近红外共振能量转移葡萄糖生物传感器的混合微胶囊运营商

文摘

荧光技术传感系统提供无创性监测与植入设备的潜力,但需要提供合适的固定化载体技术,可访问性和生物相容性。最近的进展向这一目标包括竞争绑定测定葡萄糖被封装在透微胶囊运营商。介绍一个扩展的工作增加体内监测的适用性,在描述两个重大进展:(1)近红外共振能量转移系统转导葡萄糖浓度,和(2)小说混合有机-无机交联微胶囊作为载体。quenching-based试验是一种很有竞争力的绑定(CB)系统基于apo-glucose氧化酶(AG)作为配体受体和右旋糖酐竞争力。封装的quencher-labeled右旋糖酐和近红外donor-labeled葡萄糖受体表现出稳定和可逆响应的灵敏度可调1 - 5% / mM /生理范围,使这些传感器有吸引力的生物医学应用程序的连续监测。

1。介绍

众所周知,经常监测血糖浓度和适当的对策可以帮助实现正常,减少继发性糖尿病并发症(1- - - - - -5]。光学传感器使血液测试没有任何需要葡萄糖的提取是一个有吸引力的替代现行标准痛苦finger-stick测试程序(6- - - - - -8]。特别是,植入荧光传感器,可以嵌入到高度血管真皮(< 1毫米从皮肤表面)和远程监控使用光,将是一个理想的解决方案(9- - - - - -11];这种传感机制近年来一直强烈追求使用基于荧光光谱技术由于固有的高灵敏度(10- - - - - -18]。还一个可行的方法的具体监测临床生物标志物也会有用的管理大量的情况调整剂量的药物基于生物标志物水平。

在几种方法荧光技术葡萄糖传感已经开发使用伴刀豆球蛋白(12,19- - - - - -25)和boronic酸受体(26- - - - - -32),使用它们是复杂的担忧毒性、特异性的和不可逆转的绑定,不匹配的生理水平和响应范围。我们最近开发了一种新的competitive-binding (CB)测定,采用葡萄糖氧化酶的活性形式(apo-GOx)作为glucose-binding蛋白质,并使用荧光共振能量转移(RET)转换绑定(33]。Apo-GOx高度选择性d葡萄糖(渲染性能,相对于D-mannose d葡萄糖,蔗糖),悬浮液的胶囊在不到1分钟响应葡萄糖滴定,CB化验是反应的临床相关0 30毫克分子(~ 0 - 600 mg / dL)范围(15,33- - - - - -35]。此外,气态氧被指定为“肝”,通常被认为是安全的(36]。

我们还开发了一个载体系统,提供了可访问性的分析物,防止运动分子用途以外的地区(15,37- - - - - -41]。这个一般概念的诱骗葡萄糖感应化学可以使微球的生物相容性是一个有吸引力的方法,利用荧光光谱的灵敏度和特异性的蛋白质等分子识别代理体内使用。我们率先使用半透聚电解质微胶囊(42- - - - - -45为了这个目的,因为它们特别适合多分子的化验的要求。在这种方法中,使用微胶囊使自由流动的配体,受体,和被分析物在竞争的过程中位移,而半透膜墙使陷入更大的传感测定胶囊中的元素内部,但允许自由葡萄糖运输通过囊壁。使用封装CB的可行性分析血糖监测的方法已经证明使用多个RET对,包括绿/橙(15和橙色/红色35)系统;能够翻译不同的波长区域的转导系统是特别有利于当前的研究。封装被证明是稳定的(15),因此微胶囊化验的一生有用的操作将取决于光漂白和蛋白质变性动力学;调查这些过程,以及定量评估响应时间,目前正在进行中。值得注意的是这个化验最近也被证明函数在polyelectrolyte-coated藻酸盐微球(46]。

虽然这些先前的报道表示必要的步骤一个可行的监测系统,大量的临床接受额外的障碍依然存在。三个改进将有助于走向最终目标是增加操作波长更灵巧的胶囊制造和封装过程,和一个稳定的胶囊配方。通过组织长波长光将提高渗透率。然而,尽管大量的选择有机染料和无机材料已确定和用于回收系统47),可用近红外染料的广泛的激发光谱很难找到一个高效的RET对近红外光谱区域。我们注意到,这也是需要匹配的捐献者激发光谱发射的一个便宜的光源,这样低成本的监测技术可以使用。红色光谱区是有吸引力的,为此,由于优秀的红色LED和激光二极管的广泛可用性来源。

这些问题都解决在这个工作(1)转换的转导方案从系统受体释放光子的受体是deexcited通过非辐射的途径,在近红外染料(Alexa萤石647)与葡萄糖受体和宽带冷却器(QSY21)附加到竞争的配体,和(2)封装试验混合polymer-silica microshells。许多不同的微胶囊和建设策略与控制凝固壳厚度和属性提出了基于多功能LbL自组装过程(44,48- - - - - -51]。这些变化已经演示了各种大分子的封装,如蛋白质(39,52,53)、蛋白质/多糖复合物[15),和酶(39,41,54- - - - - -58]。当几种封装方法是基于控制囊壁的通透性(51,59,60)、降水技术(61年,62年),或聚合单体在微胶囊41),我们已经表明,微胶囊与墙壁组成的光敏聚合物可用于高效和稳定的大分子封装(39]。然而,这种方法的缺点包括使用有毒的聚合物,不方便组装条件要求免受紫外线UV-initiated交联之前,和相对较低的稳定的聚合物壳在操纵。而无机硅微胶囊和智能有机/无机微胶囊也被提出(42,63年,64年),流程需要意识到这些都是严厉的,乏味的,需要暴露在强酸性/碱性条件下,高温和紫外线,对生物分子构成潜在危险。因此,在这项工作中,我们探索的可能性,形成混合有机/无机微胶囊和封装与温和的过程建立了传感试剂到胶囊。具体地说,我们描述的修改聚烯丙胺盐酸盐)与glycidyl-silane (PAH),这样产生的PAH-silane共轭可以交替吸附与聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS),获得PSS / PAH-silane慢慢交联微胶囊。当胶囊包含高分子传感试剂悬浮在一个解决方案,然后被困内大分子扩散发生交联。

介绍了调查的近红外光谱葡萄糖传感器组成的竞争结合试验封装在混合微胶囊,并比较所获得的性能特征与FITC / TRITC和TRITC / Cy5能量转移对。我们还报告一个新颖的方法封装的大分子silane-modified PSS / PAH微胶囊,最终形成有机/ inorgano混合微胶囊。空心silane-based微胶囊慢慢形成一个贯穿二氧化硅网络由于硅烷的水解和随后的凝结。而彻底的表征混合微胶囊将在一个单独的报告,描述的细节材料和方法用于制造这里提供这些独特的结构完整性。

分析描述
葡萄糖传感器的原理基于这种猝灭机制如图1。这种传感机制中使用的染料是Alexa萤石(AF) 647年,QSY21, AF750。AF647排放在650 - 720纳米,这与QSY21光谱吸光度。因此,当AF647 QSY21附近,QSY21显著的荧光淬灭AF647。QSY21不是荧光,只有一个荧光峰,防止比率的分析数据。第二个近红外染料(Alexa萤石750)是集成到微胶囊的墙壁,作为参考荧光团比率计监测;AF750弱兴奋在640 nm QSY21但是是不灭的。因此,当apo-GOx AF647标记是暴露于QSY21-dextran (QSY-dex),他们将在附近由于apo-GOx之间的亲和力和右旋糖酐。这导致了低排放强度在664 nm的淬火AF647 QSY21。添加葡萄糖的位移结果从apo-GOx葡聚糖,降低淬火AF647和不断增加的排放在664纳米(图1)。因此,葡萄糖的敏感性AF647-apo-GOx (AF-AG) / QSY-dex复合物禁锢在AF750-labeled微胶囊可以确定通过测量相对于AF750 AF647荧光强度的变化。

理论
上述齐次能量转移试验可以数学表达式描述固定化受体之间的竞争结合反应()和配体()。相应的协会常数(&)给出在哪里和是配体/受体复杂。同样,与分析物(),绑定反应所描述的在哪里和分析物/受体复杂。通过考虑自由(释放)的浓度acceptor-labeled受体donor-labeled配体,分别和分析物(下标””表示总浓度),最后一个方程来描述整个系统也可以用简化的无量纲形式为:,在那里和给自由比总配体和无量纲分析物的浓度,分别为(65年]。无量纲分析物浓度取决于分析物浓度和receptor-analyte亲和力比浓度和亲和力的配体竞争。因为丝受体的数量()是这项研究的兴趣,这个量的总和可以找到免费的受体和analyte-bound受体浓度。这使得解决测量量,相对的荧光受体数量。
这个系统的一个关键方面是响应的依赖在不同浓度的分析组件,在绝对和相对的感觉。使用上面的方程中,图的图表2是为了说明这些参数的影响。显然,响应变化显著的比例配体受体或绝对的试剂浓度改变;具体地说,是增加,预测反应级增加而反应在同一范围内。与下降价值观、响应转向低浓度范围和灵敏度的损失,由于不完全淬火受体荧光在缺乏分析物造成淬火配体不足。此外,反应是观察到的范围变化直接与绝对测定浓度。从这些模型中,任何应用程序所需的分析元素的浓度可以估计基于所需的探测范围如果协会已知常数,在胶囊和不均匀性的影响人口对传感器响应可以预测。
传感系统的响应特征可以有效的离解常数的遥感分析,也称为浓度反应是观察到的一半(66年]。显然,这个量变化与增加测定浓度较大的值。预测增加测定浓度的影响分析物的响应绑定,现实的值配体和受体浓度和各自协会使用常数(纳米;纳米;;)计算百分比丝受体浓度与被分析物浓度的变化。从这个线性情节更明显(见图3),响应的大小与测定浓度的增加,极大地增强了和范围的响应变化明显由于增加额外的分析物。

2。实验的细节

2.1。材料

3 - (trimethoxysilyl)丙基缩水甘油醚(glycidyl-silane)、气态氧(g - 2133),聚(苯乙烯磺酸盐)钠(PSS, MW ~ 1 MDa),聚(烯丙胺盐酸盐)(70 kDa PAH,兆瓦),d葡萄糖、碳酸氢钠、二甲基甲酰胺,硫酸铵,醋酸钠缓冲来自σ。Succinimidyl酯形式的Alexa萤石647 (AF647), Alexa萤石750 (AF750)和转换频率21 (QSY21)(英杰公司)被用来标签apo-GOx,多环芳烃,和amino-dextran (500 kDa,表达载体),分别使用标准胺标签程序(表达载体)。所有试剂都是作为收到。(5μ米粒子是准备如前所述40]。

2.2。仪表

紫外可见光谱仪(珀金埃尔默λ45)是用于收集吸光度光谱。狭缝大小(4海里)和扫描速度(480海里/分钟)保持不变在所有的实验。扫描荧光光谱仪(QM1,光子技术国际)与一个extended-wavelength PMT (R928)是用于收集荧光发射光谱而令人兴奋的样例在640海里。共焦图像被用TCS SP2徕卡显微镜配备了63 x油浸物镜和一个红色的氦氖激光激发。数量和大小的微胶囊获得与贝克曼库尔特计数器(Z2)使用100μ米孔径。聚电解质多层膜的组装胶体模板是监控模板粒子通过测量每个聚离子的沉积后表面电位;电泳淌度的测量进行了使用ZetaPlusζ电位分析仪(布鲁克海文国家实验室仪器公司)。

2.3。方法

2.3.1。溶液相的实验

分析优化
葡萄糖测定浓度进行优化通过执行一个简单的滴定实验获得最大信号变化对于一个给定的分析物的浓度。传感测定元素的浓度进行了优化基于QSY21 AF647的浓度猝灭。观察淬火行为,证实RET,整除的700 nM QSY21-dextran (QSY-dex)解决方案被滴定到17.5,35岁和70 nM AF647-AG (AF-AG)逐步的方式,其次是测量的荧光发射。

葡萄糖的敏感性
apo-GOx和amino-dextran用于所有的实验都贴上AF647和QSY21比率的3.2和2.4,分别。淬火过程AF-AG和QSY-dex之间被兴奋的样例使用荧光分光计监测在640 nm和收集排放在650 - 750纳米的范围。最初,~ 16.5皮摩尔AF647-AG被添加到0.4毫升的去离子水。根据淬火研究,QSY-dex的初始浓度41 AF-AG被选为143 nM。评估的相对亲和力apo-GOx葡萄糖和QSY-dex复苏AF647发射期间观察到500毫米的逐步增加整除d葡萄糖溶液样品含QSY-dex / AF-AG复合物。QSY-dex总浓度的影响在位移行为调查重复相同的过程在不同浓度的QSY-dex。荧光的变化AF647峰值被滴定纠正稀释效果QSY-dex / AF-AG复合物与去离子水在平行实验中,然后减去改变由于水,由于葡萄糖。所有的实验中,灵敏度曲线是由策划dilution-corrected排放强度在664 nm和葡萄糖浓度。

2.3.2。制造检测试剂的混合微胶囊和封装

微胶囊制备
PSS和PAH解决方案用于构建多层电影准备在去离子水50毫米(基于单体浓度)。LbL装配PSS / PAH-silane 20μL (glycidyl-silane加入1毫升的PAH的解决方案。多层膜的PSS / PAH-silane电影表面组装5μ米粒子(数据4(一)和4(b))通过悬浮粒子在聚合物解决方案15分钟,其次是三个离心和冲洗步骤移除的聚合物(40]。这部电影表面结构的模板完成组装/ PSS。确认电荷逆转,表面电位测量完成后每个聚合物层的沉积。完成后的聚合物层沉积,核心粒子溶解(图4收益率(c)), 5μm内径silane-modified中空微胶囊。

加载检测试剂
微胶囊的/ PSS架构被分散在AF-AG和QSY-dex(230和990点,分别地。)(图4(d))。微胶囊孵化在两天的加载解决方案,允许足够的时间对硅烷的水解和缩合,促进形成一个密集的和不透水互穿网络(图4(e))。胶囊是在去离子水冲洗去除未密封的测定分子,产生微胶囊含有AF647-AG和QSY21-dextran(图4(f))。最后,引用染料被纳入微胶囊壁的外层涂料(PSS)的微胶囊PAH-AF750通过静电自组装。共焦显微镜是用来评估测定元素的加载到微胶囊。浸出试验加载元素的决心通过测量吸光度和荧光胶囊上层清液5周后封装。50 nM的标准溶液AF-AG常被用来估计上层清液浓度的比例标准。

2.3.3。封装传感器响应测试

传感器响应的微胶囊
AF750-labeled微胶囊含有AF-AG和QSY-dex悬浮在去离子水,和一个初始荧光光谱收集。葡萄糖溶液(500毫米)滴定到微胶囊悬浮液,作为液相进行研究。的变化相对发射强度在664和780海里为每个光谱计算并绘制对葡萄糖浓度。确认理论预测的影响受体/竞争配体浓度和评估调整传感器响应的可能性,这些实验重复了四种不同浓度的胶囊,(,,,胶囊/毫升)。实验重复三次,计算比率的变化值集中进行统计分析。

可逆性
测试微胶囊的可逆性传感器,暴露在随机顺序对葡萄糖浓度。为了达到这个目标,微胶囊分散在去离子水(胶囊/毫升)和葡萄糖浓度的悬架被添加葡萄糖增加股票的解决方案。葡萄糖水平下降了在去离子水浸泡胶囊每次测量后去除葡萄糖。在每种情况下,添加葡萄糖后所需的浓度和荧光测量悬浮离心三次,上层(葡萄糖溶液),同等体积的新鲜DI水是补充道。AF647 / AF740峰值比率的变化得到每一步通过收集荧光扫描。这个过程被重复覆盖0-60 mM的浓度范围,在0,5.3,0,13.5,,3.31,26.6,32.5,5.5,44.6,6.3,61.6,10毫米。实验重复了三次,结果集中进行统计分析。

3所示。结果与讨论

3.1。解决方案阶段的实验

分析优化
AF-AG样品表现出降低排放强度QSY-dex滴定中,后一种模式绑定(图预测的平衡5)。这表明,淬火部分原因是受潮湿腐烂,也可能由于辐射过程。通过拟合数据收集的三个实验在不同浓度的AF-AG,对QSY21-dextran估计在50到100纳米。这些发现证明RET-based淬火过程的效率由于apo-GOx:右旋糖酐协会,并提供洞察绑定关联,这是有用的分析设计。

葡萄糖反应测试
采取最优测定浓度从淬火实验考虑,获得一个包含142海里QSY-dex测定混合物和42纳米AF-AG准备在去离子水和受到连续葡萄糖的添加。假设,添加葡萄糖从apo-GOx流离失所的右旋糖酐,导致减少淬火和相应增强的荧光发射在664纳米(图6(一))。因此,转变的分析通过RET-based转导成功,长波长和响应的灵敏度(0.7% /毫米)是与原来的系统,使用可见染料(33]。dilution-corrected排放峰值比改变了25%(图6 (b)),生理的线性响应范围0 30毫米。图6 (b)还包含响应曲线不同apo-GOx:右旋糖酐组合,确认不同受体的敏感性和变化范围和竞争配体浓度预测的理论数据2和3)。这些发现证明了葡萄糖的敏感性分析可以在多种不同的浓度范围(0 - 200毫米)通过控制冷却器的浓度;然而,值得注意的是感兴趣的在该地区的敏感性(0 30毫米)是相似的在所有的实验中,因为相同的相对数量的饮料分子流离失所由于相同的葡萄糖浓度。因此,主要参数,可以通过控制淬火不同浓度的有效电离常数传感检测,也称为浓度反应是观察到的一半(66年]。在这些实验中,估计是17日,25日,50岁,化验有71和83毫米,142.5,285和427.5 nM QSY21-dex分别。

在微胶囊封装AF-AG / QSY-dex复合物
微粒的表面潜力交替的每一层,(图4(g))。这说明成功制造模板粒子的壳。微胶囊的PSS壳结构是由核心解散和用于封装AF-AG / QSY-dex复合物,紧随其后的是染料(AF750)的引用。Postloading上层清液浓度和胶囊数量被用来计算封装的和摩尔/胶囊AF-AG QSY-dex,分别。释放AF-AG到上层清液在五周只有0.12%,代表40倍降低浸出之前的方法和显示的稳定诱捕受体和配体竞争。通过共焦显微镜和滴定实验,apo-GOx在胶囊内的分数估计总数的27%,而另外73%是胶囊固定化墙壁和被认为是不能应对血糖变化。它将需要改善封装过程删除不需要的背景信号,避免浪费;我们相信这可能是通过,例如,“presaturating”的非特异性结合位点的墙壁胶囊与白蛋白或其他阻碍试剂。然而,我们承认这可能会提高其他方面的困难,未来的研究将解决这个问题。

传感器响应葡萄糖添加微胶囊
荧光强度在664海里每增加增加d葡萄糖解决微胶囊含有AF-AG / QSY-dex复合物,如图7(一)。相应的百分比变化的归一化强度在664 nm计算和绘制与葡萄糖浓度,如图7 (b)。再一次,没有明显的敏感性下降的地区利益(0 30毫米)相比,可见染料系统(15,35]。减少敏感性增加胶囊匹配理论和液相浓度测量,确认灵敏度可以通过改变竞争绑定定制分析浓度。有敏感性的增加,微胶囊比作可比测定浓度的液相反应,的两倍。这是移动传感的低浓度测定的结果元素,很大程度上归因于~ 72%的封装的截留分子胶囊墙壁。固定化apo-GOx和右旋糖酐分子可能不会分离的葡萄糖分子,因此只能不断的背景信号的发射光谱。
我们注意到,这种行为与可见染料(与以前的研究一致15,35),不过“可用”的总量和相对分数测定试剂由于不同的胶囊结构是不同的。具体来说,当前系统封装~ 10 x apo-GOx /胶囊的数量比以前的系统,这是更有效的在墙上(~ 50% / 50%)[15];所以,即使显然效率低,更大的载荷是新方法来完成。这是进一步支持的相对“饱和”点比较多的微胶囊:对于新系统,这是达到35毫米左右胶囊,而对于以前的版本,这是相同数量(约20毫米15]。
鉴于生理传感是目标,病理生理血糖水平糖尿病患者所经历的可能范围从0 30毫米(0 - 600 mg / dL),匹配的传感器响应这个范围需要正确选择试剂浓度。我们可以看到在图7和表1,响应的范围可以调谐匹配应用程序通过控制竞争受体和配体的量的样本。例如,以匹配0 30毫米线性响应范围,37 pmol QSY-dex和46 pmol AF-AG应该封装。

3.2。示范可逆传感器的响应

将微胶囊(胶囊/毫升)随机血糖浓度确认的完全可逆的性质测定灵敏度没有任何损失。相对强度的变化绘制在图8也说明的一致性和线性响应在一个宽的浓度范围。观察到的0.83% / mM敏感性匹配相同浓度的胶囊接触逐步增加葡萄糖浓度(图7、表1)。

4所示。结论

制定一套有效的RET淬火方法作为传导机制为右旋糖酐/ apo-GOx竞争结合试验,扩展到近红外的操作区域。传感测定元素(一个quencher-labeled右旋糖酐,fluorophore-tagged apo-glucose氧化酶,和一个参考荧光染料)被禁锢在微胶囊使用简单和高效silane-based封装过程。微胶囊包含标记右旋糖酐/ apo-GOx复合物显示葡萄糖敏感性~ 1 - 5% /毫米,这是与原试验操作在可见区域,是有史以来最敏感的报道。因此,该系统优于先前的迭代,因为它具有以下的品质:(1)受体是无毒的36),(2)silane-based封装过程采用这个系统是有毒物质的简单和自由;(3)该系统的灵敏度相当于或优于先前microcapsule-based葡萄糖传感器的化身;和(4)的信号水平显著增加(信噪比)将获得用于生物媒体时,由于减少了在长波长的光散射。这些改进使这个系统作为植入式葡萄糖传感更具吸引力的连续葡萄糖监测技术。

确认

作者欣然承认美国国家科学基金会(NIRT批准号0210298)和国家卫生研究院(R01EB000739)。任何意见、发现和结论/建议在这种材料中表达作者的,不一定反映美国国家科学基金会的观点。

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