文摘
早期检测的蛋白质聚合领域的神经退行性疾病是非常重要的。成功的检测蛋白质的聚合α在定量-核蛋白,label-free方式通过functionalising微悬臂α-核蛋白单体和操作它在动态模式的存在α报告-核蛋白在溶液中单体。6 ng的总质量α-核蛋白超过9小时检测表面的悬臂。相比传统的荧光测量结果α-核蛋白在相似的条件下聚合。发现label-free悬臂检测方法需要蛋白质的浓度小于50倍,现有方法和表示潜在的显著更快的响应时间。
1。介绍
帕金森病是一种进行性的神经退行性疾病由詹姆斯·帕金森(1817年第一次描述了1]。它是第二个最常见的神经退行性疾病,影响1 - 2%的人口年龄在65年2]。帕金森病与基因突变有关的基因编码,和聚合的蛋白质α-核蛋白中高度表达包含神经元的多巴胺黑质(2- - - - - -6]。
帕金森病的神经病理特征的存在细胞质内含物称为纤维总量的路易小体α-核蛋白(7- - - - - -9]。淀粉样原纤维的直径200 - 600 nm长5 - 10 nm (2,3,6,10]。α-核蛋白属于本地集团展开蛋白质和包含140个氨基酸残基(11,12]。动物模型表明的积累α-核蛋白可能发挥作用在帕金森病多巴胺神经元的损失(13- - - - - -15]。
Thioflavin T是一个荧光标签α-核蛋白经历改变发射频率在聚合的蛋白质(16- - - - - -18]。通过监测,改变发射频率的强度可以确定蛋白质的聚合率(16]。然而,这种技术需要label-fibril结合化学计量学的知识可变量取决于解决方案条件或类型的蛋白质被调查。α-核蛋白聚集率决定使用Thioflavin T显示强烈的依赖溶液pH值或盐浓度等条件,与孵化时间(在37°C)实现最终强度的一半~ 80小时在酸碱7和70分钟4 (16]。通常大浓度的蛋白质也需要提供足够的强度测量。还存在另一个分子与原纤维会影响绑定动力学;因此,label-free检测技术不影响动力学是可取的19]。
纳米机械悬臂传感器已广泛应用于生物学领域由于其通用性和容易functionalisation广泛的化学和生物分子。这些传感器可在液体(20.),允许检测目标分子的生理环境和交互。悬臂传感器发现应用程序在基因组学领域的21- - - - - -25)、微生物学(26- - - - - -30.),检测的蛋白质(31日),免疫传感器(32和膜protein-ligand交互的调查33,34]。
增长Label-free检测胰岛素淀粉样原纤维通过测量微悬臂偏转的报道(35]。然而,这种方法只跟踪报道悬臂偏转的随着时间的推移和表面应力诱导悬臂的原纤维的生长,因此适用于确定增长的原纤维是否发生和不适合决定以定量的方式相互作用的动力学。
当操作在动态模式下悬臂振动在弯曲的共振频率和充当好微量天平,允许进行定量测量。在流体微悬臂的动态操作都记录在文学理论上(36- - - - - -43和实验38,44,45)由于理解他们行为的重要性与原子力显微镜使用。为整个实验操作微悬臂的液体避免任何阶段变化(例如,液体在空气中),发生在其他实验的设计,如“浸渍和干燥”测量(46),这可能导致损坏的蛋白质被调查。“浸渍和干燥”测量也会导致不必要的缓冲盐的沉淀到传感器表面。这种降水可能导致额外的表面质量可以旋卷的信号测量传感器和导致解释结果的不确定性。为了增加质量敏感性,悬臂的高振动模式可用于恢复一些敏感性的丢失是由于阻尼时操作悬臂在液体而不是空气或真空(47]。
这里聚集的测量α使用标签Thioflavin T -核蛋白和荧光测量与label-free检测使用微悬臂。
2。材料和方法
2.1。悬臂测量
2.1.1。悬臂阵列的制备
微悬臂可以应对任何刺激所显示的传感应用的广泛被应用。因此,精心准备的悬臂阵列必须创建一个传感器,敏感质量变化是由于表面的聚合,也具体所需的交互。使用参考在传感应用中涉及的悬臂梁是至关重要的,如果正确的扣除从记录的悬臂梁的响应。这些实验中使用的悬臂梁是硅悬臂阵列(方向:110)和八个悬臂每个数组(IBM研究实验室、Ruschlikon、瑞士)。250年的悬臂梁有一个音高μ米,500μ100米长,μ米宽,1μ米厚(10纳米厚度的公差内一个数组)。使用数组和悬臂允许包含多个测试原位在一个实验中引用。这大大增加吞吐量和确保不必要的反应测试悬臂的可以考虑。
2.1.2。清洁
除非另有说明所有化学物质从Sigma-Aldrich (Arklow,爱尔兰)。悬臂阵列使用以下协议打扫干净了。苏格兰皇家银行2%的预清洗步骤洗涤剂溶液(丙烯酰胺)2分钟之后,冲洗1 M氯化钠和冲洗18 MΩnanopure水(30秒)。数组被放置在食人鱼的解决方案(1:1的比例H2所以4:H2O2),30秒之后,冲洗1 M氯化钠,EtOH和18 MΩnanopure水混合(1:1的比例),和18 MΩnanopure用水每30秒。数组被放置在食人鱼浴20至10分钟的时间与每个浴后的冲洗过程和以前一样。悬臂阵列被放置在一个异丙醇浴2分钟之前存储在真空,直到需要。
2.1.3。Ti /非盟涂层和Functionalisation
悬臂阵列在盯住硅烷的单层涂层浸泡4900解决方案中的数组μL EtOH, 50μL Hunig基地(N-ethyldiisopropylamine)和50μL(羟基(polyethyleneoxy)丙基]triethoxysilane EtOH (8 - 12 EO) 50% (ABCR GmbH & Co ., 76187卡尔斯鲁厄,德国)2小时在一个线性振动器在120 RPM。
悬臂阵列是涂在上面一边2 nm Ti粘附一层一层随后20 nm盟(40亿年伯明翰金属有限公司、伯明翰、B9,英国)。金属涂层是由电子束蒸发Ti和热蒸发的非盟(爱德华兹汽车500年中行爱德华兹,西萨塞克斯郡,RH10 9 lw,英国)。设置使用Ti: 4.3×10的压力−7马托,46岁,沉积速率为0.4 / s;盟:压力5.4×10−7托,12 mA电流沉积速率为1.5 a / s。悬臂数组存储在真空直到functionalisation所需。
悬臂阵列是functionalised使用自定义制作毛细管functionalisation设置(48]。250年的毛细血管有外径μ米,内径180μ(美国加州国王精密玻璃有限公司)。悬臂梁被插入到毛细血管,和毛细血管functionalisation然后充满了解决方案。测试悬臂首次被涂上的单层DSU (dithobis (succinimidyl undecanoate),国家统计局生物制剂)(49沉浸在一个解决方案)的0.5毫米DSU在二氧六环1、4 30分钟。DSU绑定到黄金一端通过硫醇基。参考悬臂钝化与蛋白结合使用端羟基单层。层是由悬臂沉浸于解决方案的0.5毫米11-mercapto-1-undecanol EtOH 30分钟。二氧六环1中的数组然后冲洗4 5分钟EtOH 3分钟紧随其后。然后测试悬臂进一步functionalised与野生型α美国Ga -核蛋白蛋白质(r-Peptide鲍嘉),结合DSU,沉浸在5μ克/毫升α-核蛋白在钠磷酸盐缓冲剂(20毫米,pH值7)2小时。这是紧随其后的是同一个缓冲区的冲洗5分钟。悬臂阵列上的任何剩余的结合位点被封锁使用BSA(牛血清白蛋白)在磷酸盐缓冲剂浓度为0.1毫克/毫升(20毫米,pH值7.0)。BSA的解决方案是用0.2和过滤μm过滤器之前删除任何聚合浸没式悬臂阵列的解决方案。最后一个示意图的functionalised测试和参考悬臂梁如图1。
2.1.4。动态模式的设备
悬臂夹上一个压电致动器(电子产品公司,东哈特福德,康涅狄格州,美国)在射流室。悬臂梁的兴奋在不同弯曲振动模式的线性扫频正弦信号的频率发生器提供的(美国NI PCI 5406,国家仪器,特克斯)这是由虚拟仪器控制接口。
如图2光束偏转是用来检测悬臂振动的共振频率。一束激光(633海里,自由空间力量> 2.4 mW, SWL 7504 - p,新港,加州,美国)减毒的中性密度滤光片(OD 1.3 NE513B;Thorlabs剑桥郡,CB7 4例,英国)被弹从悬臂上的线性位置敏感探测器(PSD,服务,Partille,瑞典)。PSD的输出放大(SR560低噪声前置放大器,斯坦福的研究系统,加州,美国)和数字化(NI PCI 5112,国家仪器,特克斯,美国)在分析频率发生器的输出在一个虚拟仪器程序导致频谱。自动翻译阶段(物理学Instrumente M110.1DG,贝德福德,MK43 0,英国)由虚拟仪器控制程序被用来移动激光并允许顺序读出每个悬臂的数组。
整个装置安置在一个盒子里保持在一个恒定的温度°C,以避免任何漂移测量由于温度变化。温度保持不变,使用虚拟仪器实现模糊逻辑控制器。
流体通过射流泵室使用注射泵(美国康涅狄格州肯特科技公司)。1.8毫升注射循环用于注入目标分子在不破坏流室。
2.1.5节讨论。测量
数组是加载到动态模式射流室和夹紧的压电致动器。钠磷酸盐缓冲剂(20毫米,pH值6.0)3.3的速度通过室μ四个小时允许L / minα-核蛋白在悬臂梁的表面平衡pH值较低,并建立一个基线的转变可以测量共振频率。
α在三-核蛋白lyophilised resuspended 18 MΩnanopure水最后1毫克/毫升的浓度α-核蛋白在10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4。的α-核蛋白在20毫米rebuffered磷酸钠缓冲区,pH值6,使用蛋白质脱盐旋转列(皮尔斯蛋白质研究产品,费舍尔科学爱尔兰,都柏林,爱尔兰)。解决方案被稀释的最终浓度10μg / mL的缓冲区。
的α-核蛋白单体的速度是通过射流室3.3μL / min。总共1.8毫升的单体溶液通过数组。注射后的单体溶液中,磷酸盐缓冲剂是通过商会,以检查任何解脱的蛋白质表面的悬臂。
2.1.6。数据处理
14悬臂的弯曲共振模式(~ 640 kHz)期间跟踪实验。每个扫描的频率范围是200千赫,2000步的范围给100赫兹的频率分辨率。每个频率范围为1毫秒很兴奋,和PSD的响应采样的速度106样品每秒。PSD的微分信号的均方根值被计算为每个频率的频谱。共振模式测量每个悬臂数组中每30秒。装订质量表面的悬臂然后从频率谱中提取了后处理的数据使用NOSEtools软件(50- - - - - -52]。
2.2。荧光测量
蛋白质的聚合α-核蛋白在溶液中也使用荧光测量作为进一步控制测量与悬臂阵列测量。荧光标记Thioflavin T是用来表示聚合α在解决方案-核蛋白。
2.2.1。的制备α-核蛋白
的α在三-核蛋白lyophilised resuspended 18 MΩnanopure水最后1毫克/毫升的浓度α-核蛋白在10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4。蛋白质在10毫米resuspended磷酸钠缓冲区,pH值7.4,使用透析膜(Slide-A-Lyzer透析盒3500 MWCO,皮尔斯蛋白质研究产品,费舍尔科学爱尔兰,都柏林,爱尔兰)。1毫升的蛋白质在三羟甲基氨基甲烷的解决方案是注入液膜和放置在800毫升的钠磷酸盐缓冲剂30小时,储存在4°C。磷酸钠缓冲过程取代了三次。
2.2.2。荧光测量
96 -微量滴定板(Sterilin有限公司纽波特,NP11 3英孚,英国)准备与包含30井μL 10毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.4),10μL 10毫米500毫米氯化钠的缓冲区,50μL (α在10 mM -核蛋白1毫克/毫升缓冲和10μL 100年μM Thioflavin-T 100年10毫米缓冲区的最后一卷μL在每个。参考井Thioflavin T和空白的测量也准备好了。参考Thioflavin T包含80μL 10毫米的缓冲区,10μL 10毫米500毫米氯化钠的缓冲和10μL 100年μ在10毫米M Thioflavin-T缓冲区。空白参考井含有90μL 10毫米的缓冲区,和10μL 10毫米500毫米氯化钠的缓冲区。上面的两个井的准备在三个时间间隔8小时分开促进聚合的测量同样间隔的时间间隔。
板块在37°C的环境而不断颤抖在150 RPM,直径20毫米。盘子被孵化器的强度测量每2.5小时。盘子都淹没了在任何时候,以避免照片漂白Thioflavin t .荧光的测量进行了FLUOstar最适条件微型板块multidetection读者(艾尔斯伯里,BMG Labtech HP20 2 qj、英国)激发在450 nm和排放强度记录在520海里。
3所示。结果与讨论
3.1。悬臂测量
产生的频率谱悬臂测量位使用NOSEtools软件来确定弯曲共振峰的转变,因此表面质量的变化悬臂(图3)。参考悬臂演示了一个小频率减少实验过程中(数据未显示)。参考悬臂的反应是减去从测试悬臂占任何一方的任何非特异性吸附的蛋白质(背面挂钩或哦终止板面)悬臂和占任何漂移的响应。唯一可用的网站α-核蛋白在溶液中单体与悬臂的表面通过聚合,聚合的蛋白质已经附在表面的DSU单层。大约6 ng的蛋白质聚集在悬臂见到段的表面。注射后单体缓冲区是通过商会和少量的α-核蛋白是除去表面(~ 1 ng)。
的图像顶部的测试和参考悬臂梁实验表明,更多的蛋白质绑定后表面的测试比参考悬臂(数据未显示),支持频率测量表明,有少量的非特异性结合α参考悬臂-核蛋白。这突出的重要性原位进行这种实验时参考。的减法的反应测试的参考悬臂,悬臂允许任何非特异性结合的蛋白质从测量,因此只有减去蛋白质相互作用的响应。
3.2。荧光测量
从10发射的强度μM Thioflavin T和0.5毫克/毫升α在520 nm -核蛋白是23小时记录。荧光的强度记录测量结果扩展了空白的强度井为了占到激光输入功率的变化在标。参考的强度测试井的井被减去显示强度的变化由于聚合的α-核蛋白。实验进行了一式两份,平均每个时间点的数据(图4)。误差线对应的结果的平均数标准误差的传播强度通过上述分析。滞后的初始阶段,7小时后,有一个稳定的增长的平均强度记录。这表明有聚合的α-核蛋白。
3.3。讨论
这些实验表明,可以检测蛋白质的聚合α-核蛋白label-free的方式使用functionalised微悬臂生理液体环境中在动态模式下操作。蛋白质的浓度检测聚合使用label-free方法所需的50倍小于用于荧光方法。蛋白质的总质量要求也小,尽管连续流动法用于悬臂测量,与50μg每个测试需要的蛋白质,而只有18岁μ克的蛋白质通过悬臂射流室。此外,没有停滞阶段观察到在悬臂测量,而有一个滞后阶段观察到荧光测量7个小时。
的聚合α-核蛋白表面的悬臂可再生的;然而,蛋白质聚集的总质量是严重依赖的构象和密度的初始表面播种单体悬臂(数据没有显示)。
应该注意的是,大约6 ng的蛋白质,通过射流室是聚合表面上表明连续流的方法很浪费。使用一个小数量的方法α-核蛋白和停止使用蛋白质时的射流室(卷~ 6μL),更有效的检测可能的聚合。但是,如果目标是确定绑定聚合动力学这样停止流情况可能导致错误结论的速度可以获得大量依赖于蛋白质的扩散速度对射流室中的悬臂的表面。
大规模传感微悬臂允许检测的敏感性的一个非常小的蛋白质的质量液体流过室(我们的设备的电流灵敏度位于subnanogram政权液体)。这可能是有利的在处理时特别昂贵的分子或分子实验的目的是检测在非常低的浓度在一个自然、生理环境。
这里介绍的方法和结果显示聚合的蛋白质的定量测定α-核蛋白微悬臂的表面原位在生理环境中参考。这代表了一种进步比其他测量蛋白质聚合使用微悬臂在文献报道[35]。正如简介中所讨论的,静态方法不适合确定聚合的动力学过程。进一步的工作将集中在确定表面的聚合率悬臂的条件和蛋白质浓度范围的解决方案。
确认
作者要感谢学院药学和制药科学,都柏林三一学院,使用FLUOstar最适条件微型板块multidetection读者。这项工作是由爱尔兰科学基金会支持下CSET方案SFI08 / CE / I1432和SFI / 09年/ 1 b2623π方案。