文摘
提出了一种基于光纤设备的自动读出微悬臂阵列的快速检测微生物的增长。我们确定我们的设备的能力来跟踪谐振频率的变化由于悬臂表面质量的增加或机械刚度的变化。7的共振频率响应μ米厚agarose-functionalised悬臂跟踪是湿度变化揭示了大众的反应性pg / Hz。微悬臂涂上的共振响应黑曲霉(a .尼日尔)孢子是监控> 48 h揭示增长检测时间> 4 h。菌丝体的生长沿悬臂梁表面被认为导致共振频率的增加由于钢筋的悬臂结构。我们的光纤检测技术的使用允许数据被记录不断和更快的比之前报道的。
1。介绍
微生物感染通过污染仍构成威胁等领域的制药、化妆品和食品等行业。出于这个原因,执行质量控制测试以确保不发生微生物污染和防腐剂功能。微生物种群的生存依赖于提供合适的营养和环境条件(相对湿度> 93%,温度= 25°C-37°C)。传统方法到目前为止依靠污染样本含有防腐剂规定接种物的微生物在培养皿中,紧随其后的是计数殖民地。一个例子将是一个医药产品的防腐剂功效测试(1),防腐剂的影响下生活细菌应该显示一个日志减少3后24 h和真菌应该显示一个日志减少2后7天。这些廉价的手工方法提供所需的灵敏度和增长的信息但耗时,需要高技能的人员来执行。出于这个原因,需要自动化的发展,高度敏感,label-free和实时检测系统。
报道使用微悬臂谐振器作为生物传感器近年来上升了。通常情况下,检测是基于(我)跟踪诱导表面应力变化引起的挠度悬臂表面的吸附目标生物分子(静态模式)(2,3)或(ii)跟踪谐振频率变化引起的质量悬臂表面吸附(动态模式)。使用静态模式,单一碱基对不匹配已发现DNA杂交实验(4)的检测大肠杆菌(大肠杆菌)也被报道使用抗体固定微悬臂的检出限cfu /毫升(5]。使用动态模式,质量解决1 attogram (g)取得(6),而细菌细胞的检测7),病毒颗粒(8,9),和生物分子10)也被描述。使用微悬臂阵列检测的可行的微生物增长曾被报道在11- - - - - -14]。这些测量,基于光束偏转法(15使用扫描探针),进行多模头在一个被控制的环境中操作。手动操作所需的激光点几个悬臂的读出。介绍了发展和成功应用使自动化的基于光纤的悬臂阵列读出技术检测微生物的增长。的操作原理依赖于调制光信号,由一个振荡悬臂,由光电二极管探测器的光学纤维。检测的机理类似于(11,12)的吸收水functionalised悬臂表面由于微生物增长导致共振频移。
2。材料和方法
2.1。化学药品和试剂
所有化学品和试剂为分析纯,购自Sigma-Aldrich (Arklow,爱尔兰),除非另有说明。
2.2。黑曲霉培养法
黑曲霉(答:尼日尔CIP 1431.83)孢子从巴斯德研究所(法国巴黎)。孢子培养在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) (Oxoid、巴塞尔、瑞士)偏35°C 5天,然后储存在4°C,直到需要。孢子悬浮在4毫升的麦芽提取物汤(我)。孢子是由离心收获(10000 rpm, 5分钟)(Genofuge 16 m, Techne) 3毫升这个悬挂。由此产生的颗粒resuspended在200年μ我解决我和去离子水(1:10)。这些步骤需要平均20分钟才能完成后的孢子悬浮液用于悬臂functionalisation(部分2。3)。
2.3。悬臂阵列准备和Functionalisation
悬臂阵列使用经精密加工组位于IBM苏黎世研究实验室。每个数组包含八个悬臂梁距250分离μm长度、宽度和厚度尺寸为500μ米、100μ米和7μm,分别。两种类型的数组(数组和数组B)准备。数组类型是清洗10分钟的水虎鱼的解决方案(H2所以4:H2O2;1:1),随后洗nanopure水和乙醇的解决方案(1:1)然后nanopure水。这个过程被重复两次,数组然后使用高效液相色谱级异丙醇清洗。数组类型B由暴露在0.3 mbar O打扫干净了2等离子体3分钟(PICO桶设;Diener电子GmbH +有限公司公斤,Nagolderstrasse 61 d - 72224 Ebhausen,德国)。清洗后,自组装单层阵列上形成了浸泡在硅烷溶液(3-glycidyloxypropyl-trimethoxysilane: N-ethyldiisopropylamine:水自由甲苯;1:1:100)在无水甲苯45分钟,然后洗了两次,持续15分钟。数组是使用氮气,然后储存在真空干燥。这个步骤提供了一个epoxy-activated表面反应,在碱性条件下,对主要羟基(如琼脂糖)。
Seakem黄金琼脂糖(Bioconcept;美国NH)溶解在nanopure水浓度为1% (wt /卷)和储存在4°C。使用琼脂糖凝胶之前的解决方案是融化了。琼脂糖溶液的pH值调整~11.9通过添加2 M氢氧化钠。玻璃毛细管(金精密玻璃有限公司;美国加州)被用来琼脂糖functionalise中描述的悬臂阵列(16]。为了防止糊化的琼脂糖溶液在毛细管中,他们使用辐射灯预热(欧司朗;8401年温特图尔、瑞士)。在数组类型的情况下,悬臂梁受到的琼脂糖溶液1秒。在数组中B型的情况下,悬臂梁受到的琼脂糖解决方案1,5或10秒获得一个不同的琼脂糖厚度悬臂。琼脂糖层和沉积的营养吸收答:尼日尔孢子在悬臂上进行并行使用玻璃毛细血管如前所述。孢子悬液制备用作节中讨论2。2。悬臂梁阵列类型的孢子悬浮液都沉浸在10分钟。原位参考悬臂沉浸在10%我汤没有孢子10分钟。数组立即被放置在试验箱在94% RH和30°C。
2.4。仪器和测量
所有组件都是购自Thorlabs(英国剑桥郡CB7 4例),除非另有说明。使用自定义构建实验设备(图1基于光学光束偏转法)。使用光学纤维捕捉光束偏转。驱动其共振频率时,悬臂梁的运动导致的强度调制的光束被光学纤维。通过记录强度调制,可以确定悬臂梁的共振频率和跟踪。设备维护使用的光轴16毫米笼板(SP03)和笼棒(SR3),安装在两个哥特式尖拱XYZ翻译阶段(美国加州9061 XYZ,新港)。一个平行激光束(光束直径= 3.4毫米)提供系统使用当激光二极管(lps - 830俱乐部海里,最大功率12 mW)伴随着准直器(F280FC-B)。激光二极管驱动与外部模块(ITC502-Benchtop激光二极管和温度控制器±200 mA / 16 W)和温度控制(TCLDM9-TE-Cooled挂载)。平行光束聚焦成一条线,宽度~6μm,沿悬臂阵列使用凸柱面透镜(47764年mm;埃德蒙光学、英国)。从每个悬臂定向反射成八拾音器纤维(bfl48 - 200,内径= 0.2毫米),一个对应于每个悬臂阵列,通过凹柱面透镜(LK1363L1-B,毫米)。图2这个设置的显示了一个范例。提取纤维耦合自定义构建光电探测器设备在电压产生与探测光的强度成正比。使用低噪声前置放大器电压放大产生的电压(SR560,斯坦福的研究系统,加州,美国)。驱动的悬臂阵列使用自定义执行阶段包含15毫米×15毫米×1毫米压电陶瓷板(EBL # 2),电子产品公司。美国康涅狄格州)。
虚拟仪器(美国国家仪器,特克斯)是用来控制我们的仪器和测量悬臂梁共振频率的数组在多路复用方式。三个板,NI pci - 5412 (100 MS / s, 14-Bit任意波形发生器;美国国家仪器,特克斯),NI pci - 6010(16位,200 k / s, 16个模拟输入多功能采集;美国国家仪器,特克斯),镍5112(高速数字转换器;美国国家仪器,特克斯),让我们(我)输出电压在上述的压电片,(ii)来获取和处理电压的自定义构建光电探测器设备,和(3)来控制当前应用于梳辫子的激光二极管。
为了获得合适的微生物生长条件,一个自定义环境室(5500 - 8139;美国电子技术系统公司,Pa)是用来调节温度和湿度。温度是生成使用加热元件安置在室。潮湿的空气注入室使用超声波加湿系统(5472 - 3;电科技系统有限公司;PA 19038美国)。湿度和温度调节使用温度补偿湿度传感器(554;美国电子技术系统公司,Pa)与微处理器控制器(5200 441 - 431;电技术系统公司美国Pa)。
3所示。结果与讨论
的检测大肠杆菌和答:尼日尔增长使用悬臂阵列一直在报道(11- - - - - -14]。然而,如前所述,这个工作是手动执行使用扫描探针多模头毫微秒示波器控制软件(数字仪器,加州圣芭芭拉分校,美国)。为我们的光纤设备,进行以下测试,确保连续共振频率的变化,由于增加悬臂表面质量,可以检测到。
3.1。在不同湿度条件下反应Agarose-Functionalised悬臂梁
数据3和4悬臂梁的共振频率响应,从数组类型A和B,分别对湿度的变化。Agarose-functionalised悬臂显示响应增加湿度的变化。这是由于大规模的增加引起的悬臂表面吸收的水琼脂糖层。增加孵化时间在琼脂糖溶液functionalisation导致厚层,因此更大的回应湿度波动(图4)。被看作是有频率的噪音水平之间的相关性设备和培养时间的悬臂梁在functionalisation琼脂糖溶液。孵化的1、5、10秒,噪音水平被发现在4的顺序,5.5和7赫兹,分别在实验条件(94% RH, 30°C)(数据没有显示)。质量的响应率传感器当操作在其第一次共振模式pg / Hz。应该注意的是,最小可检测质量与琼脂糖的厚度增加悬臂表面由于噪音水平的增加。
3.2。黑曲霉增长的检测
图5显示共振频移(2)与时间答:尼日尔孢子- - - - - -涂布悬臂梁。观察到的变化是由于孢子开始发芽,传播沿悬臂菌丝体。把这个上下文,单个孢子(直径的质量~4μ米)~34个pg,增加~270 pg发芽之前由于肿胀(直径~8μ米)。这个值是在我们的检测范围内显示。日益增长的菌丝体吸收其中的营养物质和主要从营养层,然后吸收水与环境保持平衡。重要真菌生长的检测可以在不到4 h。这个值是符合报告(13,14]。我们的光纤检测技术的使用允许数据被记录。使用一个自动化的系统允许将实验运行在更长的时间(> 48 h)提供进一步洞察菌丝体生长的动力学。大约28 h开始后的实验中,共振频率的增加,因此最有可能增加刚度(),观察。我们相信这个增加是由于钢筋的悬臂沿着它的长度(图菌丝体的生长6)。吸附效果的质量刚度及其沿悬臂位置已报告在17,18]。这些影响可以申请;然而,进一步的工作是需要澄清这是在线成像孢子的生长需要。我们相信,跳在共振频率观察~33和42 h悬臂与密集的孢子涂层(图6(一);黑色曲线)可以被解释为一个临时紧张菌丝体的屈曲。不同大小的响应与一个悬臂上的可行的孢子数量高于其他,可以看到图6。需要注意的一点是,经济增长的速度是相同的两个悬臂梁作为单独的传感器响应似乎可行的孢子沉积的数量规模。
4所示。结论
微生物快速增长的新自建悬臂阵列设备检测已成功建立。测量涉及微生物的增长需要高湿度和气温升高与高精度调节。光纤检测方案被选为防止不良湿度影响电子零件,必须放置在这些环境条件下悬臂结构。纳米机械变化,孢子的可行的增长引起的悬臂传感器,可以持续跟踪。我们证明了利用光纤束注入和光纤束调制读出可以用来追踪悬臂梁共振频率的微悬臂阵列在一段时间在高湿度和温度。agarose-functionalised悬臂在不同湿度条件下的共振频率是即时追踪了大规模薄agarose-coated传感器的响应率pg / Hz。频率噪音也发现依赖琼脂糖层支持薄层的厚度在1秒functionalisations产生。检测发展的可行性答:尼日尔孢子被记录在不到4 h。使用一个自动化的综合检测系统允许纳米机械数据不断增长的可行的物种被监控记录> 48 h,揭示额外的洞察菌丝体生长的动力学。我们假设扩展增长的微米大小的菌丝体微米大小的悬臂梁的纵轴是诱导纳米机械的强化属性的微米薄悬臂结构。是观察micromycelia能够一起成长的速度~9μm / h在最佳生长条件下,因此有类似尺寸的传感器发展。可行的微生物的快速检测,如本文所示,这是很重要的例行质量控制测试需要确保微生物污染不会发生,防腐剂的功能。
确认
这项工作是由爱尔兰科学基金会支持下CSET方案(SFI08 / CE / I1432),π方案(SFI / 09年/ 1 b2623)和诺华科学基金会。作者还想承认使用高分辨率成像设备位于高级显微镜实验室(AML,三一的技术和企业校园,都柏林,爱尔兰)。