜、原始,和基底干细胞组织两岁的克隆棕榈树。NormFinder和BestKeeper算法验证了稳定的参考基因油棕组织被测试。研究NormFinder和BestKeeper工具用于选择可靠的参考基因进行基因表达研究在使用实时PCR桃子。算法分析基因的稳定性,这是发现,TEF2 UBQ10, RP二世最优参考统计可靠性高(31日]。这项研究在11突显了一个事实,最低的稳定值描述基因表达水平最好的稳定。如表所示3根据NormFinder序列,四个内部控制基因大号(0.053),GAPDH (0.008), TIP41(0.003),和大号(0.019)计算最低稳定值下四个激素治疗(ZT型,GA3、IAA和ABA)。大号(0.152)排名最低的对照组样本和基因被认为最佳的候选人。

3.4。BestKeeper分析

BestKeeper软件排名内部控制基因的稳定性主要的标准偏差(SD)和变异系数(CV)值的基因表达水平。算法计算候选基因稳定性考虑Cq值的标准差除了方差系数(CV)、相关系数和假定值。它有助于确定最好的标准有利于标准化的基因数据。两个值越低,更稳定的参考基因。然而,基因与SD值大于1不应被视为内部控制基因(32]。BestKeeper分析的结果如表所示4。激素治疗(ZT型,GA3、IAA和ABA)和对照组样本,优化内部控制基因GAPDH (0.22), APX型(0.18),大号(0.53),肌动蛋白(0.03),和TIP41(0.57),分别和地对空导弹是最不稳定的基因在所有采样组。

3.5。RefFinder分析

RefFinder是一个基于网络的在线工具,综合排名geNorm的结果,NormFinder, BestKeeper评估获得的最佳稳定内部控制基因美国对(20.]。基于RefFinder排名,大号在所有测试组综合排名第一。地对空导弹被认为是最糟糕的稳定在所有候选基因。结果RefFinder分析表提供了5。

3.6。验证参考基因的选择

根据男性和女性的核糖核酸测序结果的花朵美国对,AG)同源基因的呕吐是调节在雌花和雄花中表达下调。中存在的结果表明,当TIP41,大号或TIP41,和大号被用作内部控制基因,GAG基因的相对表达女性花蕾是大于1,和表达对男性花芽是小于1,表明GAG基因在雌性花蕾调节。这个结果符合RNA-sequencing的结果。使用不适当的参考基因可以导致存在大量错误的结果,甚至错误的结果。进一步说明参考基因的重要性RT-qPCR基因(图的分析5)。

4所示。讨论

准确的存在结果受到多种因素的影响,包括RNA提取效率、反向转录,扩增效率的变化28,33]。基因的选择合理的内部控制是提高的关键基因存在期间正常化检测的准确性(34,35]。摘要八候选人看家基因(GAPDH、行动、MUB UBC、TIP41 APX型,CPAP,和大号)选择RNA-sequencing数据的基础上,男性和女性的花朵美国对。基因的稳定排名四(4)公认的参考基因评估统计软件。结果分析显示,geNorm推荐的参考基因,NormFinder, BestKeeper并不完全一致。出现这样的结果可能是由于他们的不同的计算规则和分析程序36]。确定的最终排名稳定的内部控制基因,结果使用在线工具RefFinder算法集成,和一个综合排名8候选基因。综合分析后确认大号被推荐为最优秀的参考基因实验治疗,和CPAP是最不稳定的。大号,最好稳定参考基因之一美国对候选人,也作为一个内部参考芹菜研究基因在不同发育阶段(23]。但当芹菜受到四个非生物压力(干旱、寒冷、高温、盐度)和四个激素(ABA、GA、惩罚和SA),大号成为最不稳定的参考基因(37]。这表明即使是相同的内部控制基因在不同条件下具有不同的稳定性。然而,正如存在校正和标准化由一个参考基因可能会导致结果的偏差,建议使用两个或两个以上的内部控制基因帮助结果的准确性38]。在所有的样品,成对变异值(Vn / Vn + 1)内部控制基因的标准化系数小于0.15,表明这两个基因内部控制可以满足相对定量要求,无需引入第三个参考基因修正。因此,根据RefFinder的排名结果,赤霉素处理组中,大号和MUB最优组合;最好的合作伙伴的内部控制基因IAA实验组是大号和GAPDH;大号和肌动蛋白被认为是最好的管家基因ZT型和ABA实验团体;大号和TIP41表现出最好的对照组的稳定。管家基因的研究表明MUB,肌动蛋白,TIP41, GAPDH有不同的稳定性在不同植物或在不同的实验设置。例如,TIP41是最可靠的内部控制基因苦瓜不同压力下治疗(H₂O₂、氯化钠、PEG6000 CuSO₄法案,寒冷,紫外线条件)(8]。盒和TIP41是最好的稳定结合内部控制在干旱胁迫下的基因常春藤l . (39),但TIP41不是最好的参考基因三个牡丹品种(28]。其他看家基因也有类似的结论。相同的参考基因的稳定在不同植物和不同的实验性的治疗方法也是不同的11,32- - - - - -42]。通过使用不同的内部控制基因检测GAG基因的表达在雄性和雌性花,建议内部控制的可靠性基因在这工作是进一步证实。总之,不同的内部控制规范化基因影响中存在数据的准确性;即内部控制不稳定基因可能导致重大偏离真正的表达水平和误解的数据(3,33]。因此,它是评估的可靠性和再现性的关键参考基因表达和基因的关键选择适当的内部控制根据研究条件。

5。结论

总之,这项工作评估和排名的稳定性8候选人内部控制基因在四个激素通过四个评价软件,进一步验证了本研究的可靠性,通过GAG基因。结果证明这些管家基因在不同实验条件下有不同的稳定。当一个参考基因,选择大号满足所有实验群体。当使用两个内部控制基因时,可以使用大号和MUB GA3组;可以选择大号和GAPDH IAA治疗组;大号和肌动蛋白可用于ZT型和ABA实验团体;大号和TIP41推荐最适应内部控制对照组基因;地对空导弹是最不可靠的作为一个内部参考每个实验组的基因美国对。本文从而确定合适的内部控制基因表达研究美国对在不同激素治疗。

数据可用性

在当前的研究中使用的数据集是可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。