Alamandine在啮齿动物肺纤维化和呼吸力学中的评估

抽象的

介绍．肺纤维化（PF）的特征在于，在肺功能加速下滑并具有有限的治疗选择。Alamandine（ALA）是在几个条件的肾素 - 血管紧张素系统（RAS）与基本任务的最近描述保护肽。我们组以前表明，ALA是由365％下降的特发性PF在等离子体中，并且因此，它是合理相信这种肽的刺激可以代表一个重要的治疗目标。在这个意义上说，这项研究调查ALA的PF的实验模型中的作用。材料和方法．博莱霉素（BLM）被给予Wistar大鼠，而这些纤维化动物用ALA治疗14天。体重，组织学，呼吸和血流动力学参数进行了分析，研究ALA的影响。结果．ALA治疗减弱了纤维化的发展（ ），减少呼吸系统弹性( ），及保持体重增加( ）在纤维化动物中不影响血压和心率的自主控制。结论．本研究的数据证明ALA潜力以缓解肺纤维化和改善呼吸系统力学体内．这些有希望的结果鼓励对ALA作为一种未来和有效的抗纤维化药物的潜力进行更详细的研究。

1.介绍

肺纤维化(Pulmonary fibrosis, PF)的特征是过度的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积，并经常演变为死亡[1］．在这些患者中，呼吸系统的弹性明显增加[2，需要更大的呼吸工作。因此，必须找到有效的治疗策略，促进肺扩张，减少呼吸衰竭的发作。

肾素 - 血管紧张素系统的（RAS）中PF参与已经很好地描述3.- - - - - -5］．血管紧张素转化酶2（ACE2）已经显示出是在几个不同的条件[重要反调节轴6- - - - - -8］．alamandine (ALA)，由ACE2轴产生，虽然最近才发现[9，因其对心血管系统的保护作用，即血管舒张而闻名[9]和抗纤维化作用[10］．此外，我们以前的研究表明，特发性PF的患者在血浆中存在365％的ALA [11]，这可能表明该肽的外源给药可以衰减PF的发展，并因此减少在肺功能下降。

因此，由于博莱霉素(BLM)是表征最好的PF模型[12，13[本研究旨在评估ALA对BLM诱导大鼠PF开发的保护作用。

2.材料和方法

2．1．动物

所有的程序，然后美国卫生研究所[出版的指南护理和实验动物使用14］．联邦大学伦理研究委员会(Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre)批准了这项研究(方案17/207)。五周大的雄性Wistar大鼠被安置在一个房间( ）12: 12昼夜节律，标准饮食和水随意．

2.2。肺纤维化的协议

大鼠经氯胺酮(80 mg/kg)、氧嗪(10 mg/kg)麻醉，经口咽抽吸(OA)给予BLM (2.5 mg/kg, Bonar, Ache)或生理盐水(0.9%)。同日，微型渗透泵(OM;Alzet 2004)将含有生理盐水或ALA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶液的皮下注射到动物背部，产生0.25μ.升/小时（ALA; 50 μ.克/公斤或 天）分别为14天，。老鼠的健康状况和体重每天监测。

组（ ）(1) CO: OA和OM的生理盐水。(2) ALA: OA和ALA生理盐水(50μ.g/kg/day)。(3) BLM: OM用OA和生理盐水加BLM (2.5 mg/kg)。(4) BLM+ALA: BLM (2.5 mg/kg)由OA和ALA (50μ.g/kg/day)。

2.3。组织病理学

的肺膨胀并固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林，和5 μ.m厚切片用苏木精伊红(HE)和马森三色(TM)染色。每张幻灯片的20个场被放大到400x。纤维化分级依据改良Ashcroft评分[15］．使用Image Pro-Plus®6.0软件(Media Cybernetics, Inc.， Rockville, MD, USA)对染色的胶原蛋白区域进行定量分析。

2.4。呼吸功能的评价

在第14天，将动物用氯胺酮（80mg / kg）和木嗪（10mg / kg）麻醉，位于平面外科手术台上并气喘吁吁地引入刚性型套管（2mm ID）。套管通过丝线固定在气管上并连接到机械呼吸机。使用机械呼吸机进行呼吸功能，用于小型动物（Flexivent，Scireq，Montréal，加拿大）[16］．

2．5．血流动力学分析和自主评估

采集呼吸力学数据后，仍在麻醉状态下，将聚乙烯导管(PE-50)插入右侧颈动脉，记录动脉血压(ABP) 10分钟( ）.模拟信号通过数据采集系统(win达克- at /CODAS, Dataq 143 Instruments Inc.， OH, USA)实现数字化。通过频谱分析评估心血管系统的交感迷走神经平衡[17，18］．实验结束时，采用肌注过量麻醉(氯胺酮240 mg/kg、氧拉嗪30 mg/kg)将动物安乐死，取肺。

2.6。统计分析

采用夏皮罗-威尔克检验正态分布。参数数据分析采用单因素或双因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey的多重比较检验。对于非正态分布的数据，采用Kruskal-Wallis检验，然后采用Dunn检验事后测试。数据之间的相关性通过Pearson相关性检验得到证实。采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析，表示为 ． 被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.阿拉曼丁可减轻肺纤维化的体重减轻

从第6天开始，与CO和ALA组相比，BLM组体重增加较少( ）.ALA治疗从第8天开始就有保护作用( ）.在第14天，PF大鼠相比，CO和ALA组（获得体重显著少 ）.然而，接受ALA治疗的动物与健康动物保持相似的体重( ，与BLM基;数字1(一)）.

3.2。Alamandine衰减肺纤维化的发展

肺实质是在CO和ALA组保存（ ）与BLM组相比( ）.ALA治疗有显著效果(图)1 (b))，以减轻纤维化( ； ； ）.此外，CO和ALA组的胶原沉积仅限于血管和气道周围区域。不出所料，BLM组有大量肺间质胶原沉积( vs. CO和ALA)。与BLM组相比，ALA处理显著减少了胶原沉积( ； ）.细胞和肺泡领域是组相似（图1 (b)）.肺组织学图像如图所示1 (c)．

３．３．阿拉曼定治疗肺纤维化可改善呼吸力学

有是BLM组在动态弹性（Edyn）显著增加（ ）与原产地证书( ）和阿拉巴马州( ）组（图2(一个)）.BLM+ALA组Edyn显著衰减( ）与BLM组相比( ； ；数字2(一个)）.

与预期一样，BLM组的动态顺应性较低( ）与CO（ ）和阿拉巴马州( ）团体。从BLM + ALA结果（ ）表明ALA对呼吸力学有保护作用( 对BLM; ；数字2 (b)）.此外，BLM组的呼吸动力阻力显著升高( 与公司; ；数字2 (c))，说明ALA在BLM+ALA组中的保护作用( ）以防止组织功能的丧失。

Ashcroft评分和肺弹性之间的相关性如图所示3.．BLM组与BLM+ALA组之间存在较强的正相关( ； ； ；数字3(一个))，可能是由于来自BLM组的数据( ； ； ；数字3 (b)）.观察BLM+ALA组中这些参数之间的相关性，有可能验证这种相关性是弱的( ； ； ；数字3 (c)）.

3．4．血流动力学分析

桌子1显示血流动力学参数无差异。ABP ( ）及心率( ）在不同组之间没有差异。光谱分析证实了这一结果，表明心脏自主神经系统的参与在不同组之间也没有差异。交感神经成分(LF)和副交感神经成分(HF)在绝对和归一化单位上相似。这些结果被LF/HF比值所证实。此外，通过符号分析表示对心脏的交感参与的0 V也表明各组间无显著差异。

4。讨论

我们首次证实了ALA在减弱PF和保存呼吸力学方面的保护作用。此外，给药BLM显著诱导体重减轻，ALA治疗可防止体重减轻。

根据美国胸科学会的建议，雄性大鼠气管内BLM诱导是最能模拟人类疾病的方法，也是最适合进行初步临床前试验的方法[19］．Kilic等人[20.结果表明，2.5 mg/kg的BLM在Wistar大鼠体内可引起与PF兼容的组织学改变。我们的研究也表明，该剂量足以研究抗纤维化物质的作用，而不会对动物造成致命损害。此外，George等人[21]描述了使用BLM PF动物模型进行抗纤维化治疗的研究也对COVID-19有益。即使在COVID-19康复的患者中，病毒消除并不排除进展性纤维化的发展。因此，我们的研究中获得的有希望的结果可能会鼓励SARS-CoV-2感染后预防纤维化治疗的研究。

我们的研究结果同意表示PF导致的降低体重[文献22]，健康的动物强烈指示[22］．虽然ALA治疗阻止了体重的损失，但较高的呼吸功能量消耗可能解释了BLM组的下降。这对人类也是如此，因为使用尼替尼布或吡非尼酮治疗通常会导致患者体重减轻[23]，导致预后不良[24］．

此外，ALA的抗纤维化作用已经在心血管系统中得到了描述[25]而且，最近，在肝脏中[26］．虽然有强烈的迹象表明ALA的保护作用，但在研究其在肺纤维化过程中的作用的文献中没有报道。到目前为止，只有研究表明ACE2和血管紧张素-(1-7)在PF中的保护作用[27covid-19 [8，28］．在本研究中，ALA减轻了肺纤维化程度和胶原沉积。已有文献证实，胶原蛋白是整体肺组织弹性的主要决定因素[29]，因此承诺使用功能能力[30.]以相同的比例作为纤维化的程度[31］．因此，如果ALA能够预防纤维化，那么也有可能通过改善呼吸力学发挥作用。

此外，我们的研究结果表明，纤维化程度与呼吸系统弹性呈正相关，而ALA治疗降低了这种相关性。众所周知，纤维化会增加肺的弹性反冲力，从而降低肺的顺应性。此外，过量ECM改变肺内通气/灌注比率，在休息时和用力时均可导致低氧血症[32］．因此，我们的结果表明，ALA治疗可能克服这些机械改变，并可能有效地减少IPF患者的呼吸工作。尽管文献中有关于RAS参与PF的证据[33]，这是第一项研究，它证明ALA在肺中的保护作用，延长了关于ACE2轴的潜力的知识[34］．从这个意义上说，我们的数据指出了使用ALA治疗不同病因的PF的可能性，主要是在涉及ACE2参与时。根据吴的建议[8]我们的研究结果表明，ACE2功能与ALA管理的补偿可能是有前途的替代方案，以治疗PF激发的严重呼吸损伤，如Covid-19所发现的[21，28］．

研究还表明，ALA对动脉血压(ABP)的调节有不同的影响，这取决于它在哪里使用和/或病理生理条件。当它被注射到自发性高血压大鼠的室旁核时，会导致ABP和交感神经参与的增加[35]，而皮下输注ALA可降低高血压[36］．Wang等人也证实了这一点[37与Wang等人在2019年的报告相似[37，我们的结果表明，ALA减轻了肺纤维化，但没有改变ABP，清楚地表明了ALA的作用的通用性，并证实了RAS的多向性。

5.结论

在未来，ALA可能是改善IPF患者生活质量的重要策略。这一组织学和功能研究支持了重要的进展，并可能鼓励进一步研究ALA在PF中的作用机制。

数据可用性

支持这项研究结果的实验数据包括在文章中。

利益冲突

所有作者宣称没有利益冲突。

致谢

这项工作是在大学的博士学位奖学金由Coordenação德Aperfeiçoamento德Pessoal德NIVEL高级（CAPES）（批准号88882.442836 / 2019-01）资助期间进行。我们感谢UFCSPA的病理实验室和实验生理学实验室的贡献。

参考

1. G. Raghu，B. Rochwerg，Y. Zhang等人，“一位官员ATS / ERS ​​/ JRS /阿拉特临床实践指南：治疗特发性肺纤维化的：2011年的临床实践指南的更新，”。美国呼吸和重症监护医学杂志，第192卷，第2期。2, pp. 3 - e19, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
2. S. Nava和F. Rubini，“终末期特发性肺纤维化通气患者的肺和胸壁力学”，胸腔第54卷第5期5、1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. B. D. Uhal, X. Li, C. C. Piasecki, M. Molina-Molina，“血管紧张素信号在肺纤维化中的作用，”国际生物化学与细胞生物学杂志，第44卷，第5期。3, pp. 465-468, 2013。视图:谷歌学术
4. 。E.蒙特斯，V. Ruiz的，M.切卡等人的“肾素是一种血管紧张素独立的促纤维化介体：在肺纤维化的作用，”欧洲呼吸杂志第39卷第3期1, pp. 141-148, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. M. Kreuter, D. J. Lederer, M. Molina-Molina等，“血管紧张素调节剂与特发性肺纤维化过程的关系”，胸部第一百五十六卷第一百五十六期4，第706-714页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学术
6. J.陈，赵L.，D Wang等人，“调节性T细胞在子痫前期的microRNA-210和Foxp3的免疫耐受和公司章程的贡献，”分子医学报告第19卷第2期2, pp. 1150-1158, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学术
7. A. Rathinasabapathy, A. J. Bryant, T. Suzuki等，“rhACE2疗法通过挽救血管重塑改善博莱霉素诱导的肺动脉高压，”前沿生理学，卷。9，不。271，第1-10页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
8. “ACE2功能的代偿对2019- ncov致急性肺损伤的临床治疗的可能”，吴宇宇，“ACE2功能的代偿对2019- ncov致急性肺损伤的临床治疗的可能”，Virologica中央研究院第35期3, pp. 256-258, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学术
9. R. Q. Lautner, D. C. Villela, R. a . Fraga-Silva等人，“alamandine的发现和特性:肾素-血管紧张素系统的新成分，”流通研究，第112卷，第112期。8, pp. 1104-1111, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术
10. F. P. de Souza-Neto, M. de Morais Silva, M. de Carvalho Santuchi等人，“Alamandine可减弱小鼠横向主动脉收缩引起的动脉重塑，”临床科学号，第133卷。5，第629-643页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学术
11. T. S. Sipriani, R. A. S. dos Santos和K. Rigatto，“肾素-血管紧张素系统:alamandine在特发性肺纤维化患者中减少，”心脏病学和心血管医学杂志，第4卷，第4期。3, pp. 210-215, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. R. Carrington, S. Jordan, S. C. Pitchford, and C. P. Page，“IPF研究中动物模型的使用”，肺药和治疗方法，第51卷，73-78页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
13. I. Barbayianni, I. Ninou, a . Tzouvelekis, and V. Aidinis，“博来霉素的再探讨:直接比较博来霉素气管内微喷给药和小鼠口咽滴入给药途径”，前沿的医学，第5卷，第5期。269页，1-6,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
14. 国家研究委员会,实验动物的护理和使用指南E. Edi，Ed。，国家院校，DC，2011年。
15. r。Hübner, W. Gitter, N. E. El Mokhtari等，“组织学样本中肺纤维化的标准化量化，”生物学技术，第44卷，第5期。4，页507-517,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
16. F. Rago, E. M. Melo, L. Kraemer等，“血管紧张素1-7在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的预防或治疗作用”，白细胞生物学杂志，卷。106，没有。3，pp。677-686,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. K. Rigatto, K. R. Casali, V. Shenoy, M. J. Katovich，和M. K. Raizada，“乙酰苯二胺改善肺动脉高压的自主调节”，欧洲药理学杂志，卷。713，没有。1-3，pp。89-93,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术
18. E. Quagliotto, K. R. Casali, P. Dal Lago, and A. A. r亚洲- filho，“在清醒的雄性大鼠中，后背内侧杏仁核中的神经肽调节中枢心血管反射反应”，巴西医学和生物研究杂志，卷。48，没有。2，pp。128-139,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
19. R. G. Jenkins, B. B. Moore, R. C. Chambers等人，“美国胸科学会官方研讨会报告:使用动物模型进行肺纤维化潜在疗法的临床前评估，”美国呼吸细胞与分子生物学杂志第56期5，页667-679,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术
20. T. Kilic, H. Parlakpinar, A. Polat等，“Molsidomine对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的保护和治疗作用，”炎症，第37卷，第2期4, pp. 1167-1178, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
21. P. M. George，A. U. Wells和R. G. Jenkins，“肺纤维化和Covid-19：抗灰度疗法的潜在作用”《柳叶刀呼吸医学》，卷。8，不。8，第807-815，2020。视图:出版商的网站|谷歌学术
22. J.王，C.方，S. Wang等人，“当归补血汤通过抑制转化生长因子改善大鼠博来霉素诱发的肺纤维化β1/Smad3/纤溶酶原激活物抑制剂-1信号通路中国中医杂志，第40卷，第5期。2, pp. 236-244, 2020。视图:谷歌学术
23. A. Perelas，J. Glennie，K.面包车Kerkhove的。等，“抗纤维化药物和疾病的严重程度的选择预测特发性肺纤维化的体重减轻，”肺药和治疗方法，卷。59，文章101839，2019。视图:出版商的网站|谷歌学术
24. Y. Nakatsuka, T. Handa, M. Kokosi等，“特发性肺纤维化患者体重减轻的临床意义”，呼吸，第96卷，第2期4, pp. 338-347, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
25. M. de Carvalho Santuchi, M. F. Dutra, J. P. Vago等，“血管紧张素-(1-7)和alamandine促进体外和体内巨噬细胞的抗炎反应，”炎症介质，卷。2019年，第2401081号，14页，2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术
26. 黄毓，李毓，A. Lou等，“Alamandine通过调节nox4依赖ROS诱导的自噬减轻肝纤维化，”临床科学第134期7，第853-869页，2020。视图:出版商的网站|谷歌学术
27. Wang L.， Wang Y.， Yang T.， Guo Y.， and T. Sun，“Angiotensin-converting enzyme 2 attention of bleomycin induced lung fibrosis in mice，”细胞生理学与生物化学第36卷第2期2, pp. 697-711, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
28. C. Annweiler, Z. Cao, W. Yingliang等，“反调节‘肾素-血管紧张素’系统为基础的候选药物治疗sars - cov -2感染患者的COVID-19疾病”，传染性疾病-药物靶点，第20卷，第19-20页，2020。视图:出版商的网站|谷歌学术
29. B. Suki和J. H. T. Bates，《肺组织力学作为一种涌现现象》，应用生理学杂志，卷。110，没有。4，第1111至1118年，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
30. R. M. Du Bois，D. Weycker，C.Albera等，“特发性肺纤维化患者的强迫致命能力：测试性能和最小的临床重要差异”美国呼吸和重症监护医学杂志，第184卷，第2期。12, pp. 1382-1389, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
31. K. L. Olukogbon, P. Thomas, R. Colasanti, B. Hope-Gill, E. M. Williams，“特发性肺纤维化的呼吸模式和呼吸困难:一项观察性研究”，呼吸道学第21卷第2期2, pp. 344-349, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
32. D. E. Amariei, N. Dodia, J. Deepak等人，“合并肺纤维化和肺气肿:肺功能检测和病理生理学的观点，”药物，第55卷，第55期第9页，580页，2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术
33. X.宇，张Y.，X。杨等人，“BuqiHuoxueTongluo公式的病理组织学和肺功能测试在博莱霉素诱发特发性肺纤维化的影响，”循证补充和替代医学，卷。2018年，文章编号8903021，13页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
34. 周峰，余涛，杜睿等，“中国武汉地区COVID-19住院成人患者的临床病程和死亡危险因素:回顾性队列研究”，《柳叶刀》，卷。395，没有。10229，第1054至62年，2020。视图:出版商的网站|谷歌学术
35. 沈玉华，陈晓荣，杨春贤，刘伯贤，李鹏，“室旁核注射Alamandine增加自发性高血压大鼠血压和交感神经激活”，肽， 2018, vol. 103, pp. 98-102。视图:出版商的网站|谷歌学术
36. R. N. Vuille二叔比勒，S.M。的Camargo，L. Emmenegger等人，“人的肠管腔ACE2和氨基酸转运蛋白表达增加了ACE抑制剂，”氨基酸，卷。47，没有。4，第693-705，2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
37. 王莉，刘超，陈昕，李鹏，“Alamandine可减轻高血压诱导的长期心肌纤维化，”分子医学报告第19卷第2期6、第4553-4560页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学术

版权

版权所有©2021 Renata Streck Fernandes等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。