N H 4 + ) ion biosensor based on alanine dehydrogenase (AlaDH) was investigated. The approach of the study was based on construction of biosensor by direct deposition of AuNPs and 1,8-octanedithiol (C8-DT) onto the gold electrode surface. For the immobilisation of enzyme, 2-mercaptoethanol (2BME) was first covalently attached to AlaDH via esther bonding and then followed by chemically attached the 2BME-modified AlaDH (2BME-AlaDH) moiety onto the AuNPs electrode via the exposed thiol group of 2BME. The resulting biosensor response was examined by means of amperometry for the quantification of N H 4 + ion. In the absence of enzyme attachment, the use of three layers of AuNPs was found to improve the electrochemistry of the gold electrode when compared with no AuNPs was coated. However, when more than three layers of AuNPs were coated, the electrode response deteriorated due to excessive deposition of C8-DT. When AlaDH was incoporated into the AuNPs modified electrode, a linear response to N H 4 + ion over the concentration range of 0.1–0.5 mM with a detection limit of 0.01 mM was obtained. In the absence of AuNPs, the N H 4 + ion biosensor did not exhibit any good linear response range although the current response was observed to be higher. This work demonstrated that the incorporation of AuNPs could lead to the detection of higher N H 4 + ion concentration without the need of dilution for high N H 4 + ion concentration samples with a rapid response time of <1 min."> 多层的影响金纳米粒子对铵离子的电化学响应生物传感器基于丙氨酸脱氢酶酶 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果
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杂志上的传感器
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杂志上的传感器/2011年/文章

研究文章|开放获取

体积 2011年 |文章的ID 754171年 | https://doi.org/10.1155/2011/754171

棕褐色的玲玲,穆萨·艾哈迈德·李Yook亨,Toh Chee生, ”多层的影响金纳米粒子对铵离子的电化学响应生物传感器基于丙氨酸脱氢酶酶”,杂志上的传感器, 卷。2011年, 文章的ID754171年, 8 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/754171

多层的影响金纳米粒子对铵离子的电化学响应生物传感器基于丙氨酸脱氢酶酶

谭玲玲,1 穆萨艾哈迈德,2 李Yook亨,1 和 (Chee生3

1化学科学学院和食品技术,科学与技术学院、马来西亚Kebangsaan大学(UKM)雪兰莪州,43600 Bangi,马来西亚

2化工技术项目,学院科技、伊斯兰教马来西亚理科大学,班达尔巴鲁汝,Negeri Sembilan, 71800汝,马来西亚

3理学院化学系,新加坡国立大学,新加坡

学术编辑器:Eugenio Martinelli
收到了 2011年5月24日
修改后的 07年8月2011年
接受 2011年8月26日
发表 2011年11月13日

文摘

使用多层的金纳米粒子(AuNPs)附加在金电极表面通过硫醇化学制造一个铵( )离子生物传感器基于丙氨酸脱氢酶(AlaDH)调查。研究的方法是基于建设生物传感器直接沉积AuNPs和1,8-octanedithiol (C8-DT)在金电极表面。固定的酶,2-mercaptoethanol (2 bme)首次通过以斯帖共价连接到AlaDH键然后其次是化学附加2 bme-modified AlaDH (2 bme-aladh)一半到AuNPs电极通过硫醇基2 bme公开。由此产生的生物传感器的反应检查通过电流滴定法的量化 离子。在缺乏酶附件,使用三层AuNPs发现提高黄金的电化学电极相比,没有AuNPs涂层。然而,超过三层的AuNPs涂布时,电极反应由于过度沉积C8-DT恶化。当AlaDH把AuNPs修饰电极,一个线性响应 离子的浓度范围的检测极限0.1 - -0.5毫米0.01毫米。在缺乏AuNPs, 离子生物传感器并没有表现出任何好的线性响应范围虽然目前的反应是观察到的要高。这项工作表明,AuNPs的合并可能会导致更高的检测 离子浓度高,无需稀释 离子浓度样品的快速响应时间< 1分钟。

1。介绍

的快速发展对纳米颗粒的研究起源于他们的独特的物理和化学性质。与平均粒径在纳米粒子独特的行为不同于批量和量子材料(1,2]。纳米材料具有巨大的潜在应用因其新颖和有趣的属性。这包括诸如纳米电子、磁存储、催化、生物检测、传感器、标签,和化妆品2- - - - - -4]。纳米材料的特殊物理特性之一是大量的原子成分存在的粒子的表面和纳米材料的物理性质与表面改性的纳米材料的1]。

在过去的十年中,AuNPs已经深入研究了由于他们的前途的特征不透露大量黄金,即小粒度特性,光学、电子和化学性质3- - - - - -6]。众多的调查方式的应用和制备AuNPs被广泛讨论的文献,特别是在制造的化学传感器、生物传感器、催化剂、非线性光学设备(3,6]。针对劣质散装的特征黄金电极对于电化学活性表面基团,金电极已经建议改善这些缺点(3,4]。几个金属纳米颗粒与非盟等优良的电化学性能,Pt和Pd广泛利用构建高度活跃的电极电化学应用的目的(7,8]。基团,电极采用AuNPs获得了实质性的关注主要的有趣electrocatalytic和若功能。固定AuNPs到电极基质包含截留,浸渍,deposition-precipitation、电镀、浸涂方法(5,7,8]。

AuNPs之间形成的绑定和金属电极表面可以是静电链接(9]或[共价结合10]。酶固定基于二维和三维纳米颗粒膜通过静电链接建设生物传感器已经广泛地探讨由于纳米材料的大选择11,12]。化学吸附或者共价结合AuNPs通常需要一个双官能团的桥,这夫妻AuNPs金属表面,例如,脂肪族二元胺和二硫酚3,11]。硫醇的自发吸附和胺(nh (sh)2)在金表面官能团允许分层AuNPs形成自组装单层膜由于其高亲和力黄金表面(2]。AuNPs自组装的金属表面,利用有机基团已经检查了各种潜在的应用,例如,光电子、微电子和生物科学(2]。这是归因于AuNPs高反应活性的表面能形成稳定的共价键与passivative有机物分子(1]。

共价结合生物分子通过直接连接到电极表面已集中应用于生物传感器的发展。协会酶分子AuNPs发现提高了生物传感器的性能由于固定表面积大、高稳定性和优良的生物相容性AuNPs[提供的12,13]。通常关注的化学或物理因素的影响上的蹩脚酶分子(10]。缓解这样的问题,修改电极表面与AuNPs保证酶分子的性质保留其最大(13]。已经声称nanometric边缘AuNPs可以渗透到蛋白质分子减少电极之间的距离和酶氧化还原网站(10),从而增加了电子转移速率(14,15]。相比之下,固定的酶分子通过物理吸附的方法有一个缺点缺乏稳定性。因此,共价酶分子的忍耐到AuNPs推荐。

在目前的研究中,我们演示了一个简单的方法来制造一个健壮的AuNPs-based生物传感器。更高的固定表面积收购交替沉积的金胶体和双官能的有机链接器C8-DT在金电极表面。AlaDH酶的羧基基团(羧基)伴随着羟基(-哦)2 bme的官能团在微碱性条件下通过酯化反应。2 bme / AlaDH酶被固定共价AuNPs电极上通过Au-S债券。多层AuNPs-based的设计 离子生物传感器呈现在图1。增加的效果层AuNPs沉积的响应 离子也被调查。在这项研究中,AlaDH酶作为酶模型的定量测定 在周围的水离子浓度。的调查 离子在水中被认为是至关重要的,因为它可以在浓度和危害水生生物存在于高浓度废水在国内(16- - - - - -18]。


图1
的设计离子生物传感器基于固定2 bme / AlaDH AuNPs电极上酶。

2。实验

2.1。试剂

在这项研究中使用的所有解决方案都准备用超纯水(Nanopure超纯水系统)和使用的所有化学品购买从商业来源和使用前未经纯化。金胶体,HAuCl 5纳米(~ 0.01%4),在新加坡和从Sigma-Aldrich购买作为收到。股票的解决方案0.004毫克μL丙氨酸脱氢酶酶(AlaDH,提到过1.4.1.1,从枯草芽孢杆菌)(σ)是由溶解适量的AlaDH酶在10毫米磷酸盐缓冲剂的pH值7一个埃普多夫管并将其保持在4°C (19]。5毫米β简化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH 98%)获得与冰冷的σ和准备10毫米磷酸盐缓冲剂pH值7和及时使用。1毫米2 bme (C2H6操作系统,99%,Sigma-Aldrich)是由混合2 bme超纯水的适量。股票的解决方案5毫米丙酮酸钠(C3H3NaO399%,σ)是由溶解适量的丙酮酸盐在超纯水。10毫米磷酸盐缓冲剂pH值7准备通过添加10毫米磷酸氢二钾(K2HPO4σ,98%磷酸二氢钾(KH)到10毫米2阿宝499.5%,σ),调整到所需的pH值(19]。标准氨股票的解决方案是由溶解浓氨溶液(NH)3,用超纯水25%,默克公司)。已经使用的氨溶液与纳氏比色法使用氯化铵(NH标准化4Cl, 99.5%,默克公司)盐。1,8-octanedithiol (C8H18年代2从奥尔德里奇,97%)溶解在绝对乙醇(C2H5哦,里德尔de Haen, 99.9%)和由最后一个0.3毫米的浓度。

2.2。仪表

循环伏安法(CV)和计时电流法实验使用气440电化学工作站(CH仪器、美国)在三电极电化学电池。工作电极使用黄金电极(模型CHI101, 2毫米直径)。铂网和Ag / AgCl饱和氯化钾作为辅助和参考电极,分别。AuNPs电极的表面形态图像获得使用场发射扫描电子显微镜仪器(XL30-FEG SEM、范公司5 kV操作电压)配备了一个能量色散x射线分析仪(EDX)。瑞士万通744酸碱计测量pH值。

2.3。电极表面预处理和描述

电极进行预处理方法Tkac报道,戴维斯(20.)做了一些调整。金电极进行预处理是通过还原解吸在0.1 M氢氧化钠与100重复简历扫描−0.5 V和−1.5 V之间的扫描速率和Ag / AgCl 1 Vs−1。这个过程是必要的,任何被吸附物的彻底清除痕迹从先前的实验。金电极与0.3然后机械抛光μ米铝浆在抛光布(盟军)4分钟,冲洗和清洁超声2分钟的超纯水去除残余氧化铝颗粒。金电极的化学预处理浸金是由电极成热的水虎鱼的解决方案(H2所以4:H2O23:1)15分钟,其次是清洗和超声波清洗与超纯水2分钟。电极然后转移到一个电化学的电池和电化学抛光进行了连续25简历扫描−0.2 V至+ 1.5 V和Ag / AgCl参考0.1 H2所以4扫描速度0.1 Vs−1。电化学氧化金剥离了10重复简历扫描+ 0.75 V至+ 0.2 V和Ag / AgCl 0.1 H2所以4扫描速度0.1 Vs−1。最后,黄金的化学还原氧化物的电极是由浸泡20分钟绝对nonstirred条件下乙醇在室温下(24.4°C),之后在氩气干。

AuNPs沉积在金电极是通过扫描电镜检查。各层样品准备使用黄金石英基质(CHI125,抛光,绑定,堆起100 Ti + 1000黄金水晶)与水虎鱼清洗解决方案。0.5μL(金胶体和1μL的0.3毫米C8-DT交替液滴包裹到不同的黄金石英基质,留下过夜。样本然后反复冲洗与Ar绝对乙醇和干气被检查之前使用SEM乐器。

2.4。建设多层AuNPs-Based 离子生物传感器

多层AuNPs-based生物传感器是沉淀0.5臆造出来的μL胶体AuNPs到金电极表面,在室温下干了15分钟。1μL(0.3毫米C8-DT然后放置到AuNPs电极上并保持在环境温度为30分钟。多层的AuNPs是由重复上述沉积方法AuNPs和C8-DT金电极。AuNPs电极是储存在室温下过夜(24小时)后沉积的最后C8-DT层。然后,修改后的电极是在绝对乙醇浸泡15分钟,冲洗多次与丰富的绝对乙醇除去未反应的纳米颗粒和免费二硫酚与Ar气体清除紧随其后几分钟。50μ0.008 mg / LμL AlaDH酶反应是50μL 1毫米2 bme在微碱性条件下了一个小时。最后2μL 2 bme / AlaDH酶解当时液滴包裹到AuNPs电极和存储在一夜之间在4°C。2 bme / AlaDH enzyme-modified AuNPs电极终于在缓冲溶液中浸泡15分钟,反复冲洗与充裕的缓冲溶液去除任何释放2 bme / AlaDH酶。

2.5。优化生物传感器的响应

优化AuNPs电极反应是通过阴极氧化还原的黄金执行在5毫升0.1 H2所以4解决方案使用CV方法从−0.2 V至+ 1.5 V和Ag / AgCl参比电极。裸金电极、C8-DT-modified金电极和AuNPs-modified金电极进行了连续运行8个简历扫描扫描速度50 mV / s - 200 mV / s。

AuNPs-based生物传感器的反应 离子与简历检查方法存在和缺乏1.6毫米 离子在4毫升10毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7)。可能是骑车−1.00 V至1.00 V和Ag / AgCl参比电极的扫描速率100 mV / s。non-stirred条件下进行了实验的NADH丙酮酸0.1毫米和0.2毫米。

那时的enzyme-modified AuNPs电极用于定量测定 离子chronoamperometric方法以固定+ 0.55 V的潜力在激起了电解质溶液包含4毫升10毫米磷酸盐缓冲剂pH值7。实验进行的NADH丙酮酸0.1毫米和0.2毫米 离子浓度变化从0.1毫米到1.4毫米。

3所示。结果与讨论

3.1。AuNPs电极反应的优化

在潜在的扫描−0.2 V至+ 1.5 V和Ag / AgCl与裸金电极,参比电极C8-DT-modified金电极,AuNPs-modified黄金电极0.1 H2所以4解决方案,观察单个阴极峰约为+ 0.9 V的峰值位置与之前报道中发现了协议伏安黄金氧化还原(20.]。

循环voltammograms裸金电极,C8-DT-modified金电极,电极AuNPs表明,阴极峰电流( )反应是与扫描速率的平方根成正比( )从50 mV / s - 200 mV / s。的线性行为 与 建议在电极表面的氧化还原网站数量是恒定的扫描速度区间进行了研究。这个预计diffusion-controlled电子转移过程(12,21]。然而,非零截距 与 plost可能归因于nonfaradaic电流从解决电子电阻(21]。

观察到的,没有明显的增加 信号在扫描率1-layer AuNPs沉积在电极裸金电极相比没有任何AuNPs沉积。进一步增加AuNPs层一致导致显著增加 信号,例如,对于远离火源和3 - layer AuNPs口供。更多的使用AuNPs层出现改善 信号相比,裸金电极。这是归因于AuNPs在电极表面的反应活性高,这有利于电子转移动力学。同样数量的进一步增加AuNPs层产生了更多的导电通路通过蹩脚AuNPs电子转移,这也增加了 信号。较低的电流响应观察裸金电极和1-layer AuNPs电极表示,这些电极表面的电子转移。

尽管AuNPs可以提供导电通路加速电子转移因其优异的导电性特征(12),层AuNPs超过3 - layer导致下降 信号。这可能是通过电子运输AuNPs解释说,现在被越来越多的绝缘硫醇层(11]。这进一步阻碍了氧化还原的黄金在电极表面的有机链接器层增加。C8-DT-modified黄金电极也表现出低 在扫描响应率进行了研究。黄金的减少氧化物阻碍了慢电子转移动力学通过钝化二硫酚层,充当一个障碍的界面电子转移(12]。电极与3 - layer AuNPs给最高向伏安黄金氧化还原反应,因此,它是用于酶固定在一个安培计的建设工作 在后续工作中离子生物传感器。

3.2。从扫描电镜结果

黄金的二维数组胶体是组装在表面涂以有机基团(22]。假定双官能链接器C8-DT有一个硫醇基绑定到金电极表面,离开了其他硫醇基自由与AuNPs绑定。扫描电镜研究表明,越来越多的报道AuNPs与越来越多的AuNPs层组装在金衬底。数据2(一个)和2 (b)显示1层,5层的表面形态AuNPs固定的黄金基质。

(一)”name=
(一)
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(b)
图2
扫描电子显微图的黄金基板涂上一层(a)和(b)五层AuNPs使用胶体金颗粒5海里。AuNPs主要出现在离散的点。

高覆盖率的观察AuNPs AuNPs 5层AuNPs相比之下,1层。凝聚黄金集群也观察到除了AuNPs(图2 (b)五层的涂层进行时)。它可以清楚地看到从SEM图像AuNP总量估计直径18.4±3.5海里。AuNP聚集的形成导致较小的电极表面积相比应该是由非聚合AuNPs。这就是为什么增加太多AuNPs层没有任何明显增加观察氧化还原电流对黄金AuNPs涂布在金电极超过三层。

3.3。 离子生物传感器的响应

图3说明了循环voltammograms的生物传感器 根据金离子电极改性与固定2 bme / 3 - layer AuNPs AlaDH酶。生物传感器的氧化电流增加后增加 离子积极潜力地区的0.3 - -1.0 V。这是由于electrocatalytic NADH氧化在丙酮酸酶转化丙氨酸的存在 离子的(1)[23- - - - - -26]。 Chovin et al。27)报道,NADH的氧化是不可逆转的金电极在+ 0.8 V和Ag / AgCl参比电极由于快速发生的质子化作用 氧化还原电对的。


图3
金电极的循环voltammograms修改与固定2 bme / AlaDH酶和涂上3 - layer AuNPs没有(a)和(b)存在1.6毫米离子。测量进行了丙酮酸的0.1毫米和0.2毫米NADH在pH值7 100 mV / s的扫描速率。

在目前的工作,固定的潜力+ 0.55 V和Ag / AgCl参比电极被选为工作的决心 离子反应在后续chronoamperometric测量。这是因为较低的潜力总是倾向于避免副反应可能会干扰生物传感器的响应(28]。+ 0.55 V的应用潜力和Ag / AgCl参考是受雇于Raj Behera [29日]使用4、6-diamino-2-mercaptopyrimidine-modified金电极和Behera和拉吉(30.)通过使用thiocytosine-modified黄金电极NADH氧化。

在恒电压测量,稳态测量电流的响应得到的生物传感器表现出快速反应每次添加后(在几秒钟之内) 离子,这是一个暗示好electrocatalytic AuNPs-based的行为 离子生物传感器(图4)。


图4
稳态测量电流的响应对连续增加离子在10毫米0.55 V磷酸盐缓冲剂pH值7使用黄金电极固定酶和3 - layer AuNPs修改。

的 离子生物传感器与AuNPs修改后给响应Michaelis-Menten动力学特征与一个线性响应在低 在高浓度离子浓度和饱和反应(图5)。然而,当前AuNPs-based生物传感器的反应被发现低相比,生物传感器基于黄金电极与AuNPs没有修改(图5)。这是在早些时候与实验执行协议使用减少黄金电极作为电子转移的指标,三层以上的涂料AuNPs导致贫穷的金电极上电化学。较低的反应 离子的电极修改AuNPs相比没有AuNPs可能解释为低2 bme / AlaDH酶的固定负载AuNPs的表面可能是几乎完全与C8-DT连接器连接的长碳链,从而更大的电极passivative性格导致贫穷的电子转移在酶反应。基于图6,生物传感器与AuNPs演示了一个线性响应范围修改 离子与估计0.1 - -0.5毫米0.01毫米的检出限。的生物传感器与AuNPs没有修改,没有可获得良好的线性响应范围低 离子浓度区域(从0.1 - -0.5毫米, , )。


图5
生物传感器的响应曲线有/没有涂布AuNPs对不同离子浓度范围内的pH值0.1 - -1.4毫米,7。每一个点是丹参素、原儿茶醛的0.3 - -15.3%。

图6
产生的线性响应范围2 bme / AlaDH-modified AuNPs电极离子浓度范围0.1 - -0.5毫米的pH值7。每一个点是。

Michaelis-Menten常数( )可以通过直接线性估计方法基于Lineweaver-Burk阴谋使用获得的实验数据(31日]。在这项研究中,估计 值2 bme / AlaDH-modified黄金电极的0.945毫米Lineweaver-Burk情节,无声的 值2 bme / AlaDH-modified AuNPs电极(图0.526毫米7)。减少 价值AuNPs用于修改时表明,固定酶生物传感器设计现在拥有更高的酶活性。的 价值固定2 bme / AlaDH酶也发现低于自由酶在溶液中(17.3毫米)(32]随着扩散过程被限制在固定,固定酶的亲和力 离子有很大改善。然而,没有明显的关系 与生物传感器的灵敏度值(33,34]。小 价值获得AuNPs-modified传感器提出了一个更强的酶对酶固定在AuNPs矩阵有约束力。因此,这种酶的完整性是维持更大程度上固定(35]。


图7
Lineweaver-Burk块生物传感器基于固定2 bme / AlaDH在金电极和酶生物传感器与3 - layer AuNPs修改。

AuNPs-based的对比 离子生物传感器性能与工作总结发表在表1。注意到 离子生物传感器表现出更高浓度的线性响应范围与工作报道,相比使用保利([氨基甲酰)磺酸盐(pc)水凝胶固定bienzyme GLDH GLDH酶/谷氨酸氧化酶或尼龙网。更高浓度的线性响应范围生物传感器与AuNPs建议修改固定酶的亲和力 离子增加酶饱和现在在更高的地方 浓度。类似的行为也观察到Sharina et al。34]当AuNPs固定在膜基安培计的苯酚生物传感器在AuNPs被认为吸附酶酶活性的分子而失去。因为使用AuNPs,这里的生物传感器报告还演示了更快的响应时间(< 1分钟)相比,膜基电流型生物传感器 离子。响应时间的改善可能是归因于整体更好的扩散AuNPs与聚合物相比,使用时固定矩阵。快速反应也由于更好的电子转移通过导电多层AuNPs相比,聚合物膜。
参数 本研究 Bertocchi et al。36] 关颖珊et al。37]
酶 AlaDH GLDH GLDH和谷氨酸氧化酶
固定矩阵 AuNPs 尼龙网 电脑水凝胶
线性响应范围(毫米) 0.5 - -1.3 0.01 - -0.2 0.01 - -0.30
检出限(毫米) 0.01 0.01 0.002
响应时间(分钟) < 1 - - - - - - 20.
表1
AuNPs-based之间的比较 离子生物传感器和测量电流的报道 离子生物传感器。

4所示。结论

沉积的影响的多层AuNPs通过C8-dithiols黄金表面电化学已经证明。AuNPs的存在可以改善电子转移,但太多的C8-dithiols沉积导致减少黄金电极反应由于绝缘C8-dithiols的行为。然而,AuNPs发挥了重要作用改善固定AlaDH酶亲和力 离子。更快更高浓度的线性响应范围和响应时间证明了AuNPs-modified生物传感器可以用于废水样品的分析,例如,没有进一步稀释的污水 离子浓度通常是高。

确认

作者要感谢马来西亚Kebangsaan大学(UKM)运筹学基金(UKM -牛津大学出版社-电视台- 29 - 151 - 2011)和UKM总理基金会赞助授予Tan玲玲通过UKM-Global学生移动合作项目。

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