电动细胞基质细胞在缺氧条件下影响阻抗传感和碳酸酐酶抑制

文摘

肿瘤低氧提供了一个动态环境对肿瘤细胞生长和转移。信息评价细胞生长,细胞表面相互作用因此在缺氧条件下高度需要建立治疗方案。电动细胞基质阻抗传感通性一直在传统手机平台的评价作为一种实时label-free impedance-based方法研究细胞生长在组织文化的活动,但其应用为缺氧环境很少报道。我们提出实时评价低氧诱导生物效应与关注肿瘤缺氧pH值的监管环境。为此,multiparametric实时分析平台使用电阻抗谱(EIS)、人类结肠癌HT-29细胞是先进的。EIS数据的时间序列可以监测高时间分辨率的改变发生在细胞层内,特别是在细胞基质水平。我们揭示了细胞的动态变化过程在缺氧条件下,针对应用乙酰唑胺(阿扎)、碳酸酐酶抑制剂。光学评价和pH值评估补充细胞的电分析对建立一个模式的变化。该分析平台显示广泛的适用性对缺氧生物效应的细胞水平的评价。

1。介绍

低氧环境对快速增长的特点,实体肿瘤(1]。精心策划的肿瘤细胞缺氧反应提供了癌细胞代谢优势和能力转移(2),缺氧与侵略性的肿瘤扩散,抵抗治疗和预后不良(3]。

向无氧糖酵解代谢的改变,缺氧的典型属性肿瘤细胞,负责肿瘤微环境内的酸性环境(4]对癌症发展和治疗结果的影响。然而,代谢glycolysis-impaired肿瘤(证明当地葡萄糖和氧气可用性独立影响肿瘤酸度(5])显示有限公司₂除了乳酸酸度在肿瘤的一个重要来源,表明碳酸脱水酶(CAs)作为肿瘤发展的重要贡献者在药理管理(5]。而有16种CA同功酶(them-CAI,二,三,七,十三世被细胞质,CAIV,第九、十二、十四、和XV-membrane-bound CAVa-mitochondrial和Vb和CAVI分泌),只有低钙同功酶、CAIX CAXII,众所周知,通过调节pH值在促进肿瘤生长的肿瘤微环境(6)和肿瘤相关。因此,有一个巨大的兴趣设计和测试的目标,有效的抑制剂。因此,潜在的CA抑制剂是不断扩大的列表,和特别关注CAIX同种型由于其重要的作用在调节两个额外的——和肿瘤细胞间的pH值对生存和增长7),其高度活跃的细胞外酶域,和低氧诱导表达与预后不良相关。

乙酰唑胺(阿扎)杂环主要磺酰胺,中科院是一个著名的催化活性的抑制剂(6]。阿扎用于治疗青光眼、水肿、心力衰竭、高山病,据报道,显著减少细胞增殖和诱导细胞凋亡在人类癌症细胞缺氧,因此是一个重要的模型抑制剂的设计新颖的化合物。通常,CA抑制效率的预测是基于胞外酶活性的评估和端点生化细胞分析,信息不适合指导新抑制剂的定制设计。

端点分析相比,使用label-free分析平台允许动态评价离散的非致命性的影响外部刺激在细胞水平上8),使一个更微妙的,multiparametric评估潜在的生物效应(9]。这些包括细胞生长和形态学的变化(10)、细胞运动、信息交流(11),和其他行为由细胞的细胞骨架12在特定的(包括缺氧)的条件下)。因此,他们是无价的工具的开发和临床前测试新的治疗化合物。

生物电阻抗细胞培养平台显示广泛的实用程序在生物医学应用和最近被显示为癌症研究提供动力(13]。这些平台的核心是电阻抗(EIS),一个敏感的方法,提供非侵入性和电气和形态学参数实时检测细胞层细胞外的压力。EIS使用交流电(AC)的低振幅,宽的频率范围内,测量电极阻抗的细胞生长。根据形态学(14](细胞形状和体积的变化)、附件(细胞基质粘附的变化),和电气性能,电极之间的细胞或影响电流的流动,形成被测信号的特征对应于选定的频率(15]。因此,EIS使细胞性质的研究像附件16)和传播(17)、生长和增殖18,19,微动20.,细胞凋亡21)、转移潜能和内皮屏障功能,和[的相互作用22),作为一个强大的补充多极阵列(MEA)录音技术(23]。化学、生物或物理刺激改变当前路径通过和周围细胞修改系统的阻抗使EIS足够敏感的方法被用来评估外部刺激的细胞反应(24- - - - - -27)和细胞行为响应外部/环境条件的变化,如pH值、温度、光、化学/生物物质。是顺从的多路复用,它可以结合光学和微流体分析和控制环境条件。然而,EIS细胞在缺氧条件下分析很少报道(28- - - - - -30.]。

旨在描述细胞的动态变化在低氧的情况下,本研究提出的实时评价低氧诱导生物效应与关注肿瘤缺氧pH值的监管环境。我们选择阿扎探针阻抗传感的能力作为一个实时检测的抑制作用没有影响行动的潜在变化的具体机制,CA类型,或本地化,在更广泛的观点若相关性。该分析平台结合HT-29细胞培养在金膜电极阵列多频阻抗测量和缺氧条件。与光学显微镜和pH值测定,缺氧的平台使评估的生物效应提供洞察细胞过程的动态变化癌细胞暴露于低氧环境和CA抑制作为新的癌症疗法的临床相关的目标具体为缺氧肿瘤。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

结直肠癌细胞HT-29(写明ATCC HTB38) Dulbecco-modified鹰的培养基培养(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫和penicillin-streptomycin(100国际单位/毫升- 0.1毫克/毫升)。细胞被播种在浓度为4.5×10⁵细胞/毫升IBIDI欧洲互通性系统委员会(电动细胞基质阻抗传感)文化制品(8 W10E PET)和培养2天在标准的生长条件。到达融合,细胞内受到(MCO-20AIC三洋、日本)5%的股份₂孵化器特定生长条件与正常(21%啊₂)或低氧(1% O₂)浓度。后复氧,缺氧条件下,介质被新的取代介质和细胞保存在常氧条件。培养基的pH值测定实验开始时,立即在每个实验过程的结束。

2.2。低氧条件下

缺氧条件获得使用模块化的孵化室(mic - 101, Billups-Rothenberg Inc .)中插入MCO-20AIC主要孵化器和配备一个专用的测量电极阵列的山IBIDI欧洲互通性系统委员会的文化制品。室的气氛由94% N₂,1%的人啊₂,5%的公司₂。

2.3。CA抑制

乙酰唑胺(222.2≥99%,粉、Sigma-Aldrich、Da),一个pancarbonic脱水酶抑制剂,溶解在20%二甲亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich) PBS准备10毫米股票的解决方案,进一步在100年DMEM最终浓度的稀释μ米,之前的实验。0.2% DMSO作为载波控制。

2.4。电阻抗谱测量

电阻抗光谱学使实时监控细胞和基质之间的相互作用和细胞过程的研究31日]。4294精密阻抗分析仪(安捷伦、日本)界面的多路复用模块(8频道),内部开发的,用于记录(AC的应用潜力100 mV振幅与零直流偏压)阻抗数据的时间序列( 极坐标形式取决于模数和相位 ,与ω——角频率)对应于100 hz - 100 kHz频率范围(100个频率点与对数分布)。通过定制开发的虚拟仪器界面数据收集和处理的时间序列表示为单一频率阻抗或等效电路参数。单一频率的数据(相对应的等效电阻复数阻抗的实部10 kHz)规范化使用公式 使用软件包OriginPro 8.5 (OriginLab)。整个光谱的复杂的阻抗 进行分析和复杂的安装了一个简化的等效电路(ZView, Solartron分析,英国)获得时间演进的具体电路参数函数的缺氧环境和CA抑制效果。

所有的值表示为平均值±标准偏差(SD)至少3实验。

2.5。光学显微镜实验

明亮的传播和反射光学显微镜被用来评估label-free,活细胞受到常氧和缺氧条件。显微镜设置包含一个AxioObzerver Z1(德国蔡司)平台,一个20 x 0.4 NA客观(德国蔡司),一个和或DU885 EMCCD相机,和一个环境控制外壳(有限公司₂和温度,OKOLab,意大利)。先进的分析、细胞浓度的5×10被播种⁴细胞/毫升与玻璃培养皿底部(世界精密仪器Inc .)和评估一个40 x 0.95 NA客观实验第二天。

肌动蛋白细胞骨架形态是通过使用细胞荧光成像技术成像和4%多聚甲醛固定20分钟和permeabilized 0.1% Triton x - 100 - 2%牛血清白蛋白溶液(准备在PBS)在室温下1 h。丝状肌动蛋白(f -肌动蛋白)与20贴上标签μg / mL phalloidin共轭与异硫氰酸荧光素(FITC;德国Sigma-Aldrich)在室温下1 h。核沾染了2μ4克/毫升 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;英杰公司、美国)在室温下10分钟。

2.6。细胞增殖实验

细胞增殖是评估使用体外毒理学试验装备Sulforhodamine B(美国Sigma-Aldrich)根据制造商的指示。细胞被固定通过添加50%三氯乙酸在1/4比例增长媒体(v / v),孵化1 h在4°C,和彩色的20分钟0.4% sulforhodamine b之后,这些细胞被冲洗迅速以1%醋酸和合并染料与10毫米可溶性三的解决方案。使用分光光度计吸光度测量在490 nm(美国热科学),结果被表示为相对比例控制(常氧细胞)。

3所示。结果

EIS测量频率范围宽(100 hz - 100千赫)进行实时监测细胞生长和评估和动物细胞单层应对缺氧条件和阿扎的应用。

单一频率的阻抗数据的分析识别了界面效应和膜过程的频率最高影响测量阻抗值。所选频率10 kHz,频率适合监测细胞的粘附过程电极(21]显示特征变化在细胞表面水平对细胞生长和缺氧调节pH值(图1)。我们选择代表性的细胞动力学在不同条件下测量复数阻抗的实部在给定的频率(如给出的 )包含在我们的分析可能的模量和相位变化发生细胞进化的函数。

当细胞附着和扩散电极,电阻抗增加作为电介质细胞体阻碍电极之间的电流(图1(一))。因此,阻抗的实部的进化10 kHz使评价细胞单层。融合实现和阻抗值后到达了一个高原(图1(一))~ 48 h后,细胞暴露于低氧条件。

细胞通过特定的适应反应进化到保护细胞免受永久性损伤或死亡是无处不在的32]。同样,缺氧条件触发特定细胞适应低氧的可用性与一个巨大的文献关于HT-29能力承受和适应低氧环境33- - - - - -35]。参与细胞信号网络的复杂性应对缺氧是包罗万象的,稳定和激活的转录因子HIF-1(通常是在常氧条件下退化)和其下游目标细胞对低氧条件下的一个特点。CAs(特别是CAIX)代表一个HIF-1目标与糖酵解和pH值规定还包括monocarboxylate运输车、葡萄糖transporter-1,乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶(36]。

如图1 (b),符合细胞适应低氧的情况下,在前两个小时的缺氧,阻抗值显示一个小瞬态相应下降,细胞重新排列,包括分离的一些细胞表面。

当细胞开始适应缺氧环境,两相的行为显而易见:在最初增加~ 5%的归一化阻抗值,后6 h(缺氧)的阻抗值开始下降(图1 (b)红线)。检查记录是否阻抗变化与细胞表面相关变化或细胞死亡,我们监控后续12 h(缺氧复氧以及一个附加的步骤。虽然延长缺氧条件(缺氧II)与一个额外的12 h揭示大规模电极uncoverage缺氧细胞表面分离,当细胞受到缺氧表现常氧氧条件(再氧化),阻抗值(应考虑误差)证实,大多数细胞适应低氧的压力是可行的和管理与后续的结构和形态的变化。意识到HIF-1的稳定和激活细胞密度的函数(37初),细胞confluency实验被控制在100%以下。

从分子的角度来看,出现缺氧条件下,对应upregulation中科院(特别是CAIX CA9基因的转录激活的结果由HIF-1) (38一般报告)。而CAIX表示(但不是催化地活跃)HT-29细胞即使在normoxia CAIX激活和超表达是缺氧条件下的特征(39]。使用准确的细胞系和荧光,具体CAIX抑制剂,我们最近40]表明,缺氧引发CAIX表达HT-29活细胞实验。8 h后缺氧,我们显示相对应的特定的荧光信号CAIX活跃。重要的是,在缺氧条件下(缺氧)早在30分钟,现有CAIX成为催化地活跃,能够结合抑制剂(包括阿扎)(39]。

值得注意的是,CAIX是肿瘤生长和转移的功能中介在缺氧条件下(41]。因此,而阻抗值不是特定于特定的分子过程,为了测试这个适应,我们使用一个已知的抑制剂,阿扎,享年100岁μ米的浓度。所示的浓度选择低于治疗浓度抑制CA功能的60 - 70% (42]。相比大多数可用的文学只提供端点的数据分析,我们的研究能够突出细胞层的动态适应缺氧条件下和轻微的抑制。

这些动态变化异常显示使用阻抗:人物1 (c)常氧突显出不同的演进,常氧+ CA抑制,抑制缺氧,缺氧+ CA条件。阻抗值的单调增加10%与单层收紧在常氧条件下,而两相的动态显示在缺氧条件下进一步改变由于阿扎生物效应。独自缺氧相比,阿扎显示的应用进一步降低阻抗值指示电极表面形态改变的细胞,细胞适应低氧环境是阻碍(图1 (c)由于CA抑制)。

补充细胞生长试验,sulforhodamine测试(图1 (d)),显示适度减少细胞增殖在缺氧条件下(20%变化对缺氧条件和阿扎曝光),与文献报道[协议34)在一个8 h暴露人类腺癌HT-29细胞缺氧导致14%损失的可行性,用台盼蓝化验。

以适当的频率选择、单一频率分析能够揭示细胞动力学特征与传感的潜力。然而,这是一个简化的分析平台的复杂性。实时评估和动物细胞单层阿扎的缺氧反应条件和应用,从整个频域测量获得的实验数据是配备了一个等效电路的元素,固定相元素(CPE)、电阻、和电容器是归因于组件在生物探针等paracellular空间,细胞单层或细胞表面接触。电路被认为足以适应测量阻抗谱是描述一个常数相元素(CPE)代表细胞monolayer-electrode接口,一个电阻(R_p),定义了paracellular路线并联电容器(C_c),描述了细胞单层和本体溶液的电阻(R_索尔)(图2(一个))。CPE的阻抗特征是两个独立的参数,振幅,CPE_{_T},分布参数指数CPE_{_P}根据公式 。当CPE的价值_{_P}= 1时,CPE的行为作为一个理想的电容器,而0时,CPE的行为作为一个纯电阻。CPE用于模型,与双层电容有关,以补偿系统中的非均质结合粗糙/多孔电极表面和非齐次细胞附件。事实上,CPE的固定相的元素_{_P}0.9和1之间的值来自于拟合。

虽然等效电路并不是独一无二的,是选择让长时间评估通过不同实验条件下复杂的拟合阻抗变化。对比实验和适合特征模量和相位谱图所示2 (b)。

元素的归一化值拟合比较后获得的电路( )常氧细胞,细胞缺氧,缺氧细胞孵化与阿扎获得互补信息关于这些条件对细胞引起的生物效应。

最相关的变化了R_p和C_c值(数据3(一个)和3 (b))与CPE和适度的变化R_索尔参数(数据3 (c)和3 (d))。

增加了R_p缺氧细胞对应增加单层密性(信息联系人),发生在细胞开始适应低含氧环境和表面变平。与阿扎的缺氧细胞孵化,R_p按照减少减少细胞表面粘附,和交互(图3(一个))。归一化的演变C_c为更好的比较值(倒: )对缺氧细胞在常氧条件相似,显示良好的电极覆盖在适应新的低氧和正常细胞生长条件,分别。另一方面,对缺氧细胞接受阿扎,C_c变化,虽然温和(10%),强调宽松细胞附件和电极(图的报道3 (b))。这些值证实的值降低R_p组件确定形态、信息和细胞表面变化引起缺氧和阿扎下曝光。

证明在互补生化评价细胞增殖(图1 (d))、缺氧条件下能够诱导细胞数量减少。减少和相关细胞的变化对表面可以观察到相关漂移在CPE(< 2%)值(图3 (c))。

的漂移R_索尔参数(< 5%的数字3 (d)所有实验条件)也有类似的趋势,可以与细胞metabolism-induced分批培养条件的变化。

验证阻抗发现和阐明细胞负责这些特点趋势变化,先进的显微镜(图4)已经被部署在生活和固定细胞。微分干涉对比(DIC)和明亮的标签反射的光(BFRL)图像实现工况,对活细胞,整体突出HT细胞的形态学和细胞表面的质量附件,分别。BFRL试验已经选择了它能突出细胞区域不能完全接触表面的支持。BFRL设置,将会有一个相对强劲的反射,和背景将明亮,地区缺乏细胞,在细胞的存在背景强度将被改变43]。粘附的灰色水平不同拓扑图像与细胞膜之间的距离和玻璃界面(暗区=密切接触区)44]。一个更扁平形态(DIC的明显对比)和更大的压力液泡(箭头在DIC图像)显示在DIC化验。有趣的是,更大的接触最近报道对高转移性细胞比少转移使用BFRL干扰分析(45]。我们BFRL化验显示缺氧细胞暴露于阿扎一个更为分散的细胞骨架(可见广泛反映追忆那些白色区域的中心细胞)和可能的细胞完整性的影响(箭头BFRL图像揭示区域皮质细胞分离或解体的环形肌动蛋白)。

荧光数据,与细胞核内用DAPI标记和f -肌动蛋白细胞骨架与phalloidin-FITC贴上标签,化验在固定细胞和揭示了更多的传播和扩散细胞骨架,强调作为一个更广泛的绿色区域周围的细胞核,缺氧和混合暴露(缺氧+阿扎)相比,控制图像。此外,细胞的完整性受到影响的地区,也就是说,地方的皮质环形肌动蛋白细胞边界消失(箭头)是可见的在混合暴露(缺氧+阿扎)条件下,进一步证实了DIC和BFRL数据。

无力控制细胞内的pH值已经产生不良后果不同的细胞过程包括增殖和生存46]。为了应对缺氧,细胞适应和调整对无氧糖酵解代谢,负责肿瘤微环境内的酸性环境和表达CAs(特别是CAIX起着重要的作用在调节pH值额外和细胞间)对肿瘤生存和生长(47]。低氧诱导CAs维持细胞内的pH值有利于肿瘤细胞而导致肿瘤的酸化环境,促进肿瘤的转移。为此,中科院调节pH值和离子平衡催化二氧化碳的互变现象(有限公司₂)碳酸氢离子(HCO₃⁻)和质子(H⁺)[7]。检查缺氧条件和抑制剂暴露的影响,样品的生长培养基的细胞培养的实验测定和12 h后化验使用标准的酸度计。pH值评价表明,事实上,缺氧条件导致了相对酸化细胞外的细胞培养基(图5)。孵化后与100年μM的阿扎在缺氧条件下,细胞外的降低pH值降低,按照阿扎的抑制作用活跃CAs (7]。此外,阿扎在常氧细胞外的pH值的影响是微不足道的。

4所示。讨论

低氧环境对快速增长的特点,固体肿瘤,与侵略性的肿瘤扩散,抵抗治疗,预后很差。

阻抗研究细胞在缺氧条件下很少报道(29日,48),专注于屏障功能化验。端点分析相比,使用这种label-free分析平台允许动态评价离散,在细胞水平上的非致命性的影响外部的刺激,使定量,multiparametric评估潜在的生物效应。我们的研究表明细胞缺氧引起的影响条件的动态评价和化学抑制CAs和表明缺氧文化的强大若方法。HT-29细胞被用作生物分析法细胞系模型由于其良好的依从性,稳定增长的条件下,通过过度和能力适应低氧环境的CAs(尤其是CAIX视为一种内生的标志缺氧),协调精心策划的肿瘤细胞缺氧反应提供癌细胞代谢优势和能力转移(6]。这个角色在肿瘤进展和转移是由于高发的跨膜CA同种型能力维持肿瘤细胞内的pH值内稳态,酸化细胞外环境(7]。CA功能的另一个重要方面,潜在的减少信息附着力不稳定的钙粘蛋白细胞骨架的链接,可能导致增加肿瘤侵犯的收购49]。针对中科院在一般情况下,当前的研究利用成功的展示了EIS label-free,实时和非侵入性方法应用关于细胞分化,细胞扩散,细胞活性,毒理学,细胞毒性,细胞周期进展(15,31日)对缺氧条件评价的定量分析方法和潜在的抑制剂疗效的抗癌化合物。我们选择阿扎探针阻抗传感的能力作为一个实时检测的抑制作用没有影响行动的潜在变化的具体机制,CA类型,或本地化,在更广泛的观点若相关性。最近证明了我们组互补研究[40),有针对性的特异性和深度的理解之间的交互CAIX及其抑制剂也可以实现。

证实与文献数据证明的早期(< 1 h)响应HT-29细胞在缺氧条件下是由激活现有的CAIX其次是CAIX超表达(39),我们的单频率阻抗数据的分析(实部10 kHz)提供了定性歧视不同栽培条件和能够动态显示CA活性的影响(包括过度)在缺氧条件下(7和抑制(使用100年μ在细胞单层膜上阿扎的浓度)。细胞粘附和细胞骨架活动作为有价值的指标(21)了解癌细胞的行为,如增殖、迁移和入侵13),并提供细胞响应概要文件相关的细胞动力学的变化由于细胞外化合物与细胞之间的相互作用(50]。进一步量化这些影响,复杂的非线性拟合的阻抗数据在宽频率范围内证明通过派生的等效电路参数变化特征的单层密性(R_p)和细胞形态(C_cpH值)对缺氧和摄动下homeostasy CA抑制。

通过评估细胞形态(DIC),细胞表面接触(BFRL)和肌动蛋白细胞骨架(荧光),以及细胞外介质的酸化(pH值测量),我们能够证实细胞缺氧的条件引起的影响和阿扎抑制CA强调无创和标签免费使用阻抗生物测定。

总之,这项研究提供了一个有效的传感平台的评价低氧条件和CA抑制作为发展新型抗癌化合物的细胞传感器针对肿瘤缺氧作为一个动态的环境。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

作者的贡献

她曾Stanica和Mihnea Rosu-Hamzescu了同等重要的作用。

确认

拨款的财政支持高等教育行政机构,研究,开发和创新融资(UEFISCDI),罗马尼亚国家教育和科学研究,项目号。PNII-ID pcce - 2011 2 - 0075, pn - iii - p2 - 2.1 - ped - 2016 - 1137。技术支持的太太Florica Moranescu。

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