文摘

酵母是不可分割的一部分,我们的环境。酵母的检测是在许多领域具有重要意义。impedance-based传感器和指状组合型微电极是一种很有前途的方法来建立一个简单的和便携式检测系统。然而,酵母细胞的位置很大程度上影响阻抗变化和最终检测的敏感性。在这项研究中,一个impedimetric生物传感器和超声波协助细胞排列酵母检测提出了。为了验证这一生物传感器的可行性,进行了有限元建模软件COMSOL使用。声压场的声辐射研究了酵母细胞上的力。细胞在微流体通道测定使用流体粒子跟踪模块。之后,微电极之间的阻抗进行了计算。酵母悬浮液与不同的细胞浓度作为模拟的测试样品。 The proposed sensor showed a higher sensitivity than the conventional impedimetric biosensor on which the cells were randomly located. It can be used for the detection of microorganisms. This finite element modeling provided an effective approach for the design of biosensors.

1。介绍

酵母是一种真菌广泛存在于我们的生活环境。酵母污染会导致腐败的食物,包括奶制品、蔬菜和水果(1]。因此,酵母检测有助于食品质量控制和环境监测。此外,酵母在酒精发酵和酿酒中扮演一个重要的角色2]。在线检测酵母提高产量和降低成本具有重要意义在发酵工业。

许多方法已经开发检测和量化酵母。基于细胞培养的方法(3,4)耗时。郭et al。5)使用的酶联免疫吸附试验检测食品中酵母菌。这个过程是艰苦的。奥康纳和格林6)在生物样本中确认了酵母使用fluorochrome-labeled寡核苷酸探针。需要复杂的样品预处理方法,如细胞固定和透化作用。许多研究人员使用流式细胞仪(7,8)检测和列举酵母高吞吐量。然而,这种方法依赖于大型仪器和熟练的操作符。分子技术,如聚合酶链反应(9,10),有很高的敏感性和特异性,但昂贵的(11]。Biofunctionalized谐振光子光栅传感器(12)被用于酵母检测。该方法需要一个昂贵和复杂光学系统测量共振波长的变化。拉曼光谱应用于检测酵母在苹果汁Mizrach et al。13]。该方法需要复杂的数据分析。公园等。14)开发的太赫兹检测酵母缝隙天线阵列。该方法是无损和label-free。然而,一个昂贵的飞秒激光产生极化所需的太赫兹脉冲。在另一个研究15),酵母集中chitosan-modified磁性纳米粒子和检测使用疏水性碳点。虽然灵敏度高,试剂的合成是麻烦。Martyniak et al。16)结合荧光染色法和图像为酵母分析血细胞计数器。然而,细胞染色过程所需的专业技术人员。

由于低成本的优势,节省时间和试剂,操作简单,电阻抗光谱学已经用于微生物的动态检测(17]。Tubia et al。18)开发了一个生物传感器来检测败坏酵母在葡萄酒使用免疫反应和阻抗光谱学。Stilman和他的同事们(19)检测酵母菌株在酸奶和啤酒等食物样本通过结合surface-imprinted聚合物与阻抗光谱学。Kiani et al。20.捏造一个生物芯片测定酵母浓度在不同媒体基于阻抗测量。姚明et al。(21]研究了酵母细胞的介电特性阻抗光谱学检测状态和细胞悬液的浓度。阻抗谱也用于监控工业酿造过程中产生的生物质(22,23]。Van Wyk和席尔瓦(24)确定啤酒发酵过程中酵母量,使用阻抗技术。Krommenhoek et al。25)设计了一种微型机械阻抗传感器在线监测的酵母细胞浓度。他们发现,细胞悬液的介电常数变化线性依赖生物质浓度范围。

许多研究都旨在改善阻抗光谱灵敏度的目标分析物的检测通过互相交叉电极(26,27]。西米奇et al。28)开发了一个互相交叉弹性传感器在纸上的基质细菌检测。传感器阻抗之间有很强的相关性和细菌浓度。Varshney et al。29日)嵌入式黄金指状组合型微电极到微流体流细胞制造一个阻抗生物传感器快速检测的病原体。Interdigital电极传感器取得了巨大优势微生物的检测。然而,三维有限元模拟表明,随机分布的微电极表面微生物细胞检测能力有限(30.,31日]。因此,一个有效的方法应用于具有重要意义集中微生物细胞和限制细胞分布。这可能提高检测性能的基于interdigital微电极的阻抗生物传感器。

恒负电位被用来吸引到目标微生物电极表面(32]。此外,dielectrophoretic [33)和electrohydrodynamic军队也为生物传感器应用于聚焦粒子增强[34]。吴et al。35)发现了微生物通过电阻抗光谱学asymmetric-polarization AC电渗捕获。在他们的工作,微生物聚集在电极表面。建议细胞位于两个微电极之间可能产生重要改变悬挂阻抗比细胞微电极上方的【30.]。

Acoustophoresis已经广泛采用了捕获,分离,浓度,和洗36]。微米大小的颗粒,其中包括细胞,可以通过超声波声辐射力量操纵字段(37,38]。中et al。39]kilohertz-order超声驻波技术应用于生成scaffold-free细胞在细胞培养皿的三维聚合。约翰逊等人。40操纵粒子)开发出一种方法在一个连续流动的声表面波激发。

为了提高impedance-based酵母的性能检测,所以目前的研究提出了一个impedimetric生物传感器和超声检测酵母细胞排列。这与acoustophoresis生物传感器结合电阻抗光谱学。超声领域应用丰富酵母细胞,把他们两个相邻微电极之间的差距。此外,这种传感器的数值模拟是由软件COMSOL。我们所知,很少有报告相结合的电阻抗技术与超声粒子操纵酵母检测。生物传感器在这项工作提出集成指状组合型微电极微流控装置。它有小的优势对样品和试剂的需求。这是有利于开发一个易于使用的,快速,高效的酵母检测方法。

2。背景理论

2.1。部队在悬浮颗粒上

生物的水悬浮液颗粒直径大于2μm,声辐射力量发挥着更重要的作用比streaming-induced阻力在acoustophoresis [41]。在目前的研究中,酵母悬浮液被建模为单细胞分散体,在细胞由球形颗粒直径与几个微米。细胞之间的相互作用被忽视了。COMSOL粒子跟踪模块应用于研究细胞悬浮在微通道的运动。细胞的行为是由牛顿运动定律。确定细胞的时间位置,声辐射力量,streaming-induced阻力和重力考虑在内。在驻波场中,球形颗粒时均声辐射力量相关的梯度时动能和势能密度(42- - - - - -44]。动能密度是声波速度的函数,和潜在的能量密度是一个函数的声压。是由的声辐射力量 在哪里是细胞的体积,是细胞的密度,介质的密度,介质中的声速,和压力和速度场的大小,尖括号表示时间平均,然后呢和分别代表细胞和介质的可压缩性。由斯托克斯阻力 在哪里代表的动态粘度介质,是细胞的半径,粒子速度相对于介质(41,45]。

2.2。电场和电流

阻抗扫描的细胞悬浮液,激励信号可以通过一组介绍interdigital微电极,和生成的电流通过另一组interdigital微电极。细胞悬液中的电位分布可以由以下方程描述: 在哪里导电性,激励信号的角频率,是真空的介电常数,相对介电常数,电势。边界条件的数学形式 在哪里是向外边界表面的单位法向量,是激发电极的表面,地面的表面电极,是另一个接口之间的细胞悬液和微通道的墙壁30.,46]。一个含时电场的频率将产生电流密度: 在哪里是电流密度。

3所示。生物传感器的结构

生物传感器的结构如图1。生物传感器是由石英衬底上,互相交叉微电极,微流控室,凝胶的耦合,一个超声换能器。互相交叉的尺寸微电极在图所示2。使用丙烯酸塑料微流控室是捏造(PMMA)。顶部的微流控室,进口和出口直径2毫米是补充道。使用PZT-4压电陶瓷超声换能器是捏造的。压电陶瓷是兴奋5 MHz的频率。凝胶的耦合被用来提高超声波的传输效率从压电陶瓷微流控室。这种结构形成了一个平面波谐振器在流体介质产生的驻波。辐射力量的影响下,细胞会朝着节点平面的压力。微流控室的宽度和超声波的频率是决心确保横向位置的节点在两个相邻微电极之间的压力。anti-yeast抗体固定在底部的表面微流控室使用行之有效的方法(47]。酵母的检测过程如下:首先,酵母悬浮掉进液体入口的生物传感器芯片,并暂停了微流控腔和流动液体出口通过毛细管效应。然后,超声换能器的激励信号生成,和酵母细胞在微流控室中的特定位置被抓获。三十秒后,超声激励信号。生物传感器被允许站15分钟,这样悬浮酵母细胞定居在底部表面的微流控室,并绑定到抗体。新鲜生理盐水注入的微流控室洗掉粒子没有绑定到抗体。最后,通过交流电压应用于指状组合型微电极。酵母细胞浓度被量化分析阻抗谱。

4所示。有限元模拟

4.1。几何配置

进行有限元分析验证该生物传感器的可行性。5.5版本软件COMSOL多重物理量用于建立和分析艺术家耦合模型。由于生物传感器结构的对称性,模型设置为一个二维问题。生物传感器的几何配置(横截面)如图3。石英衬底的宽度和高度是3.75毫米和0.2毫米,分别。微流控室的模拟是一个矩形的尺寸 毫米。PMMA塑料块的宽度和高度是3毫米和0.2毫米,分别。3 GPa PMMA(杨氏模量,泊松比0.4)被认为是一种各向同性材料。互相交叉的微电极由6个数字电极对110黄金μm位宽度。两个相邻的手指之间的差距是40μm。超声换能器的矩形截面是732年μ米宽,200μ米高。酵母细胞被简化成球体与壳牌(48]。细胞的直径是随机分布的意思是8μm。酵母细胞的电特性参数取自文献[49]。在细胞膜的厚度远小于微流控室的大小和膜的导电率小于周围介质的接触阻抗边界条件用于减少网格元素和节省计算资源。接触阻抗边界条件定义为 在哪里的单位法向量是细胞膜的边界,是电流密度,外壳的厚度的细菌细胞,和的电导率和相对介电常数是壳,分别是细胞内介质的潜力,是细胞外介质的潜力50]。

4.2。网格生成

为了研究解决的收敛过程,计算网格的最大长度微流控室壁附近的元素, ,被改变成一系列不同的价值观和解决方案结果描述的趋势。网格元素的最大长度在其他域被设置 ,如图4(一)。范围从 来 ,在代表了超声波波长的液体。一个解决方案的收敛性被评估使用以下函数(51]:

这封信是收敛指数,是解决方案,当获得的参考解决方案吗= 。图4 (b)显示了变化趋势的最大网格元素大小减少收敛。为了得到一个合适的指数收敛值,参数 (例如, )选择在目前的研究中,导致218353年三角元素。

4.3。声场

声学系统在频域模拟耦合基础物理接口、机电、固体力学、和声压模块。为了简化模型,材料的粘合剂和耦合剂界面被忽略了。不同材料之间的结合被认为是完美的。图5显示了计算域和边界。域在微流控室( )由声压建模模块。体系结构( )和压电陶瓷( )分析了模块的线弹性材料的固体力学。此外,压电陶瓷被与静电耦合固体力学物理建模。超声换能器是激活5 MHz正弦波电压信号的振幅30 V(峰)。流体和固体之间的相互作用是由以下方程描述(在流固界面): 在哪里是压力向量,的单位法向量是流体表面,的压力,是标准应用于流体加速度,是流体的密度。细胞悬浊液的流体介质在本研究使用生理盐水(0.9%氯化钠)。

墙底部的微流控室(设定h)建模与硬边界条件,因为石英衬底有相对较高的刚度比PMMA材料。因此,底部墙,流体速度的法向分量被设置为零。边界F-H,做减法,胃肠道acoustic-structural耦合边界。固定边界条件应用于边界d e,超高频和i j。边界模拟的边界条件应用于滚动支持。边界的a - b, c,和C-J无压力边界的固体。静电模块,电势边界模拟一直为零,和一个30 V电压应用于边界抵扣。边界a - b和d e为零。

4.4。粒子跟踪

驻波的应用 - - - - - -方向。细胞移动的控制下声辐射力量,streaming-induced阻力、重力和浮力。描述的轨迹可能是一对时间坐标, 。细胞运动30秒了。酵母细胞的密度在这项研究中的应用是1.1克/毫升(52]。粒子跟踪是在时域进行使用为流体粒子跟踪模块。计算域是该地区如图5。声辐射力量作用在细胞,细胞的速度,和位置预测的声压分布获得了在前面的计算步骤。一个正态分布的细胞直径(平均8μ米)标准差为1μm是仿真应用。细胞被随机选择的初始位置和分布均匀的计算域。细胞数量是由繁殖的细胞浓度和体积微流控室。细胞的压缩性是384 TPa¹(53]。

4.5。阻抗测量

压电激励后,酵母细胞之间对齐的两个相邻的手指互相交叉微电极。然后,设备被左站15分钟,悬浮细胞下降到微流控室的底部。细胞获得的位置坐标为流体粒子跟踪模块和用于构建电子模型。为了简化的几何模型和节省计算资源,一个单一的酵母细胞壳模型是用于本研究。一些材料参数表列出用于这项研究1。阻抗特性的细胞悬液模拟在频域通过使用电流模块。30 mVpp AC电压与频率从1赫兹到1 MHz电极应用于指状组合型标有“+”,如图3。其他电极标有“-”将地面的潜力。微流控室的墙壁被认为是电绝缘的。盐溶液的阻抗没有细胞作为一个控制。归一化阻抗变化(NIV)对应于被定义为不同的细胞浓度的悬浮液 在哪里阻抗控制的频率 , 表示模量 ,和是细胞悬液的阻抗。的阻抗光谱与浓度的悬浮液 , , ,和 是模拟的。平均值和标准偏差的阻抗计算模拟结果与随机选择的10个不同的酵母细胞的初始位置分布。

5。结果与讨论

5.1。声压分布和辐射力量

当5 MHz驱动电压30 V的振幅_页应用,形成的微流控室压力分布。它解决了使用声压模块和显示在图6。颜色显示的压力大小。最大声压 。激励信号导致波长大约6和13节点飞机的压力 - - - - - -方向。附近的压力节点平面微流控室的侧壁是扭曲的,因为边缘效应。

声辐射部队在细胞直径8μm估计的压力场。声辐射力量 - - - - - - 横截面的微流控室如图7。的 - - - - - -组件的声辐射力量(ARFy)范围从-3.24到2.04 (pN pN。的 - - - - - -组件的声辐射力量(ARFz)范围从-1.35到1.85 (pN pN。数据7(一)和7 (c)分别说明规范化ARFy的分布和ARFz。在数据7 (b)和7 (d)的振幅归一化ARFy ARFz和位置沿水平(在图7(一))和垂直(图7 (c))在显示subfigures白线。可以看到,这些细胞将被困在一些垂直的飞机ARFy是零。根据ARFy靠近飞机的方向, - - - - - -坐标被困的细胞将约为0.032,0.176,0.327,0.47,0.63,0.78,0.93,1.08,1.24,1.39,1.55,1.71和1.84。这意味着细胞将局部压力节点之间的相邻微电极的手指。没有稳定的局部位置 - - - - - -方向。推导的方程(1),粒子半径是假定为比超声波波长小得多。5 MHz的频率的超声波应用于细胞操纵,导致波长为300μ米(远远大于细胞直径8μ米)。上述假说很满意。

5.2。Acoustophoretic细胞追踪

根据声辐射的分布力,酵母细胞在不同时间点的位置可以预测。模拟实现了在瞬态模式从0到30年代时间步长为0.2 s。图8显示了微流控细胞室的轨迹。颜色显示细胞的速度。结果表明,细胞迁移到13压力节点飞机从邻区。

为了确定一个合适的超声治疗时间细胞排列,细胞直径不同,(4的位置μ米,8μ10 m,μ米)在不同时间点的超声波行动进行调查。在图9,结果在一个细胞的浓度 会显示出来。

5.3。阻抗谱

酵母细胞的坐标和半径的进口为流体粒子跟踪模块和用作设置电气参数模型。阻抗谱在频域模拟从1赫兹到1 MHz 500 Hz的一步。阻抗的大小和相角计算。图10显示了阻抗谱获得了有无超声治疗不同的细胞样品的浓度。阻抗谱和细胞浓度的模拟 , , ,和 ,分别。阻抗的大小细胞浓度成正比。阻抗的大小和频率的增加减少。如数据所示10 (c)和10 (d),相角减小逐渐从一个值接近于零- 1当频率增加。细胞浓度越大,越相角减小。细胞的介电性能的影响高频阻抗变得引人注目。细胞悬浊液的阻抗的变化与超声波协助细胞排列比那些没有超声波治疗。归一化阻抗变化在16岁千赫(29日)被用来调查impedimetric生物传感器的性能。

图11显示了归一化阻抗变化从样本中获得不同的细胞浓度和不同的治疗方法。在图(11日)样品没有超声波治疗,归一化阻抗变化 , , ,和 ( ),当细胞浓度 , , ,和 ,分别。超声波协助细胞对齐后,归一化阻抗变化增加 , , ,和 ( )与细胞浓度的样品 , , ,和 ,分别。阻抗增加细胞浓度增加。这是因为酵母细胞的导电率低于生理盐水和液体介质的体积比例减少时细胞浓度增加。结果是符合一些报告在文献[28,54]。所以在同一细胞浓度、超声细胞排列导致一个更大的阻抗变化。这可以解释声场相邻电极之间的细胞聚集,导致更高的局部浓度,和电场强度达到最大的相邻电极之间的区域。我们可以看到在图11 (b)大约有细胞浓度之间的线性关系和归一化阻抗变化。样品没有超声波治疗的关系可以表示为一个方程: ( ),和合是归一化阻抗变化和在哪里是细胞浓度。所以样品的超声细胞排列,方程 ( )。所以impedimetric测量与超声细胞排列有更高的灵敏度。这表明impedimetric生物传感器在目前工作对酵母的检测是可行的。

从图11 (b)可以看到,有一个积极的拦截细胞浓度为零。然而,从理论上讲,当细胞浓度为零,归一化阻抗变化应该是零。这种差异可以在两个方面来解释。首先,由于饱和的存在,阻抗变化和酵母细胞浓度之间的关系并不是完全线性浓度范围。在细胞浓度较低的情况下,这大约是线性的关系。合适的阻抗变化之间的关系和酵母细胞浓度线性方程将带来一些错误。其次,在这项研究中,细胞大小和随机分布的初始位置被引入到模型中。这导致阻抗数据的变化在同一细胞浓度。变化会导致明显的线性回归中的错误。

所以本研究提出了一个impedimetric生物传感器和超声检测酵母细胞排列。其可行性初步验证了有限元模拟。在目前的研究中,分析了声场通过使用一个简化的二维模型。室的压力分布在纵向方向上被认为是均匀的。实际声场分布是三维的,有一个偏差之间的基于二维模型的仿真结果和实际价值。当驻波生成microchamber,以下关系感到满意: 。这封信代表振动的模式,超声波的波长,代表microchamber的宽度。细胞被困在飞机“压力节点”或“波腹”飞机,根据细胞的密度和压缩系数和流体介质。的位置 - - - - - -方向细胞被困很容易受到超声波频率和微流控室的尺寸。这个问题在实验过程中需要考虑。未来的研究将考虑优化几何结构的微流控室和指状组合型电极,包括微电极的宽度的手指和手指之间的距离(30.,55]。

模型在本研究中没有考虑到信息交互。酵母细胞可能导致城市群之间的力量,尤其是当细胞浓度高。这可能导致阻抗之间的差异通过使用数值模型和估计测量实验。除了声辐射力量,斯托克斯阻力,和细胞相互作用的力量,细胞之间的引力和微流控室的墙壁可能发挥作用,当细胞非常靠近墙。然而,这种吸引力很小的声辐射相比的力量。

此外,在液体培养基,细胞会导致声波的散射,然后影响声压场的分布。声场的变化引起的细胞在这项研究中被忽视的存在。细胞大小会影响细胞的分布位置在acoustophoresis结束。一个更大的细胞需要很短的时间被放置在正确的位置(56]。小细胞大小导致小声辐射力量,使细胞不能位于interdigital微电极在很短的时间内,从而影响测量阻抗值。然而,在这项研究中,超声治疗持续了30多岁,有一个15分钟的时间细胞下降到微流控室的底部表面。时间是足够长的时间捕获的大多数细胞在正确的地方。

在线性阻抗频谱测量,条件应该满足通过应用一个励磁信号振幅足够低。高振幅的扰动可能会引起阻抗谱的失真,导致错误结论。然而,当激励振幅过小,信噪比低(57]。在我们的工作中,正弦电压的振幅是30号(峰)。Kramers-Kronig变换(58)被应用于测试测量的线性系统。阻抗光谱学数据在我们的工作是安装在一个修改反等效电路与一个常数阶段元素(28]。拟合误差很小。Kramers-Kronig测试进行了使用商业软件ZView v4.0e(斯克里布纳尔出版社Associates)。获得的电阻抗谱Kramers-Kronig转换是在良好的协议与原数据。它是合理的假设线性标准阻抗测量系统很满意。此外,在另一项研究[54),50 mV的正弦电压应用在互相交叉微电极生物传感器测量阻抗的细菌悬浮液。我们的工作是小的激励振幅。

应该考虑另一个问题。酵母细胞不完全的球形。他们的行为在流体介质中声场是复杂的。细胞旋转对测量结果的影响应注意。使用细胞几何模型与数值模拟更细结构将进一步验证检测系统的性能。

概述酵母报道方法基于生物传感器的检测提出了表2。Tubia et al。18捏造一个互相交叉携带抗体的微电极传感器和测量的阻抗谱培养基监控酵母的生长。这种生物传感器适用于实时检测的细胞代谢活动而不是实际的细胞浓度。阿卜杜拉et al。12)使用biorecognition元素修改谐振光子光栅传感器和检测到的表面生物淤积在燃油系统检测下限(17细胞/毫升)。检测极限的方法在我们的工作估计16个细胞/ mL,据FDA指导(59]。我们的方法检测酵母细胞的能力与他们的方法。我们的方法的优势可能来自于降低检测成本,因为检测过程不需要昂贵的仪器,如光谱仪。另一项研究[60)使用超顺磁的纳米粒子改性与亲和力bioreceptors丰富酵母细胞。酶分子被绑定到细胞。之后,测量电流的检测酵母是由碳的丝网印刷电极。这种方法有一个非常低的检出限和线性范围宽。然而,酶活性可受样本影响温度和pH值等属性。太赫兹槽天线(14)申请个人酵母细胞的检测。灵敏度高,虽然线性范围是有限的。其他的研究20.]也促进了酵母细胞检测的发展。与发表生物传感器相比,本文提出的传感器具有成本低、操作简便,试剂消耗低,容易集成到便携式设备。

根据图11,阻抗谱变化明显与酵母细胞浓度的变化。然而,该模型在本研究中没有考虑影响之间的界面双电层的指状组合型微电极和电解质,抗体层的电特性在微流控室的底部,细胞抗体结合动力学和寄生电容的阻抗谱。在未来的研究中应该弥补这一缺陷。传感器的特性需要通过实验进一步验证。

6。结论

所以一个impedimetric传感器与超声检测酵母的细胞定位。这个传感器的建模是由声学耦合模块的压力,固体力学,静电学、电流和粒子跟踪软件COMSOL流体流动。声压分布,辐射力量,acoustophoretic细胞追踪,阻抗谱研究了澄清测量系统的工作原理。根据仿真结果,超声波协助细胞排列有利于提高检测性能。除此之外,它可以结合其他技术,如免疫化学和细胞印迹,改善小粒子探测效率目标。简化的二维模型提供了一个有效的生物传感器的设计和优化的工具。然而,实验测试需要进行进一步优化传感器的结构。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由中国国家重点研发项目(2019 yfc2003301),重庆市教委科学技术研究项目(KJQN202000636 KJQN202000624),开放重点实验室Opto-Technology和智能控制的基础教育部(兰州交通大学)(KFKT2020-08),重庆市自然科学基金(cstc2018jcyjAX0571),科学技术研究计划的项目中国重庆市教育委员会(KJZD-K202000603)和重庆邮电大学博士启动基金(a2017 - 133)。