直接基于电化学免疫传感器设计减少4 - ((4-Nitrophenyl)乙炔基)苯硫酚单层膜

文摘

的合成和表征小说N-arylhydroxylamine-based分子导线用于描述整个免疫球蛋白抗体的定点共价固定到金电极表面。羟胺的电化学原位生成的减少相应的硝基苯,广泛的解决方案条件下是稳定和反应选择性与碳水化合物从抗体结合网站允许免疫传感器的发展与最大的活动。循环伏安响应显示之间的直接关联的结构和分子导线的长度及其稳定和集中在电极表面。

1。介绍

在过去的十年中,设备能够迅速的发展,准确和可重复检测特定分析物在复杂混合物的焦点很多研究小组(1- - - - - -5]。特别感兴趣的是免疫传感器的发展能够检测低分子量(< 500道尔顿)分析物(如杀虫剂的微量4,6- - - - - -8]。这些免疫传感器设备的反应抗体(Ab)之间的相互作用的结果与其相应的抗原(Ag)。

土生等人首次报道抗体的固定在固体支持传感器应用程序19679]。这段时间以来,物理吸附和共价固定化已经进化为两个主要方法对Ab固定。这两种方法,通过nonsite直接共价连接的Ab或定点方法得到了太多的关注。与定点附件、Ab的特定区域是有针对性的10,11]。这个区域是最好远离Ag)结合位点从而可以与感兴趣的抗原。在较低的部分的球状蛋白质结构Ab,有少量的碳水化合物残留称为Fc地区(12]。免疫传感器发展碳水化合物区域变得越来越重要,为Ab表面固定策略[打开了新的途径13- - - - - -16]。碳水化合物残留的Fc地区与高碘酸盐氧化为醛(17),然后可以反应的基团共价结合Ab表面(18- - - - - -20.]。通常,胺,联氨酰肼类用于固定氧化Ab。虽然这些功能导致Ab表面的共价连接,胺的使用需要添加钠cyanoborohydride冷凝后减少席夫碱结构稳定。需要这些额外的试剂导致减少Ab-binding活动;因此,减少Ag)能被探测到的。肼和酰肼类也被用于Ab固定,但这些根形成需要苛刻的反应条件。虽然这对Ab结构没有影响,它可能导致重大挑战时试图合成新型Ab固定代理。

需要免疫传感器表面,能够直接检测Ab-Ag交互。由于缺少轻松将胺时,联氨,和酰肼类硫醇表面,本研究调查的广泛目标新的官能团,容易形成共价键的整个免疫球蛋白抗体(Ab)最终绑定到金电极表面。一般表示在这项研究中使用的分子线目标图所示1。终端羟胺功能反应与氧化碳水化合物Ab区域形成共价键,而终端硫醇在电极表面形成连结。详尽的研究数量的硫醇自组装金表面和大量的文献报道使用SAM-modified电极在免疫传感器的开发做了这个功能组一个合乎逻辑的选择(21- - - - - -24]。N-Arylhydroxylamines以前没有用于Ab固定,将是一个新的官能团的家庭通常用于Ab固定。使用N-arylhydroxylamines的优势更常用的琥珀酰亚胺酯、酰肼类的综合目的。通过减少硝基苯N-Arylhydroxylamines是最好的形成。硝基苯衍生物广泛可用的,相对便宜,稳定在一个广泛的反应条件更传统的Ab固定官能团(琥珀酰亚胺酯和酰肼类)是不相容的。

许多方法被开发出来以减少硝基苯的N-arylhydroxlamine导数(25- - - - - -32]。我们专门研究的电化学还原硝基官能团(32]。堤和科尔布表明sam 4-nitrothiolphenol (4-NTP)很容易降低,同时保持单层的完整性(33,34]。我们试图用这种方法来减少单层膜的分子导线N-arylhydroxylamines然后共价结合Ab修饰电极表面通过与醛缩合在Ab。

2。材料和方法

所有合成反应是氮气气氛下进行。所有化学品和溶剂都从奥尔德里奇购买,TCI, VWR和用作收到除非另有注明。四氢呋喃(四氢呋喃)新鲜蒸馏从Na⁰和苯甲酮。二甲基甲酰胺(DMF)在儿童和青少年卫生与发育司了₂5% (w / v)过夜,过滤,然后在真空蒸馏。新蒸馏DMF存储/ 3分子筛。从奥尔德里奇硅藻土521年购买的。色谱法是使用230 - 400执行网格二氧化硅从EMD购买科学(VWR)。薄层色谱法进行硅胶60 F_254年紫外线和碘silica-coated氧化铝盘子和可视化。

2.1。仪表

¹H NMR光谱被记录在瓦里安小型机仪器操作在400.130 MHz或瓦里安汞仪器操作在299.865 MHz。化学变化是在ppm相对于剩余质子化了的溶剂峰。¹³C NMR光谱被记录在75.408 MHz的乐器,在ppm和化学位移值报告相对于溶剂峰。循环伏安法是在CH 430仪器(CH仪器公司,德州的奥斯丁,美国)。所有分析黄金石英晶体微量天平(药物)电极(10 MHz),从国际购买水晶制造有限公司公司(部分没有。= 131215 - 10空白直径= 0.538′′= 10.000 MHz频率表面光洁度波兰电极直径= = 0.201′′电极材料= 100ÅCr - 1000Å盟安装和保税)。所有实验都是在三电极聚四氟乙烯药物细胞(CH仪器公司,德州的奥斯丁,美国)。辅助电极铂丝,参比电极是一个双结Ag / AgCl 1 M氯化钾在内室和磷酸盐缓冲剂浓度分析中使用的外室。

2.2。合成

2.2.1。(4)- (4-Nitrophenyl)乙炔基苯硫酚(2)(4-NEB)

1-Ethynyl-4-nitrobenzene(0.529克,3.598更易)4-iodo-benzenethioacetate(0.971克,3.493更易)PdCl2 (PPh3) 2(0.044克,0.048更易),崔(0.037、0.198更易)和四氢呋喃:迪亚(1:1)在50°C混合24 h。原油混合物然后集中和4 - ((4-nitrophenyl)乙炔基)苯基ethanethioate被色谱分离使用DCM (0.799 g, 75%的收益率)。1 h NMR (300 MHz, CDCl3)= 8.23 (d、2 h,J= 9.0赫兹,ArH), 7.65 (d, 2 h,J= 9.0赫兹,ArH), 7.57 (d, 2 h,J= 9.0赫兹,ArH), 7.13 (d, 2 h,J= 9.0赫兹,ArH), 2.32(年代,3 h, s (O)甲基);13 c NMR (75.4 MHz, CDCl3)= 193.5,147.4,134.5,133.6,132.6,132.5,130.0,129.5,123.9,123.8和123.4。

4 - ((4-nitrophenyl)乙炔基)苯基ethanethioate(0.045克,0.163更易)溶解在DMSO溶液添加KOH (3 M、0.326更易)。1 h反应完成后,反应混合物与盐酸酸化。DCM的提取水层,用水洗,干,集中产生黄色固体(0.036 g, 87.3%的收益率)。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)= 8.22 (d、2 h,J= 9.0赫兹,ArH), 7.65 (d, 2 h,ArH), 7.42 (d, 2 h,J= 9.0赫兹,ArH)和7.27 (d, 2 h,J= 9.0赫兹,ArH)。

2.2.2。3 - ((4-Nitrophenyl)乙炔基)噻吩(3)(3)

合成所需的乙炔1-bromo-4-nitrobenzene(2.06克,10.25更易)trimethylsilyacetylene(1.18毫升,8.349更易)和茶在室温下混合。这种混合,PdCl₂(PPh₃)₂(0.14克,0.199更易)和崔(0.01克,0.053更易)补充道。在rt反应继续搅拌4 h。这一次后,反应混合物集中和原油材料通过柱色谱法纯化使用DCM给三甲基((4-nitrophenyl)乙炔基)硅烷(2.237 g, 99.6%的收益率)。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)(d, 2 h,ArH), 7.64 (d, 2 h,ArH)和0.174 (s 9 h (CH₃)₃- c)。

((4-nitrophenyl)乙炔基)三甲基硅烷(2.237克,10.2更易)和K₂有限公司₃(0.085克,0.611更易)添加甲醇(43毫升)和反应是搅拌2 h rt。由此产生的混合物是集中在室温和由此产生的残渣溶解在CH₂Cl₂(40毫升)。有机层与饱和NaHCO洗₃()和水()。干燥结束后MgSO₄集中一个黑色固体。粗糙的材料是硅胶纯化使用CH₂Cl₂给1-ethynyl-4-nitrobenzene作为橙色固体(1.246 g, 83%的收益率)。¹H NMR (300 MHz, Acetone-d₆)(d, 2 h,ArH), 7.63 (d, 2 h,ArH), 3.35 (s 1 h·hc·≡C);¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃)2、129.1、123.8、82.5和81.8。

3-iodothiophene的混合物(0.207克,0.984更易),PdCl₂(PPh₃)₂(0.014克,0.019更易),崔(0.004克,0.019更易),1-ethynyl-4-nitrobenzene(0.145克,0.984更易)添加了四氢呋喃。DIA是添加到上述混合和反应在rt,由此产生的混合物搅拌过夜都集中在使用CH减压和柱层析法纯化₂Cl₂给3作为一个黄色固体。(0.199克,88.3%的收益率)。¹H NMR (300 MHz, Acetone-d₆)(d, 2 h,赫兹,ArH), 7.89 (dd, 1 h,1.2赫兹,HC = CH-S), 7.80 (d, 2 h,ArH), 7.61 (dd, 1 h,= CH-S), 7.30 (dd, 1 h,1.2赫兹,= CH-S);¹³C NMR (75.4 MHz, DMSO-d₆),141.3,140.5,140.2,137.2,134.3,131.6,100.2和97.4。

2.3。电极制备的协议

电极首次蘸水虎鱼的解决方案(3:2 H₂所以₄:H₂O₂为60秒。水虎鱼后把电极与18 MΩ冲洗去离子的Milli-Q水和用(Milli-Q)和乙醇每15分钟。电极清洗在紫外线室60分钟,用水冲洗(Milli-Q)和乙醇,然后用超纯氮气吹干。电极是电化学清洗使用循环伏安法(0到−950 mV与Ag / AgCl 1 M氯化钾)在10毫米H₂所以₄解决方案,用水冲洗和超纯氮气吹干。4-NTP的50 mM的解决方案后二氯甲烷(DCM)放置在金电极24小时允许单层的形成。在的情况下3,单层的形成被允许进行72小时。电极与DCM和己烷清洗。后这个电极浸在0.1钠磷酸盐缓冲溶液pH值7。使用标准三电极循环伏安法进行了设计,在山姆修饰电极作为工作电极。参比电极是一个商业购买Ag / AgCl在1 M氯化钾和商业铂丝电极是用作辅机。

3所示。结果与讨论

尽管电极的电化学还原改性的山姆4-NTP已经由其他人(33,34),对于这个应用程序有两个关键问题需要回答:(a)的最大浓度羟胺可以产生表面和(b)可以长期稳定的新鲜羟胺形成单层得到改善?羟胺的稳定性随时间是很重要的,因为先前的文献表明,Ab的冷凝预计将至少8小时(35]。在科尔布的报告指出,pH值降低媒体影响了最大电流响应(可与羟胺浓度在表面),观察。然而,没有评论关于提高羟胺(长期稳定的34]。堤的报道,另一方面,它是说,可以看到清晰的氧化还原反应对重复周期如果仔细选择潜在的限制(33]。然而,在这些报告减少在酸性条件下进行。这些条件被科尔布指出降低最大观测电流响应(34]。

为了回答这些提到的问题,简历实验结果如图2和3。在这两个数字,一个新鲜4-NTP修饰电极制备和潜在准备−400 mV 15分钟。这有助于减少4-NTP羟胺。其次是简历扫描之间的潜在限制−400和0 mV。信号中观察到这种潜在的窗口是由于氧化羟胺的相应的亚硝基的羟胺化合物rereduction紧随其后。图2显示的时间依赖性羟胺/亚硝基的还原。跟踪显示当前反应后的氧化还原电对的电极准备在−−之间400 mV 15分钟然后扫描400和0 mV。在完成每个简历电极repoised−400 mV第二个15分钟的间隔,然后扫描−400和0之间mV。这个过程在6小时内重复每15分钟给碳氢键痕迹。

希望目前的反应会增加高原和保持不变的重复周期一旦羟胺的最大浓度得到的表面。但是,与Tsutumi的报告,目前的反应只会增加在第一个30分钟,然后迅速衰退。为了更好地理解是什么发生,第二个实验进行,减少潜在的应用只有30分钟(时间以最大电流响应)和电极扫描然后被允许回到开路的潜力。

CVs是每15分钟5.5 h段在最初的扫描。应该注意的是,400年−减少潜在的mV只是应用于这个实验的开始(即。电极不举行这种潜在的每个额外的扫描之前)。图3显示了简历扫描。它也表明,在缺乏一个潜在应用当前快速下降之前,每个额外的扫描。本系列结束时的简历,减少潜在的(−400 mV)是申请30分钟(跟踪F)。这里获得当前反应也大大低于原来的痕迹,这强烈点,一个不可逆过程发生在表面。我们设想的三种可能的解释观察到的减少电流响应。第一个是单层的完整和不可逆转的还原胺。第二个是解吸的单层电极,和第三个交叉耦合的亚硝基的中间与邻羟胺产生不必要的azoxy化合物。这是令人感到意外,因为作为羟胺和亚硝基的中间体之间的交叉耦合预计将发生在微碱性条件下()。两个因素可能会允许这个反应在我们的实验条件:(1)羟胺和亚硝基的化合物中间体的近表面,(2)硫的电子捐赠能力预计将增加羟胺的反应让它与相邻亚硝基反应快得多。

简历实验使用4-NTP地空导弹可能表明,检查实验条件下羟胺一旦形成是不稳定和不适合Ab固定。被认为通过改变起始硝基衍生物的结构,生成的羟胺长期稳定的单分子层可以改善。为了测试这个理论,层的4 - ((4-nitrophenyl)乙炔基)苯硫酚2 (4-NEB)和3 - ((4-nitrophenyl)乙炔基)噻吩3 (3)准备以同样的方式作为4-NTP单层膜。的积极影响预期结构的变化(1)增加抵抗解吸的扩展长度(36,37),(2)减少羟胺的亲核性给予更大的距离捐赠硫羟胺。羟胺的亲核性下降应该限制表面由于交叉耦合衰减。的电化学减少4-NEB和3 sam在相同条件下进行了4-NTP单层膜。在这些条件下的3单层没有任何当前响应时减少潜在(400−mV)申请了30分钟。平衡的电极更负电位(450 mV和500 mV−−)没有产生可测量的电流响应。后来断定−400 mV的减少潜力足以引起100% 3单层的解吸。

4-NEB山姆,然而,4-NTP单层膜表现出类似的氧化还原行为。羟胺和亚硝基的中间体之间的氧化还原循环的4-NEB萨姆是由应用减少潜在−400 mV 30分钟。不同于4-NTP单层膜,然而,还原电位(−400 mV) 4-NEB修饰电极可以申请2 h之前减少当前的反应是观察(图4)。这指出增加电流响应在更长一段时间可以表明羟胺单层的稳定性增加。峰分离实验过程中从一个初始值会增加10 mV 16 mV,这可能表明,一些单层是要除去的表面。相比峰值分离被堤等。33]20 mV的4-NTP单层我们不相信大量解吸是发生。

从这些实验也指出阳极电流响应−转移69 mV与阳极电流响应减少4-NTP−100 mV。这表明,羟胺的再氧化膜产生2更为困难。一个可能的解释是扩展的距离从电极表面的氧化还原活性物种;也就是说,比4-NEB 4-NTP更短。这个长度变化预计将影响整个电子转移必须移动的距离和从电极表面从而增加困难reoxidizing单层。

虽然4-NEB层显示增加当前响应随着更长时间的4-NTP单层膜相比,数字5表明,羟胺长期稳定的单层仍不满意。应用潜力减少2 h后(最大电流形成的时间注意到),电极被允许回到开路电位和简历扫描拍摄每30分钟6 h。图5表明,在这六个小时期间,减少当前的反应只是观察到在前90分钟。在比较与先前的实验使用4-NTP层通过扩展的距离从表面氧化还原活性官能团,损失的不可逆过程,在当前响应慢。尽管4-NEB层有一个宽容减少潜在的增加,电流响应的重大损失,开路电位表明额外的优化促进所需的表面固定的Ab这些表面通过与羟胺反应。

4所示。结论

可以采取一些策略使N-arylhydroxylamine官能团对Ab的固定到电极表面有用。第一个策略将合成bis(苯)乙炔基衍生品应进一步增加时,减少潜在的可以应用。这个系统也将有助于最小化任何激活影响捐赠的硫进一步减少不必要的交叉耦合。第二个战略,以帮助减少当前的损失由于交叉耦合反应是使用混合单层(38]。通过使用单层混合方法,活性中间体之间的间距器可以放置防止直接接触。最后,减少电极表面生成羟胺也可以进行氧化Ab的存在为了生成羟胺的反应。

总之,一些新颖的分子wire-based材料合成使用Sonogashira反应作为一个关键步骤。的电化学还原4-nitrothiophenol和4 - ((4-nitrophenyl)乙炔基)苯硫酚层相应的羟胺是完成。电化学还原4 - ((4-nitrophenyl)乙炔基)苯硫酚已经表明,通过改变结构的硝基苯出发,增加表面羟胺的浓度。

确认

这项工作是财务支持的托马斯和凯特·杰弗里斯基金会和弗吉尼亚联邦大学化学系。作者还要感谢博士弗雷德Hawkridge使用他的设备和实验室空间。

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