河豚毒素检测的表面等离子体共振传感器河豚矩阵和尿液

文摘

河豚毒素(TTX)中毒最常见的食用河豚。TTX是一种低分子量(~ 319 Da)神经毒素,选择性地阻断电压特异性Na⁺封闭的离子通道。标准方法接受全球监测TTX中毒食品矩阵鼠标生物测定。伦理问题从活体动物测试,样品处理量低,和分析不准确导致了另一种方法的必要性。我们以前建立的表面等离子体共振(SPR)传感器可以量化TTX水缓冲由基于抗体的抑制试验样品。在本文中,我们报告的扩展试验在临床检测TTX -和food-relevant矩阵。试验优化了应用程序三个相关复杂的矩阵:河豚肝脏提取,河豚的肌肉提取物,和人类的尿液。讨论了基体效应和校准曲线。自然污染河豚肝脏和肌肉中提取分析SPR的方法,和数据相比,液相色谱电喷雾多反应监测质谱(LC / ESI / MRM / MS)数据。十个样品,包括三个从中毒事件中,两个控制安康鱼样本,和五个有毒的河豚样本,分析了使用这种方法,和数据比较LC / ESI / MRM / MS分析的样本。

1。介绍

河豚毒素(TTX)中毒最常见的食用河豚。TTX是一种低分子量(~ 319 Da)神经毒素,被发现在一些动物物种包括河豚、蝾螈、蟾蜍、章鱼、箭头蠕虫,xanthid蟹(1]。几个类似的基地分子也被确认,所有这些表现出选择性的阻断电压特异性Na的毒性作用⁺封闭的离子通道(2]。TTX中毒的症状表现在人类口周的麻木和感觉异常,远端肢体麻木和感觉异常,共济失调,头晕,肌肉无力。重症呼吸道肌肉瘫痪、昏迷、低血压和心律失常发生致命的后果3]。哺乳动物的致命剂量的TTX导致50%的一组实验动物死亡(LD₅₀)2 - 10μ克/公斤静脉注射和10 - 14μ皮下注射(克/公斤4]。

最常见的来源是日本河豚(TTX中毒Takifuguspp。)优先积累在高浓度TTX皮肤、肝脏、卵巢,肠子5]。然而,肌肉也可以包含致死浓度(6]。肌肉在日本经常消费作为一种美食,需要从培训和授权的个人特殊处理3]。近年来,几个TTX中毒病例发生在美国和墨西哥的消费河豚从大西洋,墨西哥湾,加利福尼亚湾(7]。

中毒事件,诊断的疑似(即来源。餐遗迹)通常是不能用于分析。因此,有必要也可以分析临床样本收集的病人。两个独立的研究已经出版,报告TTX浓度在病人的尿液和血液中毒事件使用chromatography-based方法(8,9]。Kawatsu等人的研究量化TTX尿液中immunoaffinity色谱和高效液相色谱法(HPLC)在12个样本6中毒病人收集了从1989年到1996年。他们报道TTX在尿液的浓度范围从6到100 ng / mL,需要100毫升的样品体积分析(8]。在另一项研究中,Tsia等人量化TTX尿液和血液中由液体色谱-光谱法(质)从六个有毒的渔民。TTX血液的浓度范围从1.4到13 ng / mL,从15到110 ng / mL尿液。样本收集了大约10小时后摄入的有毒的鱼和一个病人吃了有毒的鱼后不久就去世了。病人死亡水平TTX 104 ng / mL的尿液和血液13 ng / mL。研究表明TTX在尿液的浓度大大高于血10小时后摄入表明TTX很容易代谢和排泄尿液(9]。因此,尿液是更可取的临床测试矩阵TTX中毒。

确定的标准方法接受全球TTX中毒食品矩阵是鼠标生物测定10]。从活的动物实验伦理问题11)和和劳动力成本,低样品处理量,分析不准确与方差从活的动物和样本矩阵12)导致了另一种方法需要鼠标生物测定。生物方法等确定TTX中毒受体结合分析(13[],细胞毒性测试14),电生理检测(15已经证明了。同时,高效液相色谱和质谱等分析方法可以识别和量化TTX及其自然产生的副产品(16,17]。免疫学方法,如酶联immunosorbant试验(ELISA),近年来成为流行,因为他们是便宜,敏感和选择性。量化的inhibition-type ELISA之前已经报道过TTX使用商用抗体(5,18,19]。同时,我们之前报道了抑制免疫测定的量化TTX使用表面等离子体共振(SPR)传感器20.]。SPR传感器可以执行更快的检测具有很高的敏感性和特异性。SPR传感器的优势相比其他生物传感器技术的能力提供label-free直接和连续监测和实时检测生物分子相互作用的21,22]。在我们之前的研究中,他开发了一个表面,特别是绑定TTX抗体和抵制非特异性吸附的特异性的抗体和牛血清蛋白(BSA) [20.]。优化的抑制试验证明~ 0.3 ng / mL的检测极限缓冲区,和生物芯片可重复再生至少10个样本检测周期。

在这项工作中,我们报告的扩展inhibition-based免疫测定TTX SPR传感器检测的临床和食品相关的矩阵。试验优化了应用程序三个复杂的矩阵:河豚肝脏,肌肉提取物,和人类的尿液。每一个独特的矩阵的影响分析和讨论了表面。校准曲线基于样本飙升TTX标准提出了为每一个矩阵。样品自然污染河豚的肝脏和肌肉中提取SPR方法进行了分析和比较,分析液相色谱电喷雾多反应监测质谱(LC / ESI / MRM / MS)。十个样品,包括三个从中毒事件中,两个控制安康鱼样本,和五个有毒的河豚样本也分析和比较LC / ESI / MRM / MS的分析样本。

2。材料和方法

2.1。材料

TTX是由制药有限公司(日本东京)。兔单克隆抗体对河豚毒素(anti-TTX)从夏威夷购买生物技术,Inc . (Aiea,嗨,美国)5]。冻干人尿,牛血清蛋白(BSA),磷酸缓冲盐(PBS) (0.01 M磷酸,0.138 M氯化钠,氯化钾0.0027米,pH值7.3),醋酸钠、盐酸、乙酸、氢氧化钠和氯化钠从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。端羟基oligo-ethylene乙二醇(OEG) -alkanethiol (HS - (CH₂)₁₁- (O (CH₂)₂)₄-哦)和amine-terminated OEG-alkanethiol (HS - (CH₂)₁₁- (O (CH₂)₂)₆NH₂)从ProChimia购买(波兰格但斯克)。甲醛(37%)购买从j.t贝克(Phillipsburg,新泽西,美国)。自然污染河豚的肌肉和肝脏中提取以及样品收集在有毒的河豚爆发情况下提供的食品及药物管理局的食品安全和应用营养中心(CFSAN)。

2.2。基于抗体的抑制试验量化TTX的SPR传感器

在这项研究中使用的方法和仪器在以前的出版物,详细介绍了开发一个基于抗体的抑制试验检测TTX的SPR传感器(20.]。SPR传感器用于这项工作是一个定制的工具基于Kretschmann几何衰减全反射(ATR)的方法和波长审讯。SPR传感器,1纳米SPR在750 nm - 751 nm波长位移代表一个表面的报道~ 161 pg /毫米²为蛋白质。展示特定绑定的SPR生物芯片anti-TTX和抗蛋白质污染被涂上一层自组装单层(SAM)组成的胺终止OEG alkanethiol和羟基终止OEG alkanethiol。TTX分子共价链接到胺暴露终端组在混合山姆表面的取向有利于anti-TTX绑定。胺比羟基终止OEG alkanethiols和TTX化学以前最大化优化特定anti-TTX绑定,同时最小化非特异性蛋白质绑定。一个抑制试验SPR传感器的使用和功能定量检测TTX SPR生物芯片。抑制试验是由混合固定浓度的anti-TTX样本包含未知TTX浓度或已知的校准曲线的确定标准。在潜伏期,TTX在示例将绑定到anti-TTX抗体结合部位,减少与antigen-free抗体结合位点的数量。样本然后流入SPR生物芯片,和SPR传感器检测到的量antigen-free anti-TTX结合到表面。SPR传感器的反应直接相关的antigen-free anti-TTX在示例,因此逆相关TTX的数量。因此最大传感器响应对应于零TTX样本,和一个零传感器响应对应于总抑制anti-TTX绑定,因此集中TTX以外的量化方法的范围。 Calibration curves for each detection matrix were calculated by normalizing the response from standards containing 10 pg/mL to 10 μ与固定浓度的g / mL TTX孵化anti-TTX的最大响应anti-TTX在同一浓度。矩阵对anti-TTX绑定的影响考虑在内,每个矩阵和适当的标准是本文中讨论。规范化数据的单位是百分比抑制,这是指总反应的百分比除以最大响应从抗体。检出限和检测范围通常表示为抑制百分比浓度,指抑制分子的浓度(TTX)需要降低一定比例的最大响应。对于工作,检出限为20%抑制浓度(IC_20.)和可量化的范围是集成电路_20.80%抑制浓度(IC_80年)。

2.3。河豚组织提取方法

整个器官(如果< 5 g)或5 g次级样本的均质提取组织两次10毫升的甲醇1%的醋酸。使用电动组织样本均质均质器(Polytron PT 10 - 35 12毫米发生器,Kinematica AG)、瑞士),离心机,结合上层清液集中在真空下< 1毫升。样本重新溶解在5毫升的1% (v / v)乙酸在高效液相色谱法(HPLC)级水,然后用氯仿脱脂。要做到这一点,5毫升氯仿的添加到样本,涡混合,然后由离心分离。顶部水层得救了,5毫升的额外的酸化水添加到低氯仿层,并重复过程。浮在表面的结合给一个提取相当于0.5 g组织/ mL。据陈和周23提供> 90%),该方法提取效率。在之前的实验中,我们上升均质河豚鱼肌肉(),肝脏()和磷酸缓冲盐()与10μg / mL TTX,取得了平均%恢复(数据未显示)。

2.4。分析样品的LC / ESI / MRM / MS

最初的毒素分离进行根据Negri et al。24]。一个整除的提取使用0.22 -过滤μm醋酸纤维素注射器过滤器,调整后的最终浓度25%的乙腈,10μl注入一个安捷伦1100液相色谱系统装备有250毫米×2毫米内径列挤满了5 -μm TosoHaas TSK-GEL酰胺- 80材料。毒素被筛选了0.3毫升·分钟⁻¹乙腈:高效液相色谱级水(70:30,v / v) 5毫米甲酸铵和26.5毫米甲酸。质谱进行了API5000(应用生物系统公司/ MDS Sciex弗雷明汉,MA)配有turbospray电离源和在正离子模式下操作。以下仪器参数使用:源温度、300°C;窗帘气体(坏蛋),45 l N2 /人力资源;喷雾器气体(GS1), 40 l N²/人力资源;涡轮气体加热器(GS2), 35 l N²/人力资源;喷涂电压3200 V。多反应监测(MRM),母公司离子为每个毒素是支离破碎的外观和监控特定片段的特征化合物,用于测量的毒素。MRM数据采集方法分为两个时期,监控三个碎片频道(MRM)。这三个反应监测对TTX分解的质子化了的TTX分子[M + H]⁺在m / z320年离子碎裂m / z302、256和162。类似的方法被成功地用于量化TTX Shoji et al。17]。停留时间为每个反应是200 msec和入口潜力(EP) 10 V。Declustering潜在(DP)、碰撞能量(CE)和出口潜力(级)独立优化为每个反应使用分析软件(v 1.4.2)(应用生物系统公司/ MDS Sciex弗雷明汉,MA)。TTX是量化的线性回归和三个碎片离子,使用下列标准浓度:1、10、100、1000和10000 ng / mL TTX。标准被稀释1%水乙酸乙腈为25%。

3所示。结果与讨论

3.1。分析开发复杂的媒体

端羟基OEG-alkanethiol和amine-terminated OEG-alkanethiol组件混合山姆含有乙二醇的单位,已证明能减少非特异性结合的蛋白质(25]。虽然已经取得了显著的进展在创建传感器表面抗蛋白质吸附,仍然很难产生表面完全抵制吸附于现实世界的复杂的媒体(26]。等nonfouling表面平台研究了聚(乙二醇)(挂钩)基础(27,28)或两性离子材料(29日,30.]。TTX固定化传感表面曾被证明是nonfouling 1毫克/毫升BSA和10μg / mL anti-hCG,使用标准的PBS缓冲溶液pH值7.4。使用前面建立了测定条件传感表面从复杂的媒体包括尿液检测非特异性结合,河豚肝脏提取,河豚的肌肉中提取。样本矩阵表现出最小的非特异性结合。

在200年复杂的矩阵,检测μg / mL BSA被加入到试验运行缓冲和样品稀释剂。BSA经常添加到免疫测定运行缓冲,以减少非特异性结合和保护其生物活性蛋白质构象储备。然而,当尿液样本稀释使用200年μg / mL BSA在PBS pH值7.4,10%的尿液样本产生一个不寻常的响应(图1),基线不restabilize至少20分钟后注入。注入只有10%或BSA在PBS尿液pH值7.4产生阶跃响应相应的批量折射率变化。同时,河豚的肝脏和肌肉中提取10%,稀释使用200年μg / mL BSA在PBS,产生反应类似于只有样品稀释的反应缓冲区。测试PBS河豚提取物稀释10%的pH值显示的最后pH稀释样品实际上是~ 4 - 5。河豚提取v / v醋酸,1%用于TTX脱离组织,为TTX分子提供了稳定的pH值存储在提取。在进一步测试,历史进程的响应从尿液样本飙升TTX和稀释BSA被发现与运行缓冲液的pH值有关。改变从PBS缓冲pH值7.4醋酸钠(SA)缓冲区在pH值4.5取消造成的历史反应结合TTX表面固定化,BSA和尿液(图2 (c))。猜测TTX会将强与蛋白质在中性pH值,因为强烈的电荷与胍盐组相关联的。众所周知,为了从组织中提取TTX,它需要解决方案在低小灵通(23]。最后修改运行缓冲增加缓冲能力,自10%河豚提取样本以外的PBS缓冲容量。PBS是10毫米缓冲组件,所以缓冲浓度增加到100毫米,以有足够的缓冲能力10%河豚提取样品。优化运行缓冲对于复杂的媒体是100毫米SA 4.5 pH值的缓冲区50 mM氯化钠和200年μg / mL BSA (SAB)。优化试验条件复杂的媒体导致表面,保持nonfouling 10%, 1%和0.1%每个矩阵(图的解决方案2)。因此,测定条件适合直接检测的抗体绑定TTX-immobilized传感表面。在10分钟左右,25分钟的反应是散装折射率变化引起的折射率的差异正在运行的缓冲和稀释复杂的媒体。

3.2。在100毫米醋酸钠缓冲检测TTX pH值4.5

改变pH值对校准曲线最重要的影响,因为antibody-antigen绑定依赖博士通常抗体反应在小灵通接近生理上的pH值最高的7.4解决方案和活动在更高或更低的pH值较低,然而,固定的抗体蛋白质表面会影响最优活动。对于anti-TTX, 2的总体响应μg / mL anti-TTX在PBS pH值7.4 ~ 7.5 nm和SA缓冲pH值在4.5 ~ 1.6 nm的SPR波长位移。anti-TTX的反应低pH值足够的抗体抑制试验。然而,较低的抗体反应会影响校准曲线。图3(一个)显示平均归一化SPR sensorgrams对应于不同浓度的检测在SAB TTX。图4显示了规范化的波长偏移的校正曲线和TTX集中样本误差。从图中所示的数据4,集成电路_80年,集成电路₅₀,集成电路_20.与2样品孵化μg / mL anti-TTX 226 ng / mL, 38 ng / mL,分别和10 ng / mL。因此,检出限与IC_20.10 ng / mL。的集成电路_80年,集成电路₅₀和集成电路_20.在磷酸缓冲盐检测TTX (PBS) pH值7.4和2μg / mL anti-TTX 74、13和2 ng / mL (20.]。的集成电路_80年,集成电路₅₀,集成电路_20.检测在PBS pH值7.4和1μ50 g / mL anti-TTX 6 0.3 ng / mL的最大响应1μ3.74 g / mL anti-TTX参考在PBS纳米(20.]。在前面的工作中,一个1的抑制试验μg / mL anti-TTX提供了检出限约一个数量级比2μ克/毫升anti-TTX。复杂的矩阵运行的优化分析pH值4.5。因此,更高浓度的抗体被选中,是因为降低抗体反应由于antibody-antigen绑定对pH值的依赖。

3.3。检测TTX在复杂的媒体

图3显示了平均归一化SPR sensorgrams对应于不同浓度的检测TTX缓冲和复杂的媒体。每个复杂的媒体,数据归一化的反应2μ在SAB g / mL anti-TTX。而重要的是要确定校准曲线独特复杂的矩阵,同样重要的是可再生的标准规范化的数据。一个独特的检测矩阵,它不可能有一个无毒的样本,因此规范化数据缓冲区标准是必要的。在数据3 (b),3 (c),3 (d)实质性响应sensorgrams显示,10分钟到25分钟,不对应的抗体反应。这种反应是一个庞大的折射率变化引起的折射率的变化相比,10%的样本运行缓冲。大部分折射率变化没有残余影响传感表面抗体绑定。在数据3 (b),3 (c),3 (d)有一个sensorgram不展览大部分折射率响应对应于10%的样本矩阵,这些sensorgrams抗体引用在缓冲区中没有复杂的矩阵。

图4校准曲线显示标准化的波长偏移和TTX集中在缓冲区,复杂的媒体。的集成电路_80年,集成电路₅₀,集成电路_20.应该对应的归一化值0.2,0.5,和0.8,分别。从图中所示的数据4,集成电路_80年,集成电路₅₀,集成电路_20.河豚的肝脏提取样本孵化2 10%μg / mL anti-TTX 95 ng / mL, 22 ng / mL,分别和1 ng / mL。所以检测极限对应的集成电路_20.1 ng / mL。的集成电路_80年,集成电路₅₀,集成电路_20.河豚的肌肉提取样本孵化2 10%μg / mL anti-TTX 200 ng / mL, 32 ng / mL,分别和6 ng / mL。所以检测极限对应的集成电路_20.6 ng / mL。的集成电路_80年,集成电路₅₀和集成电路_20.尿样孵化2 10%μg / mL anti-TTX 640 ng / mL, 53 ng / mL,分别和17 ng / mL。因此,检出限与IC_20.17 ng / mL。

在10%的尿液矩阵,较高的抗体反应被认为导致校准曲线上面转移的归一化值(最大参考抗体反应),当检测抗体反应在缓冲区引用。图2 (c)显示没有明显的非特异性结合10%尿液矩阵。同时,10%在SAB不会引起尿液pH值偏离缓冲pH值为4.5。但如图5(一个),2μg / mL anti-TTX反应SAB尿液稀释10%为1.75纳米,而反应10%水在同一个缓冲区是1.38。如果校准曲线归一化anti-TTX参考以10%的尿液(图5 (b)),校准曲线规范与最大接近1和对应的检测曲线SAB;然而,校准曲线归一化参考抗体在10%水有大约25%更高的最大响应。从图中所示的数据5 (b),集成电路_80年,集成电路₅₀和集成电路_20.与2样品孵化μg / mL anti-TTX和规范化与10%尿液被引用263 ng / mL, 27 ng / mL,和3 /毫升,分别比640 ng / mL, 53 ng / mL,和17 ng / mL,分别对相同数据的归一化在SAB抗体参考。然而,对于数据归一化抗体在SAB参考,最大~ 1.2而不是1,所以IC_80年,集成电路₅₀,集成电路_20.应该对应于一个值为0.24、0.6和0.96,而不是0.2,0.5和0.8。如果值重新计算使用的实际最大1.2而不是1,然后数据引用的值是一样的尿液抗体在10%。因为它可能很难获得无毒样品,参考抗体需要以一个标准系统(缓冲)。然而,它是必要的,以确定从校准曲线为一个特定的量化矩阵与校准曲线的标准检测缓冲区。检测TTX的尿,尿矩阵影响抗体反应和需要确定集成电路_80年,集成电路₅₀,集成电路_20.从实际的最大和最小值,而不是使用1和0作为最大和最小值。

3.4。河鲀自然污染样品的分析

两河鲀自然污染样品提取制备和分析了LC / ESI / MRM /女士在美国FDA CFSAN和被抑制试验分析了SPR传感器在华盛顿大学的实验室。样本准备从肝脏和肌肉的同一物种自然有毒(TTX)河豚。河豚通常更高浓度的积累比肌肉(TTX在肝脏1];然而,肌肉经常消费的食物。TTX相关浓度的样品可以远远高于可量化的发达地区TTX测定,样品是运行在三个稀释因素(10%、1%和0.1%)。通过测试三个稀释的样本,化验可以涵盖3到4个数量级TTX的浓度。图6(一)显示了SPR响应为10%,1%,0.1%自然污染河豚肝,和相应的校准曲线的检测河豚肝脏。河豚的肝脏的0.1%稀释下降之间的集成电路的检测_20.和集成电路_80年(可量化的范围)。分析表明,样品的浓度是25 ng / mL±8 ng / mL,相对应的浓度稀释样品25μg / mL±8μ克/毫升。这个示例的萃取稀释系数2.04,所以2.04毫升的提取相当于1 g的组织;因此,检测到的值是5100μg TTX / 100 g的组织。这个值与对应这个样本的值由LC / ESI / MRM /女士,也就是4803μ克/ 100克的组织。另一种稀释抑制反应超过了80%。因此,浓度太高,难以准确量化。图6 (b)显示了SPR响应为10%,1%和0.1%自然污染河豚的肌肉和相应的校准曲线检测TTX河豚的肌肉。河豚的肌肉的稀释1%下降之间的集成电路的检测_20.和集成电路_80年。样品的浓度是63 ng / mL±14 /毫升,这对应于一个6.3浓度稀释的样本μg / mL±1.4μ克/毫升。这个示例的萃取稀释系数2.14,所以2.14毫升的提取从1 g的组织;因此,检测到的值为1285μ克/ 100克的组织。这个值大约是两倍这个样本的值由LC / ESI / MRM /女士,也就是582μ克/ 100克的组织。10%稀释反应抑制80%以上和0.1%的稀释反应有抑制不到20%,所以浓度可量化的范围之外的。

3.5。中毒事件的分析样品的SPR传感器并与LC / ESI / MRM / MS

鱼肌肉组织的十个样本提取SPR传感器在实验室化验分析的华盛顿大学和LC / ESI / MRM /女士在美国FDA CFSAN实验室。这些样本收集的河豚鱼中毒(PFP)的爆发发生在2007年。样本运行在10%,1%和0.1%稀释为了确保稀释会下跌的量化范围内的校准曲线。毒素的浓度是由来自antibody-sample正常化绑定响应计算混合物的反应只有抗体在缓冲区。然后标准化信号适合的量化范围中收集的校准曲线河豚的肌肉中提取。结果量化TTX的SPR传感器测定相比,量化的LC / ESI / MRM /女士如表所示1。通过测试三个样本稀释,这些测试的检测范围从0.1到200μg / mL或假设的萃取稀释因子2,20到40000人μ克/ 100克的组织。如果归一化反应是大于IC_20.10%的样本稀释,然后TTX在样本的浓度小于0.1μg / mL,特征表1“< LOD。“假设一个萃取稀释2倍,那么样品少于20μ克/ 100克的组织。这个矩阵和抗体浓度的检测极限20μg TTX / 100 g的组织是与鼠标生物测定的检出限为0.2μ40 g / mL或μg TTX / 100 g (31日]。虽然没有行动水平TTX由美国食品及药物管理局提供的操作水平贝类毒素(STX),负责麻痹性贝类中毒和类似的药理和药效TTX [32),是80μ克/ 100克的组织,可用于比较。SPR传感器的数据分析与量化由LC / ESI / MRM /女士平均在29% ~ 10%稀释样品,样品稀释1% ~ 57%。除了一个示例提供了一个可检测浓度TTX, SPR方法预测浓度低于由LC / ESI / MRM / MS。量化了样本与样本稀释10%和1%,10%的样品总是预测浓度高于平均样本1% ~ 23%。较低的预测值为1%的样品相比,10%的可能是由于样品基体效应,因为样本量化的1%相比,产生的校准曲线从10%在SAB河豚的肝脏。浓度最高的两个样品TTX,“生河豚3”和“4,布莱恩生”值10%以下IC的稀释_80年,但仍高于IC_90年,预计值从这个数据仍然对应的值从1%稀释和有良好的预测价值。

4所示。结论

优化试验成功用于检测TTX自然污染样本河鲀河豚肝脏和肌肉。数据通信和TTX在样品的浓度由LC / ESI / MRM / MS,展示的能力TTX抑制试验的SPR传感器检测和量化TTX实际样品。

TTX复杂的矩阵的检测人类尿液,河豚肝脏提取,河豚的肌肉提取所需的优化运行缓冲。这些复杂的媒体优化缓冲条件被确定为100毫米醋酸钠缓冲在pH值4.5 50 mM氯化钠和200年μ克/毫升BSA。改变试验的pH值从7.4到4.5导致整个抗体反应降低7.5 ~ ~ 1.6 nm的SPR波长偏移2μ克/毫升anti-TTX。河豚的肝脏的校正曲线提取和河豚的肌肉中提取对应的校准曲线的检测缓冲区。然而,尿液的校准曲线归一化抗体反应在最大响应缓冲~ 25%高于缓冲区的校准曲线。如果尿液中检测的校准曲线归一化的抗体反应10%尿液的校准曲线非常符合检测的缓冲区。控制实验表明,在没有明显的非特异性反应的任何复杂的媒体使用优化分析缓冲区,和10%尿样的pH值是一样的缓冲区。因此,较高的抗体反应是由于尿液矩阵,从而导致校准曲线进行数据归一化转向参考抗体在缓冲区。优化抑制免疫分析法检测TTX在复杂矩阵使用了SPR传感器与相关分析LC / ESI / MRM / MS。发达的方法提供了一个健壮且可以再生试验TTX敏感和定量检测的复杂的矩阵。

确认

作者感谢贝琪牦牛她评论和修改本文之前提交。这个项目是由美国农业部合作国家的国家研究计划研究、教育和推广服务,批准号2005-35201-16321和美国食品和药物管理局批准号HHSF223200610011。艾伦·d·泰勒是部分支持的英特尔基金会博士奖学金奖和凯撒铝华盛顿大学的奖学金奖。

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