相机手机局部表面等离子体若平台向低成本Label-Free诊断测试

文摘

发展努力照相手机诊断平台应用局部表面等离子体共振(LSPR) label-free传感。球形金纳米颗粒和纳米棒的应用被认为是对易于应用和评估,敏感性,为传感器的检测和实用性CCL2(趋化因子配体2)。平台的敏感性与商业UV / Vis光谱仪。照相手机平台的敏感性是30%低于商业系统的一个等价的培养时间,但商业系统的方法,随着培养时间的增加。这表明LSPR传感的应用在便携式照相手机设备可能是一个医疗点作为低成本高效label-free方法诊断检测工具专用设备的环境中是不可用的。

1。介绍

诊断检测艾滋病医疗行业的决策过程。这包括决定是否治疗一个病人当生物标志物浓度达到一个阈值(1病人管理,细化对特定的治疗,和方法,选择最合适的治疗病人。1970周围的参数的诊断测试相关的成本与效益的理解,作为测试的相对较高的成本和缺乏知识的初级医生导致过度测试新的测试之前被正确评估(2]。在接下来的几十年测试管理和坚持的基本标准,被考虑特异性评估与测试,精度,灵敏度,和社会价值3,4]。每个测试的核心标准成本仍然是然而,和进一步发展低成本的测量是一个引人注目的研究领域。基因革命和“使”科学的兴起导致新的疾病生物标志物的发现和发展,导致对新诊断测试的需求。病人利益当测试很好理解,和有害的问题被认为是在测试之前发生。进一步发现不足,需要获取专家知识进行和评估测试导致临床决策。测试的问题在发展中国家或偏远地区上下文是一个复杂的过程,可用的设备和人员。

“芯片上的实验室”的方法提供了一个紧凑的用户友好的控制测试的技术。“芯片上的实验室”程序设计注意事项总结了从生产到下巴等处理。5]。总之应该便宜的生产设备以及处理;崎岖的;具有温度稳定性;允许被动流体交付/加工;提供可再生的信号检测。在这个方案的问题分析输出信号不是一个考虑。这反过来要求专业知识和培训操作员和引出了这样的问题,分析导致不正确的诊断不准确造成不适当的治疗和病人心理压力;这些额外的考虑是很少在讨论先进诊断系统开发。文献提供了许多“芯片上的实验室”处理的例子使用纸质流体(6- - - - - -13)和更传统的微流体设备使用渠道或印刷方法手册或被动传感器芯片的样品处理和模式(14- - - - - -16]。电浆平台广泛应用于学术和工业研究环境(17),但underapplied在低成本的诊断检测。然而,两个最近的趋势,包含相机和手机的广泛适应技术的发展不断制造金属纳米粒子,激励电浆传感的重新评估潜在的低成本的平台。这里我们提出一个传感系统的转变功能化金属纳米粒子的吸收光谱检测使用照相手机。解决测试过程中必须全面考虑每一步和insitu公司专业的最低要求。远程医疗是一个领域,吸引更多的关注,在系统的智能手机“应用程序”可以用来观察身体症状(18),进一步的建议可以交付的电话交谈19)和患者信息可以通过网络传播20.]。最近呼吁创新的重大挑战项目(比尔和梅林达•盖茨基金会)识别潜在的相机手机诊断,通过“应用程序”的建议和医疗诊断设备的基本观点与照相手机(21]。基金会认可的一个关键问题是,购买成本和能源消耗的一个典型的智能手机(必要运行应用程序)明显高于那些基本的手机。持续降低成本的光学和电子元件基本照相手机可能被认为是默认的低成本的手机。可以购买20美元以下的照相手机和一个2字节的探测器。一个基本的照相手机有许多优点:(1)集成光电探测器(CCD / CMOS),(2)电信在撒哈拉以南非洲的主要形式,固定电话取代了移动网络,(3)固态数据存储、(4)允许直接病人沟通和文本促使帮助治疗,(5)连接(USB、microSD、蓝牙、文本、移动互联网)。

转换的概念相机手机诊断应用程序已经有限的应用程序提供潜在的优势;主要开发涉及到数据通信方面的22- - - - - -24]。到目前为止发现的例子包括显微镜(25,26),摄影的伤口27],怀特塞德集团(纸质文件的分析方法28]。后者的例子是唯一的照相手机的潜力被应用到远程医疗,利用熊负载在数据采集通过数据传输到一个中央处理节点。

用户界面应该尽可能多是基于一个简单的可视化界面。这将进一步降低用户的要求的水平的知识,减少要求读写能力。最基本的手机操作一定程度的视觉识别。设备操作可以减少后的符号。

照相手机的扩展原理诊断,本文将探讨研究plasmonic-based试验原则使用手机作为数据采集单元。局部表面等离子体共振(LSPR)被认为是,被分析物的浓度和吸光度变化相对是分析测量。尤其是在金纳米棒的情况下纵向共振峰吸光度的增加比例造成的局部介电常数的变化被分析物结合在粒子表面29日]。LSPR方法是一种低成本的分析技术。金纳米棒可以使用低成本容易合成前体材料,一个非常小的体积的黄金提供足够的纳米棒很大量的化验。面临的挑战是设计一个合适的平台,可用于免疫分析和可定制的特定疾病的固定合适的抗体。LSPR享有的美德label-free通过耦合技术,不需要信号放大发光标签抗体或化学试剂的比色分析。

2。方法

2.1。纳米粒子

两种类型的金纳米粒子被用于实验,球和纳米棒。球形citrate-capped粒子合成在房子使用以下协议改编自30.),所有的化学物质从西格玛奥德里奇。购买80毫升的0.01% (w / v) HAuCl₄转移到500毫升瓶和磁搅拌。减少混合物制备组成的4毫升1% (w / v)二水柠檬酸三钠的0.2毫升1%鞣酸和15.8毫升蒸馏水。两种解决方案都加热到60°C,并减少迅速的解决方案是添加HAuCl搅拌₄解决方案。1小时后,解决方案是冷却。Mono-dispersed胶体金纳米粒子。粒子可以储存在室温下长达6个月没有明显的聚合。以前的工作使用这个协议在我们组给出一个局部表面等离子体消光峰在514海里。金纳米棒合成,请提供组织的这项工作在麦吉尔·伦诺克斯和Reven教授。纳米棒的长宽比3,最近被认为是理想的长宽比LSPR传感(29日]。棒受限和CTAB稳定。棒具有纵向LSPR峰在700 nm和横向峰在534海里。

2.2。仪表

的基本仪器设备是钢瓶住房三色LED充电电池(Digikey)力量和照相手机(摩托罗拉剃须刀)。三色LED提供蓝色、绿色和红色照明依赖应用程序供应1.5 V的电池。对这些实验只有绿色和红色通道使用520 nm和610 nm,分别。电池充电使用太阳能充电器的市场上有很多,但是我们选择了自建系统,制造成本20美元。中提供了一个基本的原理图2 (d)。提前的纳米颗粒测试相机手机测量的光谱范围。这是通过使用氙灯和单色仪平行输出项目的已知波长450 - 850纳米到照相手机的目标。五个图片都被microSD卡在每个波长和转移到一台笔记本电脑进行强度分析的图像通过图像J(可以从NIH)并使用Matlab或MS Excel图表绘制。照相手机的CMOS探测器观测到的是最敏感的450和600 nm之间预期的设备旨在捕捉光谱中的可见光区域的图像。敏感性的下降600 - 700 nm之间是线性的,也没有可观察到的差异可以检测到图像从700纳米到850纳米(见图1)。为了照相手机检测功能的原则,化验必须可见光谱变化(吸收和散射)在可见范围内。最初的概念证明设备允许单通道成像,但未来的工作将考虑多个通道(利用镜头解决多个样本井)。

2.3。图像采集和处理

来自摄像机的图像首先被收集和传输使用蓝牙连接到笔记本电脑或miniSD卡。基本图像处理软件(Adobe Photoshop, GNU GIMP或PowerPoint女士)应用于安排图片为了最高浓度最低,然后他们保存为JPG图像文件格式。随后合成的照片被加载到ImageJ (NIH),并计算每个图像点的平均强度使用固定区域选择工具。每个测量ImageJ日志,选择的面积和数据可以复制到其他软件包(Excel或Matlab)图形和进一步处理。

2.4。实验

初步研究应用与anti-CCL2绑定到粒子表面功能化金纳米粒子溶液。首先要考虑的是关于最合适的类型的生物测定。常见的炎症标记物和乳腺癌被选中(CCL2)与合适的捕获和记者抗体(BD生物科学)。绑定在一个纳米颗粒分析是通过吸光度或峰值波长位移观测。最简单的检测来实现绑定的功能化纳米颗粒抗原(见图2(一个))导致局部折射率变化,从而提供光学读出。放大的信号是通过添加第二个记者抗体绑定到一个金纳米粒子。本文应用双纳米颗粒分析,因为它提供了一个明确的信号增强方法,直接测定。

两个批次的纳米颗粒分别与捕获和记者functionalised抗体。单克隆抗体cross-specificities以前评估容克集团的在麦吉尔和绑定不同抗原表位的CCL2被发现。纳米粒子的目的是创建两个种群特异性授予CCL2的不同抗原表位的抗体。为捕获抗体functionalisation, 1500μL纳米粒子的混合证券anti-CCL2给浓度为3.33μ克/毫升。记者抗体被用来functionalise第二批纳米颗粒(1.5毫升)蛋白质含量为0.66μ克/毫升。批次使用前准备和孵化2小时,使用前25°C。Functionalisation纳米颗粒和棒依赖直接物理吸附表面。为了防止非特异性结合,PEGylation吸收之间的表面抗体。5μL 5毫米的聚乙二醇硫醇(西格玛奥德里奇)添加到1.5毫升批次的纳米颗粒和孵化25°C 1小时,所以,挂钩之间插入吸附抗体。记者和捕获抗体10批提前准备和存储在4°C,直到需要。所有生物都存储在不用的时候−20°C。

执行直接测定5比色皿和400μL的捕获抗体functionalised纳米颗粒是用移液器吸取到每个。5μL CCL2不同浓度(连续稀释从1到0.05μg / mL)吸管到每个试管,激起了大力。每个浓度的试验重复了3次新鲜纳米颗粒。

双重化验使用相同的CCL2浓度范围,但只有200人μL的捕获抗体纳米粒子添加到比色皿。5μL抗原的解决方案是添加使用相同的浓度范围的直接测定和搅拌。1小时孵化后25°C, 200μL(记者抗体纳米粒子添加到比色皿进一步孵化1小时。这个体积保持一致;纳米颗粒浓度也固定在5 ng / mL。金纳米棒在哪里应用相同浓度的5 ng / mL被直接使用和functionalisation物理吸附遵循相同的协议作为直接测定纳米颗粒的制备。金纳米棒化验是意识到使用直接检测协议没有额外的记者粒子。UV / Vis比较分析使用的双重分析协议,但在浓度范围300 - 2 ng / mL。

直接和双重化验方法,解决方案被安置在自定义1厘米比色皿放在设备的钢住房,和图像捕获的透射光。黑暗的背景图像是由电池作为孔径光阑的墙壁。

在这些实验中只讨论了双重分析直接测定球形纳米粒子使用照相手机作为探测器不能产生显著改变吸光度小于1μ克/毫升。吸光度的双重分析具有明显增强当地介电环境有很大变化造成的额外的生物分子参与的双重分析(2类抗体+ CCL2)和附近的一个额外的金纳米颗粒的吸光度增加电浆的模式。应用的结果一名记者校准情节可以生成纳米颗粒是一致的。这是不可能的,直接测定低于1μg / mL,因此它是排除在进一步考虑。直接的原因分析没有显著改变吸光度小于1μg / mL是CMOS探测器灵敏度小的函数变化的透射光收集作为一种形象和缺乏电浆的增强作为双重分析讨论。协议直接测定误差与金纳米棒被排除在外,因为它表现优异。

执行双重检测所需的时间是一个重要的因素要考虑。如果所需的时间延长(超过分钟)这限制了数量的测试在一个给定的时间段。理想的情况是一个抽样测试和结果发生在几分钟到一小时。图3和表1显示结果为CCL2在多个双粒子分析化验运行在不同的潜伏期(期后的记者抗体)。的目的是解决这一问题的理想时间达到最有利的数据的优点和所需要的时间进行分析。量化范围(0.099 - 1μg / mL)(18小时孵化)兼容的临床研究与相关性CCL2,多发性硬化症、前列腺癌和乳腺癌31日- - - - - -33]。为未来的研究建议至少1小时的潜伏期。

比较的相对性能照相手机平台进行同样的试验使用UV / V光谱仪(瓦里安卡里1)使用石英试管(路径长1厘米)。图4显示了双纳米颗粒的校准曲线分析方法。

像预期的那样一个更加稳定和准确的仪器提高了测定与照相手机性能比较实验;这是证明了改进的敏感性为0.78(ΔA /Δ[C])。这种程度的灵敏度需要孵化了18小时的照相手机分析方法实现奇偶校验。明确妥协照相手机应用程序的方法是检测器灵敏度和增加所需的孵化时间达到一个类似的敏感性与UV / Vis光谱学。应该感激,灵敏度检测器的组成是一个函数的成本,因为它是意图声明,照相手机平台的最小成本,增加孵化时间是一个可以接受的折衷。

2.5。分析的复杂性和敏感性

虽然双粒子溶液测定与球形金纳米粒子表现良好,如果需要更大的敏感性可以应用金纳米棒,与领导的红色通道来提高分辨率。图5说明了所需的步骤产生的吸光度变化图像,并推导出校准曲线。CCL2再次作为抗原和捕获抗体吸收到纳米颗粒。除了这两种类型的纳米粒子CCL2二级记者抗体(浓缩的。0.66μg / mL)作为增强策略,使用相同的抗体浓度正如前面用来使职能化球形粒子。CCL2抗原制备连续稀释,添加到整除的纳米颗粒(卷500μL)(球和棒分开),同等体积开始捕获粒子的解决方案是添加(500μL),潜伏期是30分钟25°C。球形粒子被使用的绿色照明LED (~ 520 nm)和一个红色照明LED (~ 610 nm)的金纳米棒。注意,黑暗的背景图像是由小池创建一个孔径光阑的墙壁在现场只允许测量的光,通过纳米颗粒/杆的解决方案。每个图像提出了光从发光二极管通过试管与纳米颗粒(绿色图片)或棒(红色图像)。每个浓度测量三次,相当于3图片在每一行。允许简单的数据处理图像结合起来形成复合图的图像5。这些处理在图像J作为显示在图5。

图5说明了提高灵敏度,因此决议,可以通过金纳米棒在球形纳米粒子的应用。为为基础的解决方案分析奈米棒提供了一个更有吸引力的电浆材料适用于测定发展特别是在奈米棒的纵向共振(~ 600海里)匹配的LED灯源。灵敏度的比较表明,纳米棒更加敏感(0.5625ΔA /Δ[C])在金纳米粒子的敏感性为0.375。这个测试表明,未来的低成本的诊断应该研究金纳米棒的应用,因为他们有一个更好的消光系数相比,纳米粒子,提高信噪比的检测生物分子与此设备。

3所示。结论

探索了照相手机的应用程序为基础的解决方案与记者抗体测定方法和提高,密切相互作用的纳米粒子引起的电场antigen-mediated分离距离增加了吸光度的测量波长的光。分析显示执行的临床相关的浓度范围进行分析CCL2(0.099比1μ0.099 g / mL)的检出限μ克/毫升。培养时间可以选择根据敏感性分析的要求;1小时或18小时似乎最合适的结果。如果治疗分析阈值范围的动态范围,中期18小时的潜伏期将允许更大的敏感性。的长时间的潜伏期增加灵敏度是由球形纳米粒子的结合和探测器。金纳米棒的光学介质是一个不错的选择在这个传感平台吸光度变化的程度甚至共振峰值大于球形纳米粒子,提高CCL2测定的性能,应该提供一个解决目前孵化时间长。照相手机和电浆纳米粒子的使用表明,一系列的基于抗体的测定可以轻易转移到这个易于使用的诊断平台。三色LED的应用程序还提供能源效率和波长选择的优点。未来工作的目标是开发平台允许多个渠道的分析,而不是一个单通道,将LED光源集成到低成本方案的照相手机也可以。

承认

作者要感谢Le昏聩的支持魁北克人de la矫揉造作的苏尔la自然等莱斯技术(FQRNT)。

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