文摘
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)浓度测定使用压电微悬臂传感器(到聚合物)由作者开发的。发达到聚合物label-free和电检测传感信号。它旨在测量生物分子附在它使用一个精确的质量mass-microbalancing技巧;调查区域仅限于悬臂的结束,和其等效弹簧常数相对较高的表面应力变化的影响降到最低,当生物分子连接到它。“浸渍和干燥的”技术被用来使探针传感器与试剂反应的区域环境条件控制。表面抗原检测的免疫反应,而反应时间、抗体浓度,及其对调查区域都保持在一个恒定水平。的质量检测乙肝表面抗原在0.1测量-100 ng / mL。
1。介绍
乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的疾病也可能导致乙型肝炎肝硬化和肝细胞癌(1]。全世界估计有二十亿人已经感染了乙肝病毒,其中,3.5亿是慢性感染。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)病毒的表面形式的一部分,作为一种生物标记用于乙型肝炎病毒感染(1]。我们需要检测表面抗原在非常低浓度精确诊断乙肝病毒。在医院、化学发光免疫分析法被广泛用于检测表面抗原,其检出限是大约0.05 ng / mL [2]。
压电微悬臂传感器(到聚合物)作为生物传感器提供了许多优点,适用于表面抗原的检测。到聚合物是一种高度敏感label-free足够小的传感器被开发作为便携式设备;多路检测和电气读出也可以(3]。许多研究已进行了使用到聚合物检测各种生物标记(4]。
到聚合物的检测原理是基于共振频率的变化前后到聚合物目标蛋白相连;捕获目标蛋白质在调查区域到聚合物的一种免疫反应。频率的变化取决于表面压力的变化和质量负载由于连接生物分子。表面应力的影响在共振频率降低的有效刚度(弹簧常数)到聚合物增加(5,6]。如果我们使用到聚合物作为质量传感器基于mass-microbalancing技术(7),有效刚度应该足够大,然后,共振频率将只在应对质量负载的影响不同。
实验装置由测量共振频率和一部分一部分的探测区域,使传感器与试剂反应。一个阻抗分析仪通常用来测量共振频率检测到聚合物的相位角的峰值点(8),介电损耗(6),等等。“浸渍和干燥的”技术被广泛用于检测实验(9]。到聚合物是浸入试剂固定抗体或抗原结合,和空气中的共振频率检测。到聚合物应该大的质量因素,因为它关系到检测的准确性共振频率的改变。许多研究在文献中报道的检测生物分子与一个操作到聚合物液体,但质量因素是大大减少在液体(10]。环境条件如湿度和温度必须控制在一个恒定的水平因为到聚合物的共振频率可以受到这些条件的影响。
在这项研究中,我们演示HBsAg浓度的测量到聚合物我们开发,功能质量传感器。为了到聚合物作为质量传感器,它是为了有相对较大的刚度和有效探测区域仅限于结束的设备。“浸渍和干燥的”技术,和群众的检测乙肝表面抗原在不同浓度和不同测量反应时间。此外,使用其他蛋白质进行控制测试。
2。压电微悬臂质量传感器
发达到聚合物以前由作者设计有足够的灵敏度和可靠性质量传感器(7,11];传感器的几何形状和尺寸如图所示1(一)。压电层由锆钛酸铅、钛),其成分是Pb(锆52“透明国际”48阿)3,是由硅悬臂结构。黄金是图案在探针悬臂的结束。
(一)
(b)
机械集总参数模型,如图所示1 (b)是用于理解到聚合物的力学特性。集总参数计算的模态分析结果到聚合物使用商业有限元分析工具,COMSOL软件多重物理量。材料属性和集总参数的计算值列在表中1。
发达到聚合物的质量灵敏度是超过一百万倍的一个商业石英晶体微量天平(药物)。到聚合物的质量灵敏度大约是175 Hz / pg,计算从一个特征值分析之前和之后的质量在探测区域(图1(一)),大众广泛使用的药物的敏感性与5 MHz水晶大约是79 Hz /μg (13]。另一方面,两个传感器质量敏感性/地区具有可比性,因为调查区域的药物(~ 1.267厘米2)超过一百万倍的到聚合物(~ 50μ米2)。到聚合物的质量灵敏度/面积是87.5 Hz / (μ克/厘米2),药物的100 Hz / (μ克/厘米2)。
因为表面发达到聚合物的应力对共振频率的影响非常小,可以使用到聚合物质量传感器。如果我们假设初始表面压力年代是零和,调查区域覆盖整个区域长方形的微悬臂的一边,如下所示的表面应力敏感性[5]: 表面应力敏感性的有效刚度成反比。如果探测器面积减少到原来的十分之一区,区位于悬臂,表面应力敏感性降低大约四分之一的原始值。表面压力的变化所引起的附加生物分子通常是在0.01 - -0.08 N / m的范围(6),因此,共振频率的变化计算大约在2.7 - -21.6赫兹的范围。频率变化时由于表面应力小于或等于我们到聚合物的频率分辨率。
发达到聚合物是使用一个标准的微加工技术制作的,我们之前描述的细节是文献[14]。图2(一个)显示了一个横断面图,图2 (b)显示了一个发达到聚合物的光学图像。图中可以看到的深沟2 (b)是为了提高到聚合物的电特性。
(一)
(b)
3所示。实验
3.1。材料
重组表面抗原、单克隆anti-HBsAg和甲胎蛋白(AFP)买来HBI(韩国)。磷酸盐(PBS, pH值7.4)与牛血清白蛋白(BSA)从Affymetrix购买。硫醇盐蛋白质A / G(蛋白质/ G-SH)准备的魔法实验室(POSTECH、韩国)使用蛋白质A / G (BioVision)和Traut试剂(盐酸2-iminothiolane)根据指令Traut试剂(编号为26101,热科学)。丙胺(异丙醇),乙醇,甲醇从Avantor购买材料。
3.2。实验设置
图3显示了检测实验设置使用到聚合物表面。调查区域到聚合物的把手伸进一个液滴(< 10μL)生物化学溶液,浸深度控制使用一个线性阶段通过CCD摄像头监控。到聚合物的共振频率测量使用PXI系统,这是一个基于计算机的测量装置。电导谱的峰值点到聚合物的机械谐振频率(15),在峰值点和频率计算使用使用虚拟仪器开发的一个程序,一个图形程序语言。thermo-hygrostat被用来维持一个恒定的湿度和温度在实验。
3.3。检测过程
检测过程用于HBsAg如图4表列出,其详细步骤2。首先,传感器受到清洗过程,采用紫外(UV)光(254 nm, UV-5D短波灯、液体),和湿清洁也被应用。第二,探测器上的黄金表面面积与硫醇盐反应蛋白A / G,用于结合抗体。第三,传感器与BSA钝化,以防止非特异性结合。第四,anti-HBsAg固定化反应网站上的传感器。第五,控制测试用PBS和法新社HBsAg的检测结果进行比较。最后,表面抗原检测在特定浓度,同时控制反应时间。PBS清洗和去离子水冲洗进行了每一步,和到聚合物的共振频率也测量每一步干燥后氮(N2)气体。发现HBsAg的质量计算使用不同共振频率检测表面抗原和前后到聚合物的质量灵敏度。anti-HBsAg固定过程中,浓度和反应时间确定每一步实验,表中列出2。生化溶液液滴的形式取代了几次来弥补蒸发的浓度的影响。
4所示。结果与讨论
生物分子后到聚合物的共振频率降低。图5显示到聚合物电导谱的每一步的过程中固定的anti-HBsAg探测区域。每一步的谐振频率逐渐降低。需要不到20年代获得电导谱,和大约200到聚合物的质量因素。
质量的检测HBsAg取决于目标解决方案的浓度,反应时间,固定化anti-HBsAg的密度,它占据的区域调查。反应时间与目标是维持在一个恒定的水平10分钟。此外,探测器上的anti-HBsAg密度和它的面积几乎是维持在一个恒定的水平,因为调查区域定义为相同图案的黄金和使用相同的过程用于固定的抗体。在这种方式,大众的HBsAg只取决于浓度;也就是到聚合物可以测量表面抗原的浓度在目标解决方案通过测量发现表面的质量。
图6显示检测到的质量数量HBsAg的0.1 -100 ng / mL。随着浓度的增加,绑定HBsAg的速度也增加。因此,质量的检测表面抗原在10分钟的反应时间增加的预期。图6还显示测量结果质量的信息,控制测试用PBS和法新社。相关结果PBS的最小可检测质量,相关结果对法新社的绑定选择性检测到聚合物的表面进行测试。
图7显示了不同浓度的时间依赖性的免疫反应。质量增加了大约73%的浓度0.1 ng / mL和57%的浓度1 ng / mL,随着反应时间的增加双重的。绑定HBsAg的速度可能会降低随着反应时间的增加,因为在饱和点绑定速度为零;因此,发现表面的质量的增加比率不到100%。此外,增加比例更高浓度的表面价值较低,因为绑定HBsAg的速度增加,然后绑定反应迅速达到饱和点。我们需要保持一个恒定的反应时间测量表面抗原的浓度,但我们需要调整反应时间的检测区域的浓度。,较短的反应时间在低浓度区域和需要更长的反应时间需要在较高的浓度。
免疫测定,流动注射分析(FIA)也广泛使用;它允许跟踪免疫反应的动力学(9),它是相对有用的多路检测或自动化系统。然而,FIA相比需要更复杂的系统分析使用“浸渍和干燥的”技术。此外,到聚合物在液体低品质因数和低谐振频率由于液体的粘滞阻尼效应和附加质量效应(4,7];因此,国际汽联可能恶化到聚合物的可靠性和灵敏度。因此,“浸渍和干燥的”方法是适合测量与发达到聚合物表面的浓度。
5。结论
摘要HBsAg浓度测量0.1 -100 ng / mL的使用到聚合物开发质量传感器使用。“浸渍和干燥的”技术,和浓度测量通过测量发现HBsAg的质量为目标的解决方案,同时保持反应时间anti-HBsAg密度,和它的面积调查常数。从获得的结果,我们认为可以利用压电微悬臂质量传感器表面的浓度的测量,也可以用于敏感的诊断检测乙肝病毒感染。
确认
这项工作是支持的“生物机器人技术的发展为POCT(快速检测)(10024720)”项目的工业源技术发展项目下知识经济部(MKE)的朝鲜和韩国国家研究基金会支持的部分(NRF)授予由韩国政府资助(最高明的)(没有。2010 - 0019292)。