基于丙氨酸脱氢酶的安培生物传感器测定水中低水平氨离子

摘要

研制了一种用于氨(通过将丙氨酸脱氢酶(AlaDH)固定在由聚甲基丙烯酸- 2-羟乙基酯(pHEMA)组成的光固化甲基丙烯酸膜上的丝网印刷碳糊电极(SPE)进行离子检测。电流检测是基于电催化氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原(NADH)，这是成比例的消费同时酶胺化AlaDH和丙酮酸发生。该生物传感器在+0.6 V和最适pH 7的电势下操作。的生物传感器显示线性响应在0.03 ~ 1.02 mg/L范围内测定，检出限(LOD)为8.52μg / L。该方法已成功地应用于测定未经预处理的河水样品中离子的含量。水中可能的干扰水平是可以忽略不计的，以对所提议的方法造成任何干扰。该生物传感器的分析性能与奈氏化比色法相当，但在ppb水平下具有较低的检测限和线性响应范围。

1.介绍

在世界水系中，离子是植物在低浓度条件下生长所必需的元素。然而，由于微生物对生物废物和污水的不完全降解、动植物的排泄、肥料的释放、农业径流和工业排放，这种物种的浓度很高[1- - - - - -5]．Wee等人[6揭示了…的机理鱼类的毒性可能与哺乳动物相似。离子作为气溶胶形成的前体也起着重要作用[7]．因此，开发一种灵敏、选择性的分析方法离子是重要的。

离子对公众健康是一种威胁，因为它可能是一种疾病或疾病的指标，如肾脏疾病，胃细菌感染，或肝功能障碍的摄入受污染的食物(5，8- - - - - -10]．长期的高浓度血液中的离子会严重干扰大脑功能[11]．在生物层面，导致呼吸过度兴奋昏迷抽搐最后死亡的决心因此，自然水中的离子是环境生物学研究和水的环境评价的重要内容，因为已知其浓度高于0.025 mg/L时对水生生物是有毒的[4，9，12- - - - - -14]．

由于环境意识的提高和污染控制的法规更加严格，大量的研究被证明可以确定离子在水中。其中包括流动分光光度法[15]，溶剂萃取分光光度法[16]，紫外-可见分光光度法[8),电位(17，18]，流动注射荧光分析[19]、安培法[1，9]、氨氧化细菌分子法[20.- - - - - -22，连续比色测定法[3.，23]，以及荧光测量[4，24]．然而，这些方法要么是耗时的，要么需要详细的准备程序。例如,基于分光光度法、荧光法和比色法的离子测定方法虽然简单、经济、易于自动化，但它们需要对样品进行预处理，以避免背景干扰。光学测量最常用的技术是Berhelot反应[3.，25]．但仍有缺点，如动力学缓慢、试剂消耗和反应本身的不可逆性[4]．而电位法涉及到选择电极离子测量，受碱金属离子干扰[26，27]．

酶生物传感器具有检测速度快、选择性高、灵敏度高等优点，已广泛应用于临床、食品、环境等领域。将酶固定在电极表面是制造电酶生物传感器的关键步骤。用于固定化酶的程序应能产生稳定性，允许底物和产物的扩散，并确保有效的电子转移[28]．在本研究中，通过将AlaDH酶加入到光hema膜中来修饰SPE的安培方法可能提供相当简单、经济、可靠、快速、灵敏、可重复的分析方法和控制固定化酶的分布和方向。与基于电位的分析方法相比，这大大提高了分析的灵敏度。此外，该方法不受碱金属离子(主要是钾离子)干扰，影响电位非肌动蛋白基电极。数字1代表了电极设计，暗示了在光hema中固定化AlaDH的酶反应机制。

在酶学中，AlaDH酶催化的化学反应如下式所示(见1）;［29])。在辅助因子NADH存在下，AlaDH酶催化丙酮酸还原胺化生成l -丙氨酸[30.]．这种酶对丙酮酸的亲和力是l -丙氨酸的四倍[31]．在酶的氧化还原反应中，AlaDH酶消耗对丙酮酸和NADH进行特定胺化反应的离子被氧化为NAD⁺．NADH在工作电极上的电化学氧化产生两个电子(见2）;［32)导致电流的提高与分析物的浓度成正比．因此，通过安培法监测NADH酶的消耗，间接测定信号

(1）

2.实验部分

2．1．试剂

所有使用的化学试剂都是分析级的，整个溶液制备过程都使用去离子水。原液0.0032 mg/μL-丙氨酸脱氢酶(AlaDH, E.C. 1.4.1.1, from枯草芽孢杆菌) (Sigma)的制备方法是将适量的AlaDH酶溶液与10 mM磷酸缓冲液pH 7在阑尾管中混合，4°C保存[33]．10毫米β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原形式(NADH, 98%)从西格玛制备新鲜的冰冷却10毫米磷酸盐缓冲液pH 7，并迅速使用。丙酮酸钠(C_3.H_3.NaO_3.将适量丙酮酸盐溶解在去离子水中制备(Sigma)原液。通过加入10 mM磷酸氢二钾(K₂HPO₄(Fluka)至10 mM磷酸二氢钾(KH₂阿宝₄， 99.5%) (Fluka)，并调整至所需的pH值[33]．

将需要量的浓氨水(nhh)溶解，制得标准原液氨水_3.(默克)在去离子水中。所使用的氨溶液已用纳斯勒法用氯化铵(NH)进行标准化₄Cl, 99.5%)盐。甲基丙烯酸单体2-羟乙基酯(C(CH ._3.)库奇舞₂CH₂通过适量的单体HEMA和引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPP) (C₁₆H₁₆O_3.(Fluka)装在小瓶中，用铝箔包裹。然后将混合物轻轻搅拌几分钟，并保存在4°C。

2．2.仪表

使用AUTOLAB PG12 (AUT 71681)恒电位器/恒电流仪进行计时安培测量。由马来西亚Kebangsaan大学设计、Scrint Print公司制造的丝网印刷碳糊电极(SPE)被涂以固定的AlaDH酶膜作为工作电极。分别以Ag/AgCl电极和玻碳电极作为参比电极和辅助电极。在安培测量过程中，使用磁性搅拌器搅拌电解液。pH测量由pH计(MeterLab PHM 210)使用组合玻璃电极进行。采用紫外光引发光聚合法制备了含有AlaDH酶的pHEMA膜(RS Components 196-5251)。

2．3.构建生物传感器

用单体HEMA和5的AlaDH酶的混合物制备AlaDH酶电极μL以1:1的比例制备，酶浓度为0.6单位。然后将混合物沉积在SPE上，在长波紫外线辐射下用大量的氮(N₂)气体的排除。

２.４.生物传感器响应的优化

定量测定的采用AlaDH酶电极计时电流法测定。电化学生物传感器的性能从最佳条件、动态范围、检测限、重现性和重复性研究、流体力学研究和货架期研究等方面进行了表征。研究在室温下进行，以5 mL 10 mM磷酸盐缓冲液pH 7作为载体溶液，在恒定搅拌条件下(100 rpm)进行。底物混合物中含有离子、丙酮酸和NADH在获得稳定基线后加入到安培电池中。测量值表示为电流差，定义为电化学反应后得到的稳定电流减去稳定基线电流。测量分三次进行。

首先用循环伏安法研究了AlaDH酶电极在−1.00-1.00 V与Ag/AgCl之间的电流响应，扫描速率为0.02 V/s。接下来，通过改变0.45-0.80 V的外加电位对Ag/AgCl的影响进行流体力学研究。通过在pH 5.8-8.0范围内改变载体溶液(10 mM磷酸盐缓冲液)的pH来研究pH对生物传感器响应的影响。而酶载量的影响是通过改变pHEMA膜上的酶载量在0.0900-0.8250单位范围内来实现的。

制备不同膜厚、不同单体HEMA和AlaDH酶(0.5-6)混合物的酶电极μL)，以1:1的比例制备，固定酶载量为0.6单位。然后用0.01 mm精度的数字游标卡尺测定膜的厚度。

为了确定温度对生物传感器响应的影响，温度从10°C到50°C不等。为了优化各自的NADH和丙酮酸浓度，使用不同浓度丙酮酸(0.001-0.05 mM)和NADH (0.02-0.3 mM)的磷酸盐缓冲液pH 7。在此基础上，研究了不同浓度对生物传感器性能的影响离子浓度(0.03 ~ 3.41 mg/L)、丙酮酸和NADH浓度保持不变。

通过测量不同固相萃取物对相同固相萃取物的响应来研究生物传感器的重现性离子浓度为0.68 mg/L。而生物传感器的重复性是用相同的SPE进行研究的在0.68 mg/L浓度下，每个SPE采集5次电流差信号。采用1.53 mg/L的AlaDH酶基电极对其货架期进行了研究离子使用同一电极的时间间隔为2天，直到获得平台响应。

评价碱(Na⁺K⁺)、碱性土(Mg^2＋、钙^2＋)、重金属(铁^３＋)、胺(甲胺、乙胺)和硫酸离子(SO₄²⁻)干扰，双组分混合物离子与干涉在不同的摩尔比的干涉用安培法分析10-5000范围内的离子。干涉/获得的电流差异与纯的单组分溶液(0.68 mg/L)进行了比较离子)使用t以及。

最后，将构建的生物传感器应用于不同标准浓度的样品的回收率测试河水的离子和实际样品分析。用已建立的奈斯勒方法对结果进行了验证。

3.结果和讨论

数字2结果表明，AlaDH酶电极在含10 mM磷酸盐缓冲液pH 7的水溶液中，在无底物和有底物1.70 mg/L的条件下具有典型的电催化活性离子。实验在0.3 mM丙酮酸和NADH的存在下进行，在−1.00-1.00 V的电位范围内，对Ag/AgCl电极的扫描速率为0.02 V/s。添加酶催化丙酮酸转化为l -丙氨酸时，NADH电催化氧化，在0.4-0.9 V的电势范围内产生较大电流离子同时酶的氧化还原反应。因此，量化似乎是可能的通过测量NADH氧化电流的增加，间接提高了离子浓度。

以便选择最佳电势用于安培测定在0.45-0.80 V的电位范围内，记录Ag/AgCl电极的水动力伏安图(图)3.）.在外加电位+0.6 V时，电流达到了平台，因此，该电位被用于进一步的研究。贝托奇和康巴格尼[32]报告了同样的结果趋势在安培谷氨酸脱氢酶(GLDH)酶基探针离子测定。

酶是两性分子，含有大量的酸和碱基团，主要位于它们的表面。这些基团上的电荷会根据它们的pH值环境而变化。这将影响酶的总净电荷和其外表面电荷的分布，以及催化活性基团的反应活性。这些效应在活动场地附近尤其重要。总之，电荷随pH值的变化影响酶的活性、结构稳定性和溶解度。AlaDH的等电点为pH 6.7，此时酶在水溶液中的溶解度一般最小，分子上的净电荷为零[34]．与对酶的影响类似，底物、产物和辅酶上的电荷和电荷分布也会受到pH变化的影响[35]．在目前的工作中，固定的AlaDH的最大灵敏度是在pH 7.0(图4）.Schroder等[31]也报道了AlaDH对脱胺和胺化反应的最适pH为~ ph7.0。

如图所示5，随着膜上AlaDH酶载量的增加，反应增强。结果表明，在该体系中，酶载量为0.6个单位就足以获得足够高的响应。关等人[36]使用了相同数量的AlaDH酶，用聚氨甲酰磺酸(PCS)水凝胶包封在特氟龙膜上，以安培法测定丙氨酸。表格1显示含有0.6单位AlaDH酶的pHEMA膜的厚度，使用数字游标卡尺以0.01 mm精度测定。

膜厚对AlaDH电极响应的影响如图所示6．结果表明，AlaDH酶光hema膜的最适厚度为0.23 mmμ由于L矩阵的标准偏差最低，使相同的电极每次并给出一致的信号对相同的底物浓度。在后续的工作中，没有选择0.25 mm的膜厚作为固定化酶的膜厚，因为较厚的pHEMA膜具有更多的交联结构，可以防止或减缓底物穿透膜影响酶的反应，从而导致反应降低。

温度是生物传感器性能必须考虑的另一个参数。数字7显示生物传感器的温度响应。响应随温度增加而增加，最佳温度为35℃。这种在较高温度下增加的稳定性可能是由于聚合物基质作为一种支架，从而防止由于广泛的构象变化而发生变性[37]．无论如何，由于酶反应缓冲液中溶解氧的可用性降低和酶的缓慢变性的促进，高工作温度(30°C)不能有效地提高传感器性能[36]．当温度移至55℃时，AlaDH酶失去了约70%的原始活性[29]．在本工作中，所有后续实验的工作温度均选择为25℃，因为生物传感器的灵敏度足够好，可以进行进一步的研究。

为了提高AlaDH电极的性能，研究了不同浓度的丙酮酸和NADH。为优化各自的丙酮酸和NADH浓度，生物传感器响应为1.70 mg/L不同丙酮酸和NADH浓度的离子如图所示8和9．响应随丙酮酸和NADH浓度的增加而增加，分别在0.01 mM丙酮酸和0.25 mM NADH浓度下达到饱和。

的响应曲线用AlaDH酶电极测定的离子浓度如图所示10．高原地区是在集中时达到的离子浓度高于1.53 mg/L。

的情节离子浓度与电流差呈线性关系离子浓度范围为0.03 ~ 1.02 mg/L11）.plot的线性部分可以用回归方程来描述 与相关系数R²0.974。的LOD离子，这里定义为等于空白信号加上3倍空白标准差的浓度[38为8.52μg / L。

酶促反应的动力学参数可以通过Lineweaver-Burk图的直接线性方法从实验数据中估计[39]．表观米凯利斯-曼腾常数()估算的Lineweaver-Burk图为0.029 mM离子(图12）.

用安培法测定离子已经被开发和报道。在测量电流的Abass等开发的电极[1采用了经过Meldola 's Blue修饰的SPE，上面固定了聚碳酸酯膜。这个传感器检测通过测量电流的下降速率，发现电流的下降速率依赖于GLDH酶、2-氧戊二酸和NADH的浓度。Kwan等人报道的氨生物传感器的灵敏度[9与本研究中报道的生物传感器(基于在光hema膜中固定的AlaDH)相比，使用含有双酶体系的固定化基质聚氨甲酰磺酸水凝胶的含量更低，但本研究中报道的生物传感器显示了更宽的线性范围，为0.029-4.26 mg/L。另一种荧光测定方法采用柱后衍生化离子色谱法测定o-酞二醛(OPA)在高浓度的钠和氨基酸基质下已经由Kuo等开发[24]，灵敏度良好，线性范围为0.85 ~ 85.17μg/L, LOD为0.85μg / L。为了去除氨基酸干扰，采用氨与OPA和亚硫酸盐反应的柱后衍生法。因此，与迄今为止报道的氨生物传感器相比，本研究开发的氨生物传感器在制备和应用方面具有优势，但其性能与使用其他固定化基质的氨传感器具有可比甚至更好的性能。

在0.68 mg/L条件下评价了生物传感器的重复性和重复性离子。使用同一SPE获得的当前差异测量得到了令人满意的重复性RSD值，范围为6.4-11.2% (）.而使用不同SPE测量得到的RSD值很有希望为1.4-4.5% ()(图13）.这些RSD足够低，可以考虑到使用本工作中提出的方法的膜是可重复性的。

测定AlaDH酶基电极的保质期为1.53 mg/L每次间隔2天。一旦进行了测量，酶电极就被储存在4°C的冰箱中。储存2天后，生物传感器的灵敏度下降更快，约为初始灵敏度的40.1%，在第5天持续下降到29.3%，直到11天的储存期间没有观察到显著的电流差异(图)14）.AlaDH酶基电极货架期研究数据见表2．

Kwan等人开发了一种使用AlaDH酶的安培生物传感器[36]来测定丙氨酸。该方法的操作稳定性为2天。但是，由于水杨酸羟化酶和丙酮酸氧化酶的结合会调节测量溶液的缓冲pH，该方法存在一些问题。

在本工作中，观察到碱土、碱土、重金属和SO₄²⁻离子对定量测定无明显干扰离子浓度(表3.）.干涉的典型摩尔比天然水中的离子含量低。所以，存在干扰离子的浓度高于水中不可能有离子。然而，在高干扰摩尔比下，生物传感器的响应显著降低离子与得到的t价值高于t临界值在95%置信水平。这是因为高浓度离子的存在增加了介质的离子强度，进一步降低了酶的活性。溶液的离子强度是影响酶活性的重要参数。当催化依赖于带电分子相对于彼此的运动时，这一点尤为明显。因此，带电底物与酶的结合以及催化“活性”位点内带电基团的移动都将受到介质离子组成的影响[34]．

该酶被K⁺但稳定程度低于钠⁺离子。可以推测，稳定性取决于这些碱金属离子的水化作用。然而，离子的水合势按霍夫迈斯特级数的顺序为:Na⁺> K⁺［29]．这与观测到的干涉效应的顺序是一致的:K⁺> Na⁺．菲^３＋和Ca^2＋离子在干涉的摩尔比超过显著干涉由于Fe(OH)的不溶性沉淀的形成，_3.和Ca(哦)₂［40，41降低了生物传感器的重现性。

的决心胺类，特别是甲胺(CH_3.NH₂)和乙胺(C₂H₅NH₂)，其物理化学性质与离子。然而，在自然水域中胺的干扰是出乎意料的，因为它们的含量很低，通常至少低于100倍离子(23]．

的性能生物传感器已经被评估使用稀释的河水样本加入已知离子浓度在0.17-1.02 mg/L范围内。表格4结果表明，生物传感器对添加了已知元素的不同河流水样的响应性能良好离子浓度。在实验误差范围内，平均回收率接近100%。因此,本研究开发的生物传感器已通过奈斯勒法的标准方法进行验证。在一些样品中，如样品1和样品2的加标浓度和生物传感器响应之间观察到的标准偏差有很大的变化4)，最可能的原因是使用的尖刺技术不一致，特别是当涉及较低浓度的铵离子。

以确保所提出的方法得到的分析结果在定量测定时是否能给出可靠的结果用这两种方法测定了离子、适当稀释的河水样品。表格5展示了生物传感器与奈斯勒法的对比研究结果。常见的t-检验用于检验两种方法是否在95%置信水平下给出显著差异的结果。

计算结果表明t-测试值小于t临界值为2.776，自由度为4。结果表明，两种方法在统计学上无显著差异离子的决心。这可能是由于实际样品中的杂质对所研制的生物传感器没有干扰。这表明两种方法的结果具有可比性。

4.结论

结果表明，优化后的AlaDH酶基电极可用于高灵敏度检测离子。此外，该电极测量的重复性和重复性是合理的。固相萃取法制备含AlaDH酶膜采用了简单的光刻技术。这可以被认为是一次性的，因为这种制造方法可以以低成本大规模生产。该电极具有较高的灵敏度(LOD, 8.52μg/L)，动态范围为0.03-1.02 mg/L。生物传感器与奈斯勒方法的一致性表明生物传感器在水样分析中具有较高的实用性和准确性。

致谢

作者感谢马来西亚Kebangsaan大学提供的研究型大学运营基金(UKM-OUP-NBT-29-151/2011)。作者还要感谢马来西亚Kebangsaan大学授予谭玲玲研究生奖学金。

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