文摘
在这项研究中,我们综合基因检测与微流体聚合酶链反应(PCR)技术检测花生DNA。一个cross-junction微通道被用来诱导乳液的水滴在石油PCR芯片上。与单相流相比,乳化液滴流表现出蒸发和阻止气泡生成数量低7.24%。PCR结果花生DNA片段的液滴微流控芯片PCR检测验证了与商业PCR相比热循环和绿色reagent-based PCR SYBR荧光强度增加。此外,PCR芝麻PCR微流控芯片上是成功的,沙门氏菌spp。,金黄色葡萄球菌。液滴微流控PCR设备开发的这项研究可以申请花生检测食物过敏的上下文中。
1。介绍
食物过敏是一个重要的公共卫生问题影响儿童和成人(1]。对花生过敏是最常见的食物过敏1- - - - - -3]。大多数对花生过敏反应是免疫球蛋白E-mediated反应可能导致严重的过敏反应(4]。因为严重的过敏反应的风险和可能的死亡和缺乏有效的治疗食物过敏(1,5食物过敏改进),最好的方法是严格避免冒犯的食物(6]。
相对于宏观等价物在聚合酶链反应(PCR)系统中,PCR微流控设备有几个优点,如样品和试剂消耗降低;这些优势使廉价的系统操作,促进小热质量,低的热惯性,和快速传热,提高PCR扩增的效率(7]。微流控PCR设备已经吸引了大量的关注8,9),广泛应用于各种领域,如生物、化学、医学、法医学、食品技术、环境科学(10]。微流控PCR设备可以分为两种类型,即单相微流体PCR和液滴微流控PCR。液滴微流控系统使用两种非混相流体已成为一种很有前途的工具。这些系统减少分析时间,提高灵敏度,降低检测极限,增加大规模筛选,提高操作的灵活性(11- - - - - -13]。与单相微流体PCR相比,液滴微流控PCR展品更好的防止生物或化学吸附在微通道表面,否则会导致微流体PCR抑制和结转污染(14]。几项研究的液滴微流控芯片上集成PCR已经好了(14]。
锅等。15)综合多室PCR和多通道并行遗传分离分析检测乙型肝炎病毒,结核分枝杆菌人类白细胞抗原和基因型。王等人。16)开发了一个oscillatory-flow多重PCR在毛细管微流体通道的同时测定沙门氏菌血清,大肠杆菌O157: H7,单核细胞增多性李斯特氏菌。Cai et al。17)使用了一种微流体系统,整合介电泳芯片多元阵列PCR等病原体的快速识别铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌O157: H7复杂生理上的矩阵。立花等。18)开发了一个自动一次性塑料微流控PCR芯片控制通过毛细管流微通道中的试剂的定量检测大肠杆菌。刘等人。19]介绍了PCR的平台,与红外兴奋bottom-well微流控芯片集成温度控制方法和荧光codetection三为人类乳头状瘤病毒PCR产品。宋et al。20.)开发了一种一次性PCR芯片从聚合物膜减少热质量,和大肠杆菌基因组DNA被放大。
到目前为止,大多数微流体PCR设备已经开发了病原体检测。然而,微流体PCR设备很少用于食源性过敏原检测,包括花生物种的DNA片段的检测。因此,本研究的目的是开发一个液滴微流控PCR设备上下文中的花生检测食物过敏。
2。材料和方法
2.1。化学物质
SU-8负面基调光阻和SU-8开发人员从MicroChem购买(美国马牛顿)。聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物(Sylgard 184)和固化剂是购买从道康宁(美国米德兰,MI)。ProTaq DNA聚合酶,ProZyme PCR缓冲(10 x缓冲区;100毫米Tris-HCl, pH值8.8 25°C;15毫米MgCl2;500毫米氯化钾;和1% Triton x - 100), TAE缓冲区,bio - 100质量DNA梯,和6 x加载缓冲区(30% 甘油,0.25% 溴酚蓝,和0.25% 二甲苯苯胺)从Bio-Protech购买(台北,台湾)。购买10毫米的核苷酸混合物从基因组学(台北,台湾)。由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色主人混合购买从罗氏诊断(德国曼海姆)。矿物油(M3519-1L)和Sigmacote买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。热变色颜料得到从台北新棱镜(台北,台湾)。
2.2。芯片设计
与cross-junction液滴微流控PCR芯片微通道是由载玻片衬底(长/宽/深度: )。PCR液滴微流控芯片是由两部分组成,即上游cross-junction微通道和下游蜿蜒的微通道。如图1,cross-junction微通道用于液滴形成和蛇纹石微通道滴运输三个温度。中间的通道和两侧通道使用cross-junction微通道注入分散和连续阶段,分别。cross-junction宽度是200年μ米,另一个微通道是300年μm。35重复周期发生在蜿蜒的微通道,和总长度PCR液滴微流控芯片微通道的261.7厘米。
(一)
(b)
2.3。微流控芯片制造
SU-8微流控芯片模具使用光刻(图是捏造的2)。负光刻胶SU-8 50是自旋涂到4英寸硅晶片在1930 rpm 30年代在95°C和软烤22分钟。面具是应用于对准器11.06年代(365 mJ /厘米2模式)的紫外线曝光,被转移到SU-8 50。曝光后烘烤在65°C进行了1分钟,再以95°C 6分钟。未曝光的SU-8 50是通过治疗溶解SU-8开发解决方案6.8分钟。然后,SU-8主模型是在异丙醇冲洗和hard-baked在150°C完成交联。此后,PDMS预聚物和固化剂混合的重量比10:1 ( )和脱气。PDMS混合物被注入模子捏造SU-8大师。热固化后为2 h 65°C, PDMS副本是脱离SU-8主模具,和港口穿孔示例输入和输出。最后,PDMS复制品和玻璃衬底通过氧等离子体处理保税PCR微流控芯片。
2.4。温控加热平台
图3描述了设计的加热器总成。加热平台使用胶木( )平台底物和一个0.1毫米的玻璃纤维板作为隔热层以减少热传导和热对流干涉每个加热器。两个平面电热铝板加热器( )被用于DNA变性(95°C)和引物退火(60°C)。第三个电热铝块加热器( )和一个可调高度用于DNA扩展(70°C)。铝块( )被用作传热介质。热电偶是温度测量的插入块。铁夹具和底部耐热海绵是用来保持完整接触PCR液滴微流控芯片和加热平台。proportional-integral-derivative的温控反馈系统包括控制器(Mac 10 d, Shimax、秋田犬、日本),和一个固态继电器(KD20C25AX, Kytech、桃园、台湾)被用来保持稳定的温度三个加热区域的PCR。
2.5。芯片上的聚合酶链反应
芯片是在烤箱烤100°C 8 h呈现PDMS微通道表面疏水性(21]。随后,整个微通道引入Sigmacote表面活性剂形成微通道表面的疏水膜。PCR胶粘剂密封膜(Microseal B Bio-Rad大力神、钙、美国)应用PDMS表面PCR微流控芯片,以防止蒸发的混合试剂。强劲接触,热导电板放置在微流控芯片和加热平台。
演示PCR液滴微流控装置的性能,花生品种的DNA模板用于PCR扩增。此外,该DNA芯片验证的芝麻,沙门氏菌spp。,金黄色葡萄球菌用表表示,特定的目标基因1。DNA扩增的PCR混合物包含2.5毫米核苷酸,2 U ProTaq DNA聚合酶在ProZyme PCR缓冲(10 x缓冲)10μM的底漆,模板DNA。PCR试剂和矿物油混合同时注入的微流控芯片分散相进口和连续相入口通过两个独立的注射器泵(ne - 300泵系统公司。新时代,美国)。最后,放大产品收集的埃普多夫管出口,放大产品和矿物油使用微型离心机分离。放大产品的底层埃普多夫管绘制和分析在2%琼脂糖凝胶电泳(Mupid-2迷你凝胶电泳系统,Cosmo生物,东京,日本)。
3所示。结果与讨论
3.1。温度测量
图4说明玻璃衬底的温度分布在PCR液滴微流控芯片放置在加热平台通过红外温度记录(TAS-G100EXD、NEC、日本)。结果表明,温度分布均匀温度分为三个区域,相应的在95°C DNA变性在右边,扩展在中部地区的70°C,和引物退火60°C在左边。此外,在微流控芯片微通道的温度测试使用热变色涂料表现出一种颜色变化从黑色到无色温度高达70°C。如图5的热变色颜料微通道对DNA变性是透明的右边,中间的灰色区域的扩展,对引物退火和黑色的左边。这些结果证实,均匀温度分布是PCR热条件实现DNA变性,引物退火和延伸。
3.2。蒸发水的微流控芯片
进行了一个蒸发实验来确定液滴微流控的程度减少蒸发相比,在单相微流体PCR。在PCR在相同的温度梯度条件下,收集到的液滴微流控芯片的输出流测量使用的五位电子天平3例,即水、矿物油、和乳液液滴在矿物油(水滴)。相比之下,分散和连续阶段的流速在乳液液滴的情况下设置相同的水和矿物质油情况。表2总结了实验条件和结果。水的退化质量流率(情况下),矿物油(B)和乳状液液滴(C)在微流控芯片分别为1.41,1.50,和3.02毫克/分钟。假设没有发生蒸发矿物油,水的质量流率的乳液液滴被减去的质量流率评估案例B的质量流率情况下c .净质量流率的水乳液液滴是1.52毫克/分钟,这是高于1.41毫克/分钟,以防这0.11毫克/分钟的差异(7.24%)是水的蒸发减少液滴微流控PCR与单相微流体PCR相比。大大减少水蒸发液滴微流控PCR阻止泡沫生成和稳定流动状态。因此,在这项研究中液滴微流控芯片的设计解决了泡沫问题中观察到单相微流体PCR (22,23]。
3.3。DNA扩增
图6说明cross-junction液滴形成的微通道使用高速数码相机拍照(美国帕萨迪纳CA集成设计工具)安装在一个倒置显微镜(Eclipse Ti-E尼康,尼康,神户,日本)。矿物油的体积流率是2.500μL / min, PCR试剂混合物为0.750μL / min。结果表明,对称剪切力由矿物油流逐渐变窄的PCR试剂混合物的流动在cross-junction然后形成一个球形的乳液液滴在扩大下游微通道由于界面的紧张局势。乳液液滴移向下游蜿蜒的PCR微通道。
图7(一)描绘了凝胶电泳结果花生产品。白色的像素组成的目标乐队PCR产品从PCR液滴微流控芯片是比商业PCR热循环(GeneAmp PCR系统2720年,珀金埃尔默,Branchburg,新泽西,美国),和花生示例模板DNA PCR之前没有信号。这些特定的目标乐队使用ImageJ软件进一步分析量化的平均荧光强度白色像素(图7 (b))。显示在图7 (b)PCR产物的荧光强度,液滴微流控PCR芯片大约是两倍强度从商业PCR热循环。更高的荧光信号从液滴微流控PCR芯片可能归因于PCR产物的浓度,进而是一个小型蒸发的结果流解决方案。
(一)
(b)
此外,SYBR绿色reagent-based PCR进行PCR液滴微流控芯片。PCR产物的荧光强度的花生DNA模板确定使用之前开发的紧凑型系统与光纤耦合发光二极管(LED) (24]。在这个检测系统,12μL样品溶液使用470 nm领导很兴奋,和荧光波长检测到505至545海里。结果显示,荧光信号环境的背景是13.13 nW,花生模板DNA的荧光信号在PCR 19.95西北,和PCR产物的荧光信号从液滴微流控PCR芯片增加到57.85西北。因此,PCR试剂混合物和SYBR绿色reagent-based PCR试剂证实了液滴微流控PCR芯片成功进行PCR扩增DNA花生模板。
图8演示了液滴微流控PCR芯片的能力在申请各种物种,包括181个基点的ITS1花生、406个基点金黄色葡萄球菌146 bp的2 s从芝麻、白蛋白和237个基点沙门氏菌spp。如图8(一个)和8 (b)从液滴微流控PCR、PCR产品芯片都清晰可见,但这些模板DNA。目标区间的诽谤金黄色葡萄球菌可能发生因为电泳缓冲液的离子浓度,减少核酸酶,或退化的凝胶电泳(25]。
(一)
(b)
(c)
两个温度PCR也表现在PCR液滴微流控芯片。沙门氏菌种虫害作为目标基因和DNA变性和引物退火温度或扩展放大94°C和70°C,分别。如图8 (c),目标DNA成功放大的237个基点沙门氏菌spp。然而,PCR产品显示不均匀性的荧光信号。因此,开发微流体PCR芯片是可行的各种物种的DNA片段的扩增,确认PCR液滴微流控芯片是一个潜在的诊断方法对于识别食物过敏原如花生和芝麻。
4所示。结论
本研究开发了一种液滴微流控PCR设备放大特定花生DNA片段检测食源性过敏原。拟议中的液滴微流控PCR芯片减少了蒸发的PCR反应试剂稳定微通道中流体流动,从而提高PCR扩增的效率与单相微流控芯片。花生模板的PCR产物的DNA PCR液滴微流控芯片验证了与商业PCR相比热循环和增强在SYBR荧光绿色reagent-based PCR反应。发达的设备也被成功地用于放大DNA不同物种,包括芝麻,沙门氏菌spp。,金黄色葡萄球菌。这液滴微流控PCR芯片可以应用于增加花生DNA分析的效率检测食源性变态反应的上下文中。
数据可用性
没有数据可用性。
信息披露
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的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作得到了科技部,台湾。