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g .卢卡奇:Maloney, m . Hegner, ”喷墨印刷:悬臂阵列传感器的完美工具准备检测微生物的增长”,杂志上的传感器, 卷。2012年, 文章的ID561256年, 7 页面, 2012年。 https://doi.org/10.1155/2012/561256
喷墨印刷:悬臂阵列传感器的完美工具准备检测微生物的增长
文摘
使用微悬臂阵列检测的微生物增长提供了一个快速和可靠的技术监测工业增长和临床应用。再现性和灵敏度的提高这一技术是非常重要的。喷墨打印已成功用于精密加工和生物制造由于其精度高;然而,只有少数microbe-based应用程序已报告。在这里我们展示其用于微悬臂基础增长传感的优点。四个微生物菌株大肠杆菌,金黄色葡萄球菌无性系种群。葡萄球菌,铜绿假单胞菌,白色念珠菌沉积并成功种植在agarose-coated悬臂喷墨打印。capillary-coating方法相比,喷墨打印证明更多的控制细胞沉积在悬臂梁上。各种条件对细胞形态的影响也被研究。
1。介绍
基因组学的生物工程领域、药物筛选、组织工程、再生医学和各种生物传感器的应用程序依赖于生物制造技术结合生活和无生命的组件以受控的方式沉积。生物打印提供了一种快速和可靠的替代传统的方法让这些应用程序所需要的空间分辨率(1]。虽然生物结构被认为是脆弱的,许多研究证明,喷墨打印是可行的广谱的生物材料(2- - - - - -6),甚至更复杂的生命系统,如细胞可以通过这种技术沉积(7,8]。Drop-on-demand生物使用不同的机制来迫使“bio-ink”通过微流控室输出孔(1]。热喷墨喷咀使用加热元件来提高温度水库中创建一个泡沫然后部队少量的墨水通过输出孔。在压电打印头,压电致动器是提供短的电脉冲转换成短脉冲的压力。这些脉冲传播的液体。由于惯性力量和由表面张力,体积小的液体的液柱脱落形成液滴。然后滴自由飞2 - 3 m / s的速度。背后的驱使打印头使用压力源储层产生一个力的液体。一个门打开让墨水流过孔板(1]。很明显,这些方法可能会损害生物材料的热、电场梯度,或压力冲击,因此,必须优化工作参数的范围。这取决于应用程序,其他细胞或微粒喷嘴堵塞等问题,无菌印刷,和气溶胶的形成必须考虑。尽管存在这些问题,印刷生物材料的空间精度呈现这些技术高度生物传感的优势。计算机控制的沉积提供了一个快速functionalisation微米大小的传感器技术如悬臂梁、石英晶体微量天平(药物),或表面等离子体共振(SPR)传感。
在本文中,我们专注于微悬臂阵列functionalisation细胞传感器的应用。悬臂阵列在动态模式允许微生物增长分析各种微生物培养物的速度比传统培养技术(9,10]。这种生物传感器是基于振荡悬臂,附加质量负载在悬臂表面导致其共振频率的改变。拉莫斯等人证明(11),纳米机械谐振器的反应取决于位置和刚度悬臂上的吸附生物材料表面。这是重要的实现技术的敏感性。这里我们介绍使用喷墨打印functionalisation悬臂的增长与航空业相关微生物物种检测。
2。材料和方法
2.1。化学物质、文化
化学品和培养媒体购买的西格玛奥德里奇(Arklow,爱尔兰),除非另有说明。从收集下列微生物菌株获得de l 'Institut巴斯德(法国巴黎):大肠杆菌CIP 53.126 (大肠杆菌),铜绿假单胞菌CIP 82.118 (铜绿假单胞菌),金黄色葡萄球菌无性系种群。葡萄球菌CIP 4.83 (金黄色葡萄球菌),白色念珠菌CIP 48.72 (白念珠菌)。细菌和白念珠菌压力保持在磅(0.5%生理盐水、0.5%酵母提取物,1%胰蛋白胨)或马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)偏,分别存储在4°C。一夜之间文化准备(200 rpm, 35°C, 15—h)从单一的殖民地的有机体。第二天,1毫升的隔夜文化转移到30毫升的磅或麦芽提取汤(我)细菌或真菌文化分别和培养(200 rpm, 35°C) 110分钟以达到对数增长率。一毫升的文化沉淀,离心(10 000 rpm, 5分钟,Genofuge 16 M, Techne)和0.5毫升的resuspended测试介质(磅磅,10%,我10%我,或去离子水)。文化的细胞浓度测定用细胞计数室和光学显微镜。
2.2。悬臂准备
悬臂阵列获得从IBM苏黎世研究实验室(瑞士苏黎世)。每个数组有8悬臂长度为500μ100米,宽度μ米,厚度2胜7负μ250的音高μm。在准备微生物涂料,使用O数组被清洗2等离子体(0.3 mbar, 3分钟,PICO桶亚:Diener电子GmbH Co .公斤,Ebhausen,德国)和silanised 45分钟(1% (3-glycidyloxypropyl) -trimethoxysilane N-ethyldiisopropylamine 1%无水甲苯)。epoxy-silanised数组在无水甲苯(洗分钟)在N和干2随后涂上1% (wt /卷)agarose-water解决方案(Bioconcept SeaKem黄金琼脂糖;美国NH)通过使用预热(> 100°C)玻璃微细管(美国加州国王精密玻璃Inc .)。琼脂糖融化的pH值调整pH值11.9,2 M氢氧化钠添加到解决方案。悬臂梁是孵化agarose-filled毛细血管的5秒。使用这种方法薄琼脂糖层悬臂梁表面形成。这种凝胶层的边界是每个悬臂可见的图像。
2.3。毛细管涂层
作为一个对照实验,悬臂梁与微生物functionalised使用玻璃微细管。Agarose-coated悬臂浸满,一半和1/5的长度为6,4日,分别(图2分钟2(一个))。毛细管被装载大肠杆菌暂停(10%磅,细胞/毫升)。
2.4。喷墨发现
md - p - 801 autodrop配药系统(Microdrop、Norderstedt、德国)是由一个piezo-driven吸管(ad - k - 501)和安装在三轴micropositioning系统1的准确性μ在所有的方向(图1)。所使用的喷嘴直径是50μm。液体的体积沉积不仅依赖于其粘度也在电压和脉冲持续时间应用于压电致动器。为了一脉一滴存款,这些参数设置必须调整为每个单独的沉积前悬挂。最后的光斑直径取决于印刷材料的表面张力和表面上的沉积。通过使用一个低脉冲频率在我们的实验中我们允许每个液滴前浸泡入琼脂糖表面下液滴表面着陆。通过这种方法,可以防止气溶胶的形成,;因此,预计该悬臂梁之间没有交叉污染。微量吸液管清洗3次,70%乙醇溶液和96%乙醇溶液在使用前的两倍。这些清洁步骤足以避免喷嘴堵塞或交叉污染。细胞悬浊液准备如前所述被加载到96孔微量滴定板(英国Norwick Sterilin有限公司)。填充微量吸液管之前,解决方案的微量滴定板水库涨跌互现,以提供一个喷嘴中细胞浓度。 Droplets of the different suspensions were spotted on each cantilever independently. To avoid cross-contamination of the lever surfaces the nozzle was cleaned with ethanol between each tested suspension.
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2.5。扫描电子显微镜(SEM)样品制备
cell-functionalised悬臂阵列暴露在相对干燥的室内环境(20 - 40% RH)不到30分钟。增长的测试,他们放置在高湿度(> 95% RH) 35°C。nongrowth控制,他们在房间条件完全晾干。高湿度增长测试期间提供的是一个小水库放置了数组在一个封闭的培养皿。
SEM成像之前,悬臂阵列干在24°C和35% RH至少24小时。悬臂阵列沉浸在5%戊二醛溶液(0.05 M磷酸盐缓冲剂,pH值7),在室温条件下孵化与温柔的摇晃3 - 4 h。固定后,多余的戊二醛在磷酸缓冲被洗(pH值0.05米,7)10分钟。这个步骤是重复6次。样本随后脱水使用10 - 30 - 50 - 70 - 90 - 100 - 100%的乙醇溶液为每个步骤(10分钟)。干燥后,10 nm Pd沉积在样品(Cressington溅射涂布机208小时沃特福德,联合王国)。SEM图像(SEM-ULTRA、卡尔蔡司、德国)在5 kV,孔径大小为30000μ使用镜头探测器。
3所示。结果与讨论
微悬臂阵列以前用于检测的可行的增长大肠杆菌(10,12),黑曲霉(答:尼日尔)[9,13]。在这些研究中个体玻璃微细管被用来对个人agarose-functionalised悬臂的种子细胞。的沉积答:尼日尔孢子是由functionalising悬臂表面的均匀分布曲霉属真菌特殊抗体。播种的微生物物种与培养基混合,为微生物的生长提供了必要的营养。浸没式杠杆的悬架后,营养是存储在多孔琼脂糖层。在生长微生物吸收营养和水从营养层和潮湿的空气。为了比较的涂层效率喷墨打印之前使用毛细管涂层的方法,两个悬臂阵列准备增长测试(图2)。Agarose-coated悬臂浸满,一半,1/5的长度在玻璃毛细管充满大肠杆菌暂停6、4、2分钟,分别(图2(一个))。在第二个agarose-coated数组相同的大肠杆菌悬架被发现在不同的沉积点沿悬臂。在每个位置,10滴细胞悬液与高精度(图2 (b))。扫描电镜的图像大肠杆菌殖民地被24 h后增长。作为一个控制,第二组阵列准备如上所述;然而,他们并不在最佳生长的环境条件(非增长控制)。毛细管涂层与这些相对较大的结构(2μ米)导致的积累细胞毛细血管开放的一端。这可以解释为细胞与液体的流动和蒸发管的前面(图2 (c))。毛细管functionalisation相比,细胞的局部沉积可以很容易地由喷墨打印控制。急剧下降的边缘边界在SEM图像(图可见2 (b))表明了液滴的位置精度是高度可再生的。沉积180年的水滴有3种不同的稀释微生物悬浮显示平均液滴大小和每个液滴的平均细胞数与稀释的样品(表1)。没有增加细胞数量每下降表明细胞并不在喷嘴沉积物沉积。最佳的细胞数量,以避免喷嘴堵塞的细菌那么,在cfu的情况白念珠菌。提到很重要在戊二醛固定样本之前,盐和介质残留物覆盖了悬臂表明良好的营养扩散沿杆的长度。戊二醛固定后的洗涤和脱水步骤足以移除这些残留物清除沉积的细胞(图3)。我们假定液体薄层出席> 90%相对湿度可能悬臂表面保持营养解决方案帮助这个分布。因此,在一个实际的增长测量,在高湿度,没有salt-carbohydrate-protein晶体层形成它会影响这些传感器的机械性能和播种微生物的生长特性。这提供了一个初始细胞沿表面传播的机会即使营养是最初只有在发现网站的开始实验。相似的营养分布未见顺势在“控制悬臂不孵化湿度水平升高。在一些实验数据4 (c)和4 (d),细胞观察后发现区域增长以外的文化不能被解释为一个偏位液滴沉积在喷墨打印(图4 (b))。同心痕迹由单个液滴在琼脂糖层通常显示在扫描电镜图像,图像显示了一个精确的水滴(图的中心位置4(一))。测试白念珠菌(图5)或金黄色葡萄球菌(图4 (c))不能主动离开原来的位置大肠杆菌或铜绿假单胞菌(图4 (d))是能动的细菌使细胞传播尤其是薄液层。这个传播更有可能如果100%培养介质用于微生物沉积与稀释介质代替我磅(10%或10%)。稀释的增长中微生物的生长速率下降。在的情况下白念珠菌每滴,使用更少的细胞(5 - 10细胞/液滴)全额介质仍然完全覆盖了悬臂与细胞表面(图5 (d)顺势)相比,“控制(图5 (b))。发现50 - 100细胞稀释介质(数字5(一个),5 (c))不允许有机体生长的最初发现的位置。在一些实验中,四个微生物菌株进行测试的可行性在喷墨打印和生长在微悬臂的表面。每个数组准备两次,每个顺势被用作“控制之一。扫描电镜图像的实验表明测试的可行性和乘法有机体(图6)。在每种情况下,可以观察到细胞数升高的数组接触生长条件(高湿度和高温)。白色念珠菌是一种酵母microfungi典型细胞尺寸4 - 5μ米直径。在一定条件下,多数与有限的营养,它们能够生长单细胞在细胞分裂后的细胞没有分开。这种形态开关经常学习,因为它有一个很大的作用白念珠菌致病性(14]。在我们的测试中,白念珠菌细胞被播种在出芽酵母形式我暂停,10%我悬挂在100%。图6(一)显示,与全介质暂停一些细胞发展中丝状结构(假菌丝),但也出芽酵母形式也可以观察到。很可能在这个特殊的微环境假菌丝的传播中发挥作用假丝酵母沿悬臂梁。所有这些过程导致的殖民表面可能会导致改变悬臂梁的力学性能,;因此,影响增长检测测量最初是基于检测的质量增加悬臂表面。若技术,盐或糖含量高的微生物培养介质可以干扰测量尽管减少可用的营养物质在环境中会导致经济增长率的变化或形态的细胞。在其他的实验白念珠菌(图7(一)),金黄色葡萄球菌(图7 (b))细胞沉积在agarose-coated悬臂梁与稀释介质。我们发现,减少营养的悬架结果用于减少可行性以及细胞的形态学改变。细胞开始积累细胞外膜材料与生物膜的形成(图7)。细菌和假丝酵母殖民地通常形成生物膜等各种表面硅为了帮助细菌种群在特定的环境中生存。然而,进一步的调查,才能确切地理解这个过程在微悬臂的情况下。预计生物膜的形成会影响悬臂弹簧常数(k)。同样重要的是,使用去离子水进行细胞沉积导致了细菌细胞对液滴的定心位置,而更多的粘性悬浮液的使用,如培养基,导致细胞的积累液滴的边缘,因此,高精度定位时液滴内微生物(数据没有显示)。
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4所示。结论
成功地证明了在我们的实验中,不同类型的微生物细胞能够沉积在微悬臂的表面,同时保留他们的生存能力。喷墨发现用于悬臂functionalisation与可行的细胞,因此,揭示其潜在的更好的选择传感器的应用增长和实时测量。不需要特定的抗体促进紧密绑定在沉积的细胞。运动型的微生物液体膜允许自由分布,细胞,在这些情况下引入抗体可以保持物种。相比之前报道capillary-coating喷墨打印技术已被证明是更准确的位置细胞的方法,因此,优化质量变化的检测在microcantilever-based增长检测。
确认
这项工作是由爱尔兰科学基金会支持下CSET方案SFI08 / CE / I1432。高分辨率成像的工作由CRANN启用先进的显微镜实验室(AML),都柏林三一学院。
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