一个Impedimetric免疫传感器灵敏度提高使用官能化的氧化铁纳米粒子

抽象

这项工作已探索基于与链霉亲和该抗体的生物素化的FAB部分已使用生物素 - 链霉亲相互作用结合官能磁性铁纳米颗粒（IrNP）impedimetric免疫传感器的发展。SPR分析显示抗原 - 抗体识别而通过EIS使用无标记检测允许我们监视极化电阻的变化期间所测量的（角）的偏差。在检测前，层是通过FTIR和AFM分析。Compared to immobilization of antibody on bare gold surface using aminodecanethiol SAM, antibody immobilization on nanoparticles permitted to reach lower detection limit: 500 pg/ml instead of 1 ng/ml to in the case of EIS and 300 ng/ml instead of 4.5 克/ ml，在SPR的情况下。因此，允许提高灵敏度：从257.3 1871年 在EIS的并从壳体至就SPR而言。

1.介绍

免疫传感器已经出现与提供快速和高度敏感的免疫应答的预期极大的兴趣。免疫传感器在临床诊断，食品安全和质量控制，生物分析和环境监测[应用领域广泛1-五]。近年来，该领域的研究进展迅速，旨在提高生物传感器的性能(特异性、稳定性、灵敏度、检出限等)。在这种方法中，最近的研究集中于使用纳米颗粒作为工具来放大抗体-抗原相互作用的响应信号，这导致了生物传感器特性的改善[6-8]。

近年来，纳米材料由于其独特和特殊的性质，在生物分析化学、生物分离和生物成像等领域得到了广泛的应用[9-12]。氧化铁纳米粒子或磁珠是一种纳米材料可能在电化学生物传感器的建设中发挥了重要的作用[13]。首先，氧化铁纳米颗粒具有非常大的比表面积和良好的生物兼容性。大多数实际上，它们可以是磁性烯丙基固定在金基板[14，15]。此外，这些磁性颗粒专为分子和特定细胞的浓缩、分离、纯化和鉴定而设计[16-18]。尤其适用于微流控器件的集成。

一种新的方法允许通过共价预先用自组装单层（SAM）官能化的基底上结合这些磁性颗粒附着。表面的物理化学的剪裁已导致越来越感兴趣使用thiolor硫化合物的自组装膜作为绝缘体[19-22]。所形成的单分子的有组织的结构具有许多优点，诸如绝缘的纳米结构，无缺陷的，更稳定，尤其是在水和其它溶剂[23]。

在这项工作中，我们报告基于与链酶功能化的氧化铁纳米粒子的电化学免疫传感器的发展。所述生物素标记的抗d二聚体降低抗体固定用11-氨基-1-十一烷硫醇和戊二醛作为偶联剂链接到先前官能化的金纳米电极氧化铁纳米颗粒的表面上。

发展此免疫传感器的目的，选择了表面等离子共振（SPR）和电化学阻抗谱（EIS）的技术。在第一次，表面等离子体共振（SPR）用作光学表征技术[24]。这项技术已经成为一个强大的工具实时控制生物分子相互作用[25]。SPR传感器基于表面等离子体或电磁波传播沿金属/电介质界面。由于等离子体激元的波矢量，取决于两种介质的介电常数，（哪里是光学波的自由空间波向量），但是这是在与金属接触的电介质的性质极为敏感。

表面等离子体激元通常以Kretchmann配置通过从金膜引导p偏振光到玻璃棱镜和反射激发[26]。当切X-component入射光波矢，KX中，与KSP匹配，则泵浦光的能量被转移到表面等离子体：

哪里是所述棱镜的折射率和是入射角。

因此，可以通过仔细监测SPR耦合特性来获得在金膜上的生物结合（识别）的事件的信息。在大多数SPR系统中，从角的测量或光SPR下反射的分光特性所获得的生物分子相互作用的信息。

在第二时间，电化学阻抗谱（EIS）被用作无标记检测转导技术。这种技术是，一方面使用的有效工具，用于电化学过程中的导电性高分子膜发生[定性和定量表征27，28]。在另一方面，探测修饰电极的界面性质及通常用于与所述导电支撑件相关联的理解化学转化和方法，它可以以研究免疫传感器的反应[用于探针抗体 - 抗原相互作用29-31]。

与基于SAM抗体偶联的免疫传感器相比，我们试图证明氧化铁纳米颗粒的使用可以放大响应信号，并改善免疫传感器的特性。

2。材料和方法

2.1。试剂

The magnetic coated streptavidin nanoparticles that display a diameter of 200 nm and an iron oxide content of about 70% (cf. Figure1）从Ademtech SA购买。11-氨基-1-十一烷硫醇（AUT）和戊二醛（GA）是从Aldrich得到。中性（Neutv）购自Pierce。毕奥 - 标签抗d二聚体还原的抗体（Fab片段毕奥 - SCAC）和从惠氏公司（阿伯丁UK）获得的抗原（肽缀合到BSA）。

电化学阻抗实验缓冲液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)，含137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.01 M和0。01 M，pH值7.对于循环伏安法实验，氧化还原电在5mm浓度下使用。所有溶液均配制在超纯水中(阻力18.2 M)Ω )由Millipore milliq系统生产。

2.2。仪表

2.2.1。表面等离子体共振（SPR）技术和镀金的衬底

表面等离子体共振光谱仪“Biosuplar 3”（http://www.micro-systems.de/）在乌克兰国家科学院的半导体物理研究所（基辅）的开发。基于表面等离子共振在Kretchmann的光学结构的现象此光电装置是由计算机通过自行开发的软件来控制。Gold film (45 nm) deposited through Cr adhesion layer (1–1.5 nm) onto a glass chip represented the sensor surface. An incident beam of p-polarized light from a semiconductor laser diode ( nm) excited an oscillation of electronic plasma (i.e., surface plasmon) in this metallic film. A special prism capable of rotation on a computer-defined angle provided optimal conditions for the plasmon excitation. A plasmon resonance itself was registered as a drastic decrease of reflected light intensity.

在本研究中，SPR谱仪流式细胞仪(）连接至的Gilson Minipuls 3泵。

2.2.2。阻抗谱

循环伏安法和电化学阻抗谱（EIS）测量使用Voltalab 80阻抗分析仪进行。传统的三个电极电池中，包括一个饱和甘汞电极（SCE）作为参比电极，铂丝作为反电极（0.54 ），以及修饰的金工作电极（0.19 ）。The impedance spectroscopy measurements were carried out in the frequency range from 0.05 Hz to 100 KHz at dc potential −400 mV, using a modulation voltage of 10 mV. Data simulation was made with the commercial software Zview (Scribrerand associates, Charlottesville, VA). All electrochemical measurements were carried out at room temperature in PBS pH 7.4.

2.2.3。原子力显微镜

原子力显微镜（一个FM) experiments were performed in air, using a Pico Plus molecular imaging microscope with a 300 nm scanning head. The images were registered in tapping mode using silicon pyramidal小费。喷嘴在空气中的超限共振频率为300 kHz。本文的图像由512条直线得到，并采用平面拟合的方法进行处理。

2.2.4。红外光谱法

NICOLET 710 FTIR光谱仪装备有MIR（中红外）源的MCT /使用的检测器来获得FTIR光谱。一个ll the spectra are collected during 128 scans for the reference and sample. Our strategy consisted of recording in reflexion mode the spectrum of the cleaned gold substrate and then of the gold substrate modified with the SAM. The spectrum of the cleaned electrode served as a reference. The difference between two spectra gave the spectrum of SAM.

2.2.5。该修饰电极的制备

制备两种系统中，一个基于使用硫醇SAM（系统1）和基于使用官能化磁性铁纳米颗粒的与链霉抗（系统2）其他的。

在电极变形例的第一步骤中，11-氨基-1-十一烷硫醇单层被化学吸附在金电极表面上并暴露朝向溶液氨基的阵列。在第二步骤中，将电极表面与醛基活化和左戊二醛自由的第二羰基上的表面的顶部。可以通过高浓度的双功能试剂，即，GA [应用能够防止桥结构由于戊二醛的两端醛基团与氨基基团的反应形成的32]。最后一步，中性的氨基（方案1(a):体系2)和涂有链霉亲和素的磁性铁纳米颗粒(方案)1(b):体系2)与戊二醛的醛基共价偶联。富含生物素结合位点的新膜与附着在疮痂抗体片段上的生物素配体形成高结合亲和力。Fab片段在铰链区进行生物素化处理，以确保片段在表面的定位，使其结合位点与表面相对。系统在方案中给出了框图1(c)。

两种类型的金电极被用作底物生物层制造。Evaporated gold (~ 300 nm thickness) deposited on silicon using a titanium layer (30 nm thickness) used as substrate for the electrochemical experiments. These gold electrodes were provided by LAAS, CNRS Toulouse. Before modification, the gold surface was cleaned in an ultrasonic bath for 10 minutes in acetone, dried under a dryflow and then dipped for 1 minute into ‘‘piranha solution’’ comprising 7 : 3 (v/v) 98%/ 30%。然后，将金基板用超纯水冲洗2至3次，并在氮气流下干燥。For the optical characterization the gold film (45 nm) deposited through Cr adhesion layer (1–1.5 nm) onto a glass chip was used. The gold surface was cleaned in the same way than the other ones, with a “piranha solution,” but for 15 seconds.

The aminothiol monolayer was prepared by soaking a clean gold electrode (Au) in 0.1 mM 11-Amino-1-undecanethiol (AUT) in ethanol solution for 24 hours at room temperature in darkness, washing the electrode thoroughly with ethanol to remove physically adsorbed 11-Amino-1-undecanethiol, immersing the electrode in PBS (pH 7.4) containing 5% (v/v) glutaraldehyde (GA) solution for 1 hour 30 minutes, and rinsing with PBS. Afterwards, for system 1, the electrode was immersed into mM Neutravidin solution for 2 hours to achieve Schiff base reaction between the aldehyde group of glutaraldehyde and the amino group of Neutravidin. And for system 2, the electrode was immersed into 0.25 mg/ml magnetic coated streptavidin nanoparticles solution for 12 hours to form the Schiff base between the aldehyde group of glutaraldehyde and the amino group of streptavidin. Antibody scAb fragment with a生物素标记（0。4 mg/ml) was immobilized on AUT/GA/Neut. films for 1 hour at room temperature, followed by thorough rinsing with PBS. Antigen at different concentrations was incubated on immobilized antibody for 30 minutes at room temperature. Scheme1示出了用于生物层和两个系统的抗原 - 抗体识别的形成示意性步骤。

3。结果与讨论

3.1。自组装单层膜的表征

与自组装单层11氨基-1-十一烷硫醇修饰的金电极随后表征的若干技术。

3.1.1。循环伏安法

循环伏安法是用于探测所述修饰电极表面的特征的有效的和方便的方法。的自组装膜沉积的步骤是由该技术控制。如示于图2（a）中，循环伏安限定了在清洗裸金电极中观察到的扩散控制氧化还原过程的特性。这种可逆循环伏安表示清洁金表面。在SAM上的金电极（图的形成2（b）中）导致一个的方式排序的绝缘表面，因而阻止的铁/铁氰化物的扩散朝向电极的表面，因此，法拉第电流的阻断。

3.1.2。阻抗测量

电化学阻抗谱（EIS）是用于探测的特征的表面改性的电极，同时控制其电性能[一种有效的工具33，34]。在第一时间，使用这种技术为SAM的阻抗特性的表征修饰的金电极和用于从该有用信息随后的提取。在图3Nyquist impedance plots for Au-electrode and SAM modified electrode at −400 mV dc potentials are presented, where是实部和是复阻抗的虚部吗ž[35]。膜电阻值，中，从拟合数据（表中提取3)，即8292和37120分别为裸金电极和混合修饰金电极。SAM单层的分数覆盖面积(）可以使用[阻抗图来计算36]

哪里和从金电极SAM分别官能化，的裸金电极的阻抗图和导出的膜电阻的值。在我们的系统覆盖面积等于77％。

3.1.3。SPR测量

SAM层的光学特性，通过SPR技术进行。数字4给出了反射强度与入射角的光谱。这些光谱显示的入射角位移裸金层之间。图（4（a））和涂覆有SAM层的金层（图4（B））。通过拟合使用Winspall程序这些光谱，计算每个层的厚度（见表1）。The thickness of the gold around of 50.72 nm was checked by this fitting. Also, the thickness of the SAM layer was estimated to 2.16 nm. Furthermore, this fitting allows estimating the dielectric constant从每个层的[37]

同和：

如是吸附剂指数和为通过拟合确定的折射率。然后估算了金薄膜的介电常数这些值对应于波长 nm and they are comparable with literature [38]。

3.2。系统1的生物膜的光学和电气特性（上基于SAM）和系统2的生物膜（上氧化铁纳米粒子基于）

3.2.1。SPR测量

一步步骤在形成生物膜（系统1）的典型动力学显示在图五即呈现SPR角传感。作为第一步骤，我们喷射的戊二醛溶液（5％）为含有由氨基硫醇官能化的金传感器表面的传感器头（从PBS的信号充当基线）。一个fter 110 minutes and after rinsing by PBS buffer the incidence angle was increased of与基线相比，这表明稳定的接枝GA的达到[29]。在第二步骤中，中性溶液（ M) was injected; this injection was accompanied by sharp changes in the signal until its saturation, suggesting that the neutravidin was indeed immobilized onto the GA activated surface. After 120 minutes of the injection, the SPR angle did not decrease during PBS flow, indicating that a stable immobilization of Neutravidin was achieved by covalent binding. An incidence angle shift of被观测到。Finely, Biotinylated Ab (0.4 mg/ml) was injected. An increase ofPBS流动后观察入角，表明生物素化的Ab与neutravidin有效结合(生物素/亲和固定化)[39]。使用的入射角偏移，抗体的被覆率根据测定

哪里，和represent, respectively, variation of the incidence angle, conversion constant (5300 s of arc/nm) and refractive index increments (0.188 /克的蛋白质）。For system 1, the covering rate of antibody reached 0.37 ng/m其对应于抗体的表面密度固定在的修饰的金电极 Ab molecules/m。有了这个表面密度，每个Ab分子所占据的平均表面 m获得了。

用于构成免疫膜的层的接枝的每个步骤中，光谱呈现所述反射强度对入射角，流动的PBS缓冲液后，分别记录（见图6）。每个层的厚度通过拟合使用Winspall程序这些光谱计算。用于拟合数据的蛋白质层的折射率为[40]。该折射率被假定为所有的蛋白质相似，通常假定通过SPR研究蛋白质。拟合参数列于表1。此外，该嵌合允许估计介电常数从每个层的（3）。

以相同的方式，基于铁氧化物纳米颗粒的构建免疫传感器的膜的向上被通过SPR技术控制。数字7示出了SPR角传感。结果表明，GA的稳定固定化用的入射角的增加表明相比于基线。GA的固定化是通过共价通过与戊二醛的醛基反应的氨基修饰的金电极的结合来实现的。一个fterwards, iron oxide nanoparticles solution (0.25 mg/ml) was injected on the new surface rich of aldehyde groups of glutaraldehyde. This injection was accompanied by sharp changes in the signal until its saturation, suggesting that the nanoparticles was indeed immobilized onto the GA activated surface. After 13 hours of the injection, the SPR angle did not decrease during the PBS flow, indicating that a stable immobilization of nanoparticles was achieved by covalent binding. An incidence angle shift of被观测到。Finely, Biotinylated Ab (0.4 mg/ml) immobilized by biotin/avidin affinity leading to an incidence angle shift of。

对于系统2，抗体覆盖率达到 mg/m其对应于抗体的表面密度固定在的修饰的金电极 Ab molecules/m其对应于一个加倍表面密度相比，系统1。

用于构成免疫膜的层的接枝的每个步骤中，光谱呈现所述反射强度对入射角，由PBS缓冲液冲洗后，分别记录（见图8）。这些光谱表明其对应于基于所述氧化铁生物膜的每一层纳米粒子这些结果的入射角偏移再次示出了由层生物膜层的结构。此外，每个层的厚度通过拟合使用Winspall程序这些光谱计算。拟合参数列于表2。These results show that the average thickness of the nanoparticles layer is about 301 nm. Furthermore, AFM photograph of nanoparticles presented in Figure1显示了它们的近似球状的形状。The distribution in size of the dried nanoparticles is the following one: the diameter range is between 160 nm to 500 nm with a mean diameter of 257 nm, and 28% of nanoparticles have a diameter of 240 nm. Therefore, the hydrodynamic diameter of the nanoparticles was determined using Malvern Nano-Zetasizer at。Magnetic nanoparticles were diluted at 1/200 in a 1 mM NaCl solution pH7. The nanoparticles present a hydrodynamic diameter of 284 nm with a polydispersity coefficient of 0.1 and a zeta potential of −23.6 mV due to their streptavidin coating.

The comparison of the results of both systems proved that the use of the iron oxide nanoparticles increases the thickness of the layer of antibody from 0.4 to 1.2 nm, from where, the increase of the grafting density of antibody on the electrode.

3.2.2。阻抗测量

我们使用EIS在电位−400 mV的PBS (10 mM, pH 7)中控制生物膜的形成。数据9和10显示阻抗谱测量值作为Nyquist图的结果，对金电极两个生物膜的组装。所有的电气参数值在表3和表4。

在系统1的情况下（基于SAM）（图9），拟合数据（表3)，结果表明膜电阻增加的37120至62535，为反映清楚GA膜对氨基硫醇官能化电极的附着GA膜。因此，电容元件减小，这是由于增加了与该层的厚度

哪里为真空介电常数(F/）层的介电常数是多少，是该表面的区域，和是层的厚度。随后，的下降，中性的接枝期间，进一步指出的NeutrAvidin在修饰电极的随后连接。因此，电容元件的增加，这是由于增加的介电常数，由于增加了导电性，可以是由于电荷的蛋白质（中性）的接枝。细，在电极上的scAb的后续固定化表示通过的降低。

在相同的测量条件的基础上，氧化铁纳米颗粒是由EIS控制建立免疫传感器的生物膜（图10）。从拟合数据（表4），结果表明该膜电阻的增加对于IrNP膜SAM膜，其反射清楚IrNP膜的改性电极的连接相比（当GA耦合SAM与IrNP所以没有进行阻抗测量）。因此，IrNP膜的形成将部分还原修饰电极的电子转移，所以整个IrNP层的导电性降低。最后，在电极上的scAb的后续固定化表示通过增加。

3.3。通过系统1(基于SAM)和通过系统2(基于氧化铁纳米粒子)进行电光探测

3.3.1。光学检测

为了研究两个免疫传感器的反应的比较，对应于入射角的变化的光学校准曲线与PBS溶液中特异性抗原浓度的比较如图所示11。数字图11（a）礼物免疫传感器的与系统1有Ag浓度呈现的饱和部分的免疫传感器的校准曲线开发的响应;然而，免疫传感器响应呈现之间的线性关系和银浓度范围为4.5至15 微克/毫升与4.5的检测极限 g/ml，平均响应时间45分钟。该线性回归方程为，相关系数为0.96。数字11 (b)礼物免疫与系统2与Ag的浓度呈现饱和部分的免疫传感器的校准曲线开发的响应;然而，免疫传感器响应呈现之间的线性关系Ag浓度在0.3 ~ 1之间微克/毫升同a detection limit of 300 ng/ml, and an average response time of 30 minutes. The linear regression equation was，具有0.98的相关系数。因此，结果表明在基于与基于SAM免疫传感器的氧化铁纳米颗粒的免疫传感器的情况下的更高的响应。

3.3.2。电气检测

一个ntigen—Antibody interactions were monitored by impedance spectroscopy in PBS solution (10 mM, pH 7) at −400 mV for system 1 and for system 2. Systematically, the electrodes modified with biotin-tagged antibody fragment were equilibrated with a range of concentrations of the specific antigen. The impedance spectra obtained after incubation with different concentrations of Antigen are shown in Figure12。立即阻抗与将[Ag]的增加，这表明抗原的较大量的链接到特定网站和电子转移减少清楚地减小。

为了研究比较两种免疫传感器的反应，电校准曲线对应膜电阻的变化与PBS溶液中特异性抗原浓度的比较如图所示13。数字图13（a）礼物免疫传感器的与系统1与Ag的浓度呈现饱和部分的免疫传感器的校准曲线开发的响应;然而，免疫传感器表现之间的线性关系和the Ag concentration ranging from 1 to 50 ng同a detection limit of 1 ng和an overage response time of 45 minutes. The linear regression equation in the range from 1 to 50 ng是，具有0.83的相关系数。数字图13（b）礼物免疫与系统2与Ag的浓度呈现饱和部分的免疫传感器的校准曲线开发的响应;然而，免疫传感器表现之间的线性关系和the Ag concentration ranging from 0.5 to 50 ng同a detection limit of 500 pg和an overage response time of 20 minutes. The linear regression equation in the range from 1 to 50 ng是，相关系数为0.91。因此，比较两种免疫传感器的特性，结果证实氧化铁纳米颗粒的使用立即改善了免疫传感器在检测限方面的特性。

4。结论

在本研究中，我们开发了一种基于功能化氧化铁纳米粒子的免疫传感器。通过与基于SAM的免疫传感器的开发进行比较，我们证明了功能化氧化铁纳米颗粒的使用有几个优点。对比两种体系的结果证明，氧化铁纳米颗粒的使用放大了响应信号，使抗体层厚度从0.4 nm增加到1.2 nm，由此增加了电极上抗体接枝密度。在第二次，我们证明了利用电化学阻抗谱结合理论等效电路模型是可能的，以确定电学性质。此外，EIS允许对生物膜的工程进行全面的监测。

表五从电学和光学表征方面比较了基于SAM的免疫传感器和基于氧化铁纳米粒子的免疫传感器的分析参数。对两种免疫传感器特性的比较表明，纳米颗粒可获得最佳特性。因此，纳米颗粒上的抗体固定化可以达到更低的灵敏度和检测限:500 pg/ml而不是1 ng/ml，对EIS和300 ng/ml而不是4.5 ng/ml克/ ml，在SPR的情况下。因此，它允许改善从257.3灵敏度 1871年 在EIS的并从壳体至就SPR而言。

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