文摘

我们建立了一个label-free直接绑定为非编码rna的检测分析。分析是基于纳米机械悬臂阵列检测的表面应力引起的固定生物分子和他们的交互合作伙伴。我们用各种方式显著减少漂移的悬臂读出一个突出特征与读出实验前后在静止流体样品注入。主要的改进是通过专注于更快的系统平衡(例如温度控制和扩散独立)。实验协议改进提供用户友好的和费时的测量。进一步增强通过,例如,使用pre-gold-coated悬臂阵列晶片相比,单独准备的,直接实现数据分析工具测量软件的实时特性。我们演示了picomolar特异生物标志物的目标检测和修改很容易区分目标与单核苷酸杂交亲和力较低的不匹配。

1。介绍

基于悬臂阵列纳米机械传感系统是一个基本研究工具探索label-free化验。调查显示几个静态模式应用程序检测DNA杂交等生物约束力的合作伙伴(1- - - - - -3)和receptor-ligand绑定(4- - - - - -7]。我们的焦点位于非编码rna的label-free检测介质吞吐量分析半自动化过程和少耗时的协议发挥了重要作用。因此我们的目的是建立一个稳定、可靠的设备对于这个应用程序在基因组学领域。

非编码rna的检测是对小干扰rna水平监控microrna的或感兴趣的生物标志物或治疗方法(8]。目前最先进的RNA的检测方法是扩展DNA化验或DNA ELISA。作为固定化捕获探针ELISA试验,结合目标序列。后来的三明治结构完成检测探针(注释标签extender)。这个标签extender然后用标签探针结合分支的DNA。标记分支确保足够强的信号检测(9]。DNA ELISA的优点是不需要放大和没有逆转录如qPCR是必要的。直接测量可以做细胞溶解产物。耗时分析协议的事实是这种ELISA测定是一种固有的劣势。此外,有一个主要的限制:附加标签从目标我们需要一定量的核苷酸链不用于识别和确保特异性。

比较测量我们参考出版物的label-free检测生物标志物在人类RNA转录与纳米机械悬臂安装了(10]。

为新设计的概念验证设置我们的目标是检测一个单链21 mer寡核苷酸在100点生理缓冲溶液。

成功的杂交实验我们测量的检测转导表面应力积累取决于具体绑定ssDNA生物分子的数量。我们的设备在静态模式和以液体。诱导悬臂的弯曲(坐落在纳米范围内)是通过测量激光光束的反射上方的悬臂和指向它对位置敏感探测器(PSD)中描述(11,12]。表面固定生物分子之间的相互作用引起的压力是在ssDNA biofunctionalized悬臂杆和他们互动的合作伙伴在一个注射方案。各种力量如分子间相互作用,静电力量,和悬臂表面电子密度的变化导致产生的表面压力(13]。

减去偏转信号的非特异性参考悬臂从主信号,等寄生效应漂移由于温度变化小,可以消除非特异性结合(13,14]。

自可测量的信号漂移存在于所有已知label-free检测方法我们关注它的减少通过稳定的主要外部因素影响漂移在我们的纳米机械设置。这是通过实现一个快速本地温度调节系统和测量在液体连续流。我们的目标是优化系统对半自动设备处理,这对于工业应用是至关重要的。

协助记录数据的解释我们开发了一个适用于实时分析软件简单操作和情节的结果同时测量。

2。仪器、材料和方法

悬臂挠度测量通过跟踪反映激光点在一个位敏探测器(PSD) (1 l10-10-a SU15,服务电子光学、瑞典)。作为激光源,我们选择辫子波长635纳米的激光二极管(HL6320G Opnext日本公司,日本)在恒功率模式下经营。通过八个激光耦合纤维在线性数组中读出了八个悬臂连续照明。

我们的设置分为三个部分。包含悬臂的主要部分是一个温控箱和射流系统(图工具1)。悬臂阵列保持温度稳定,我们安装了两个控制回路。(我)外部流动循环恒温器(Peter Huber Kaltemaschinenbau GmbH ministat 125年,德国)稳定温控盒内的温度。(2)第二个温度调节模块是珀尔帖效应元件安装在测量室的距离约2毫米的悬臂。珀尔帖效应的元素是由珀尔帖控制器通常用于激光温度稳定(ldt - 5525, ILX光波,美国)。


图1
视图包含悬臂仪器内部温控箱。激光射线路径可见由于轻微的阴霾。(1、2、3)x, y, z的定位;(4)平行排列的纤维悬臂梁;(5)纵向聚焦于悬臂梁;(6)光纤(激光源);(7)透镜;(8)流室(持有悬臂阵列芯片);(9)油管注射泵;(10)镜与倾斜功能; (11) position-sensitive detector (PSD); (12) PSD alignment; (13) camera module; (14) ground plate connected to flow cycle thermostat; (15) thermal insulated box; (16) inset of cantilever array image mounted in flow chamber (8) taken with the camera module (13); (i) and (ii) illustrate the two temperature-controlled zones.

我们进行了液相中所有测量。两个注射器泵(neMESYS系统、Cetoni GmbH德国)拉系统通过测量液体和样品室。以补偿压力损失由于拉我们应用80 mbar(氮)超压在所有样本容器和水库系统缓冲区。海拉尔油管(Ercatech AG)、瑞士)被用来减少损失的探针分子在样例由于吸附在油管表面。

为测量悬臂可以安装在干燥条件下或在肾上腺素系统室和油管充满了缓冲区。在这两种情况下我们冲洗系统有限公司2之前填满缓冲区。有限公司2溶解在水里比80倍氮和导致气体不含气泡的流体系统。

除了温控箱的设置包括一个 1 9 架包含激光PSD控制器和电源。

设置由虚拟仪器控制(NI pci - 6221接口和虚拟仪器软件工具包,民族乐器,瑞士)。所有测量值记录和处理虚拟仪器软件。数据分析是基于算法的测试和之前申请动态微阵列信号(15]。

我们使用悬臂阵列2 8个悬臂传感器预镀钛20 nm黄金(瑞士IBM Research GmbH)。这些传感器的外形尺寸如下:500μ米长,100μ0.5米宽,μ米厚度。再生和清洁环境的黄金表面有机物为后续ssDNA functionalisation,数组是紫外臭氧处理60分钟(辐射通量在185 nm ~ 4 W;环境啊2使用(前)16]。氧等离子体处理清洁不推荐黄金表面由于广泛分布的电子能量导致辐射损害和一个贫穷的可控性16]。

所有测量数据进行连续流(10μL / min注射前后平衡和150年μL / min的探测器注入和使用上述注射器泵清洗步骤)。悬臂阵列是携带thiol-modified ssDNA(瑞士Microsynth)乙酸acid-triethylamine 60分钟的缓冲在土制毛细管设备解决方案。毛细血管允许个人functionalisation的各种传感器。生物标记的DNA序列选择是AGAATAGGTATTTTTCCACAT目标和AGAATAGGTATAATTCCACAT不匹配的序列。选择序列不倾向于形成发夹,不二聚。在所有的实验中以下硫醇盐ssDNA寡核苷酸被用来使职能化悬臂接口。(传感器序列:ATGTGGAAAAATACCTATTCT-C6 linker-SH,参考序列:CTTACGCTGAGTACTTTGA-C6 linker-SH)。我们用PBS(英杰公司、瑞士)运行和杂交缓冲。

3所示。结果与讨论

与描述的设置中,我们可以发现一个100点反义链和区分一个完美的匹配和不匹配的序列。图2显示了两个连续的覆盖试验。每次注射前一个稳定的基线记录,以确保所有悬臂平衡((I)阶段)。由于自动化的注射程序后注入的时间为每个实验步骤是一样的。这使得两者的叠加顺序实验如图2。开关阀门的影响从运行缓冲储层探测容器和改变流速度从10μ100 L / minμL / min是可见的在进样的开始阶段(II)。大约需要3分钟,直到样品到达美国商会与悬臂梁。这就解释了为什么直到没有明显变化的斜率中期阶段(II)。沉重的波动可以解释为折射率的变化,流效应和分子的交换室设置在一个新的平衡。10分钟后样品(1 ' 000μL)完全注入,阀门开关运行缓冲,和流动速度降低到10μL / min(过渡阶段(3))。在阶段(3)室仍充满了探针的解决方案。一个稳定的平衡没有达到在潜伏期。几个反应导致悬臂偏转(中描述13往往会发生。去除剩余的调查方案和洗室缓冲流((IV)阶段)提高到100μL / min。我们与1 000年刷新μL缓冲区。这里我们看到,之前的延迟系统中探测解决方案完全取代了缓冲区(斜率的变化)。峰值变化的时候可以用静电条件的变化来解释相比,普通的缓冲溶液的缓冲溶液与调查。快速反应如阀切换和散装缓冲区的变化不能完全记录由于相对缓慢数据采集(0.25赫兹),因此顺序注射痕迹不是完全相同的。最后程序切换回备用条件(10μL / min缓冲流),以及由此产生的挠度值监控。相比偏转的终点(III)阶段,阶段(V)的起点是略高(~ 50 nm)虽然我们有相同的流动速度阶段(III)和(V): 10μL / min。少量的偏转丢失由于解散弱约束链(不是完全杂化)在洗涤步骤。所示的两个注射(红色曲线和黑色曲线)按顺序记录。首先,消极的探针(不匹配配置)注射后,新的平衡匹配注入监控。最后的两个起点基线转移到零,图表绘制在一个覆盖。由此产生的净偏转100 ~ 200 nm的点匹配探测器注入是多次测量实验。由此产生的表面应力约为9 mN m−1先前的实验,如[相比是比较高的10(杨氏模量(Si): 130 GPa,泊松比:0.28)。因此原因可能是因为长悬臂功能化,由于不同的缓冲性能影响的位阻和离子排斥的分子。


图2
覆盖两个连续的实验证明反义链一个100点的检测。图表显示了100年注射点之间的显著差异反义链匹配(黑色曲线)和注射100点反义链不匹配(红色曲线,不匹配两个nonmatching碱基对的中心目标)。注入匹配样本诱发大约−200海里微分偏转,别的地方不匹配的注入配置导致几乎没有差分信号。阶段(我)显示了记录基线10点μL / min缓冲流。(2)1 ' 000μL注射试样在100μL / min。(3)孵化阶段10点μL / min。(四)冲洗缓冲100μL / min。(V)导致微分偏转注射周期完成后(10μL / min缓冲流)。曲线对应于积极的微分偏转信号减去参考悬臂(CL)。因此悬臂梁的弯曲不是绝对而是微分变位。两个注射进行串联在同一悬臂阵列芯片。基线校正、标准化、平均和差分信号计算(探针-引用)是根据文献[15]。孵化领域凸显出流速度增加注入和洗阶段。颜色区域表示探针分子流室的存在。

通过温度的稳定和连续流漂移测量原始偏转信号减少从~ 12海里/分钟~ 2.5 nm /分钟,如图3。设置和描述协议代表漂移明显降低5倍相比,之前的实验与读出静止液体进样之前和之后。的增益精度测量的重要性尤其杂交与反应时间> 1分钟。典型的漂移图所示3在所有实际测量。


图3
典型的漂移之前(红色曲线)和之后实现(蓝色曲线)意味着减少漂移(连续流、温度调节等如本文所述)。曲线显示的平均值记录的原始数据从8悬臂梁和相应的标准差。曲线有一个抵消为零。红色曲线测量在静止的条件下(流:0μL / min)。蓝色曲线测量流(10μL / min)。

的电子零件我们使用最先进的组件。放大器的噪声水平约为1μV, PSD ~ 3μV ( B W = 1 0 0 赫兹)。模拟数字转换器NI pci - 6221 ~ 122μV噪音水平因此电气干扰的主要来源(来自数据表的值表示VRMS说明关键组件)。因此我们调整了一系列规模最大的信号电压测量,取其平均值在几个点(1 ' 000样品在500 ms)。这可能是因为缓慢的反应时间(> 1 Hz)与采样率相比,电子零件的特性。此外我们优化的解决时间激光控制器和调整后的数据处理,让激光稳定切换。上半年平均之前,我们丢弃的数据一定要有一个稳定的激光信号。剩下的500个样本仍然足够供平均降噪。由于顺序读出一个采样时间太久可能导致失踪事件的反应。

通过将一个控温元件靠近悬臂阵列控制循环中获得很短时间常数对温度平衡。时间来调节室内的温度从21°C室温25°C选点是大约0.5分钟。慢得多流循环温度调节回路的珀尔帖效应元素会导致一个稳定的温度探头船只,缓冲储层,和周围的元素。此外,大( 2 3 × 3 5 × 2 。 5 厘米)铝板提供了一个良好的热交换。调节温度从室温到定位点的流动循环恒温器~ 50分钟。

这两个平流注射器泵与虚拟仪器控制软件中嵌入。有两个计量模块无限流可以被编程,甚至一夜之间运行的测量。除了电子和温度漂移的主要部分整体漂移明显偏转信号漂移是由于扩散的影响(例如,离子之间的交流悬臂表面和周围液体)。之间的连续流动导致快速平衡悬臂表面和周围液体扩散独立。一个特征时必须考虑测量的流层流的悬臂梁的影响,当我们看到一个偏转由于流动的力量。在实验中读出在静止液体进样之前和之后在注射过程中液相运动。这导致重大流引起的变形量(见例如[10])。根据传感器的位置相对于液体室通道流部队将八个悬臂梁的不同,导致不同的附加弯曲,可能影响实测挠度值。通过测量基线和实际杂交信号等效缓冲流速度,可比性。典型的水弹性弯曲,从静止的流体切换到10μL / min 7海里。增加注入流量感应弯曲的400 nm(见,例如,图2)。截流宣读只有一个简短的“停止”阶段记录数据点(小得多的时间比漂移动力学)可以添加额外的改进。

由于仪器设计限制(流程,缺乏空间和温度敏感性)我们决定设置流动注射泵的牵引模式。这个拉方法的缺点是吸空气流动路径的风险。小气泡将坚持悬臂阵列并导致堕胎的测量。通过补偿压力损失与正压探头一侧,我们避免了这些问题。此外,海拉尔油管被选为避免气体扩散到系统中。氧气的气体渗透率值对海拉尔类似于PEEK和~ 30倍不到聚四氟乙烯(根据规范指南的提供者)。此外,海拉尔油管一样灵活的聚四氟乙烯管,与PEEK原本是一个完美的材料在气体扩散和低亲和力的生物分子。

气泡会粘在小角落在射流路径,需要删除一个耗时的过程。有限公司2喷雾允许快速射流系统启动没有泡沫。的缓冲特性和关闭公司的解决方案2连接后启动确保有限的效果2缓冲区的酸度可以忽略不计。

4所示。结论

平衡时间和漂移显著降低了快速温度控制系统和连续的流量测量。安装悬臂芯片后,大约需要1.5 h,直到系统准备措施。主要耗时的步骤是悬臂功能化尽管协议简化了使用pre-gold-coated数组和UV / O3激活。与公司2鼓泡、压力补偿和海拉尔油管除气泡的形成及其耗时是可以避免的。进一步调查的影响将进行悬臂连续流动。的增益漂移减少(大约10 nm /分钟)相比,水弹性弯曲(~ 7海里)导致的假设下测量连续流是一个进步。最先进的电子元件和信号稳定性调查导致一个稳定和可靠的设备(< 5纳米功能化悬臂的液体波动的典型记录时间表0.25赫兹)。设备控制、测量和数据分析的虚拟仪器导致快速和简单的工作流。短的寡核苷酸链的具体检测100点集中在生理缓冲条件下证明了概念证明的设置。

确认

我们要感谢马丁Hegner集团在都柏林三一学院的指导建立和测试仪器和测量提供有价值的数据参考。我们承认恩斯特迈尔,巴塞尔大学和雷莫Hochstrasser,罗氏公司,为他们的想法,帮助提高仪器仪表、格雷戈尔Dernick,罗氏公司,分析发展中对他的支持,和乌尔里希Certa f .罗氏公司,支持生物背景。